HPLC和UPLC-MS/MS法測不同水體中四環(huán)素類抗生素殘留的比較研究

蔡鵬，盛天露，劉華，陳冠宜，易永，劉永林，王麗陽，陳剛

（1.江西省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證總院檢測認(rèn)證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330052；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌，330004；3.南昌醫(yī)學(xué)院，江西南昌，330004）

關(guān)鍵字：HPLC；UPLC-MS/MS；四環(huán)素；比較研究

0 引言

四環(huán)素類抗生素是一類有并四苯結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，代表藥物有土霉素（oxytetra-cycline，OTC）、四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素 （chlortetracycline，CTC）、多西環(huán)素 （doxycycline，DC）等［1］，當(dāng)前，主要用于治療革蘭陽性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌、支原體和立克次氏體等引起的感染［2］。由于缺乏完善的獸藥抗生素使用監(jiān)控系統(tǒng)，目前我國存在四環(huán)素濫用的情況。四環(huán)素類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢且容易蓄積，容易產(chǎn)生生物毒性，人體過量攝入還會(huì)引發(fā)潛在的“三致”（致癌、致畸、致突變）作用［3］。目前，四環(huán)素類抗生素的主要檢測方法有高效液相色譜法、微生物法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［4-7］等，由于微生物法只能測定四環(huán)素類抗生素的總量，因此，目前常用于檢測四環(huán)素類抗生素的方法主要為高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［8，9］。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、分析時(shí)間快、定性分析結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，而高效液相色譜法則具有成本低，分離能力強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究同時(shí)采用HPLC和UPLC-MS/MS法對不同水體進(jìn)行四環(huán)素類抗生素含量測定，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）中的儀器條件，從方法線性范圍、檢出限、精密度，加標(biāo)回收率等角度出發(fā)，比較兩法的異同點(diǎn)，以期為四環(huán)素在水中的快速測定提供新的檢測方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（Agilent，美國安捷倫科技公司），AX224ZH/E電子分析天平（美國奧豪斯儀器常州有限公司）；多功能振蕩器；多管離心機(jī)（北京儀器設(shè)備有限公司）；移液槍；1000mL容量瓶；UPLC-MS/MS-80050（島津企業(yè)管理〈中國〉有限公司）。

1.2 試劑與材料

乙腈，甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司）；草酸（優(yōu)級(jí)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙酸銨（色譜純，德國莫爾斯公司）；檸檬酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；十二水合磷酸氫二鈉，乙二胺四乙酸二鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，美國埃爾公司）；實(shí)驗(yàn)用水（超純色譜用水）；待測水體為南昌市青山湖區(qū)野外隨機(jī)獲取。HLB萃取小柱（上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）。

0.1mol/L NaH2PO4溶液：稱取14.20g NaH2PO4，用純水溶解，轉(zhuǎn)移于1000mL容量瓶中定容，搖勻備用。

0.1mol/L檸檬酸：稱取21.01g檸檬酸，用純水溶解，轉(zhuǎn)移于1000mL容量瓶中定容，搖勻備用。

Mcllvaine緩沖溶液：將1000mL 0.1mol/L檸檬酸溶液與 625mL 0.1mol/L NaH2PO4溶液混合，使pH值位于3.0～8.0。

0.01mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：稱取6.05g Na2EDTA溶解于1625mL前配Mcllvaine緩沖溶液中，混勻后，裝至容器中備用。

0.01mol/L草酸溶液：稱取1.26g草酸，用純水溶解，轉(zhuǎn)移于1000mL容量瓶中定容，搖勻備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

采用高效液相色譜法檢測時(shí)，取300mL左右水樣靜置后過濾，加入50mL 0.01mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，再通過200mg / 6mL HLB固相萃取小柱（固相萃取小柱預(yù)先用5mL甲醇、5mL水二次淋洗），樣品過完后，再加入5mL水淋洗，真空抽干。用2mL（20+80）甲醇水溶液溶解定容，過0.2um有機(jī)濾膜于2mL進(jìn)樣瓶，待測。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測時(shí)則取0.5mL水樣靜置后過濾并加入5mL 0.01mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液即可，其余凈化步驟與高效液相色譜法一致。

2.2 測定

2.2.1 高效液相色譜法

色譜柱：Welch XB-C18（250mm×4.6mm，5um），柱溫：30℃，進(jìn)樣量：50μL：檢測波長：350nm，流速1.0mL/min，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.01mol/ L草酸溶液，洗脫梯度見表1。

表1 WeIch XB-C18色譜柱洗脫梯度

2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

色譜柱：C18（2.1mm×150mm，5um），流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液-乙腈，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為5μL，洗脫梯度見表2。

表2 C18色譜柱洗脫梯度

表3 質(zhì)譜參數(shù)

質(zhì)譜條件：離子源模式：電噴霧離子源（ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測 （ MRM）；接口電壓：4 kV；霧化器：氮?dú)?L/min；干燥氣；氮?dú)?0L/min；加熱氣；空氣10L/min；DL管溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；接口溫度：300℃，MRM具體參數(shù)詳見表 3。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性方程

稱取適量的四環(huán)素、土霉素、金霉素及多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇定容，分別配制成濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、50mg/L混標(biāo)。按照高效液相色譜條件和方法進(jìn)行分析，同時(shí)配置濃度為20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L混標(biāo)，并按照高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件和方法進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，各四環(huán)素類目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到回歸方程，結(jié)果顯示兩種方法的線性關(guān)系良好，具體如表4及表5所示

表4 高效液相色譜法線性關(guān)系

表5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法線性關(guān)系

3.2 檢出限

配置本實(shí)驗(yàn)預(yù)估方法檢出限3～5倍濃度的樣品，平行測定 7 次，對其結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差值進(jìn)行計(jì)算，按公式MDL = t（ n-1，0.99）×S計(jì)算本方法的檢出限。本研究高效液相色譜法的方法檢出限結(jié)果如表6所示，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢出限結(jié)果如表7所示。

圖1 液相色譜圖

表6 高效液相色譜法的檢出限結(jié)果

表7 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限結(jié)果

表8 高效液相色譜法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

圖2 各化合物MRM譜圖

分別選擇適量的池塘水、自來水、生活污水，按照2.1的前處理方法處理，在2.2的色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示均未檢測出多西環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、金霉素。向3種水體樣品中分別添加10mg/L、20mg/L、50 mg/L 、20μg/L、100μg/L、500μg/L 6個(gè)濃度水平的土霉素、四環(huán)素、金霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中10mg/L、20mg/L、50 mg/L濃度的加標(biāo)樣品采用高效液相法測定，20μg/L、100μg/L、500μg/L濃度的加標(biāo)樣品采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定，重復(fù)6次并重新處理，高效液相法加標(biāo)樣品色譜圖如圖 1 所示，高效液相色譜-質(zhì)譜法加標(biāo)樣品色譜圖如圖 2所示，計(jì)算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示兩種方法的加標(biāo)回收率較高，詳見表 8和表9。

表9 高效液相色譜-質(zhì)譜法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 總結(jié)

前期通過查閱文獻(xiàn)，對目標(biāo)物的前處理方法和儀器條件進(jìn)行總結(jié)和參照，并對緩沖提取液濃度和體積、色譜條件選擇等因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了針對不同水體中四環(huán)素類殘留量測定的最佳條件。在此條件下比較HPLC法和UPLC-MS/MS法的異同點(diǎn)，結(jié)果顯示兩種方法皆符合相關(guān)的檢測方法要求，兩種方法的線性關(guān)系良好，且回收率均在85.0%～100.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.46% ～4.15%，目標(biāo)化合物在HPLC的檢出限均低于0.1mg/L，在UPLC-MS/MS中的檢出限均低于0.8μg/L。