近紅外光譜法快速鑒別偽品立普妥方法的研究

趙玉泉 韓吳琦 張 峰 李習(xí)瑩 謝曉燕

（開(kāi)封市食品藥品檢驗(yàn)所，開(kāi)封 475000）

阿托伐他汀鈣片是最常用的降脂藥物之一，以2017～2019年度天津某醫(yī)院數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為例，在降脂類(lèi)藥物中，立普妥用量連續(xù)3年呈逐年上升趨勢(shì)[1]。近年來(lái)，市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)屢次發(fā)現(xiàn)制售假冒立普妥的案例，嚴(yán)重?fù)p害了患者的利益，給藥品安全造成危害。目前，市場(chǎng)監(jiān)管定性判定真假藥品通常采用高效液相色譜法，存在預(yù)處理麻煩、使用大量的有機(jī)試劑、對(duì)環(huán)保不友好等問(wèn)題，大規(guī)模篩查偽品耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足藥品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求[2]。

近紅外技術(shù)是一種簡(jiǎn)便快速的綠色分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)業(yè)、食品以及醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[3-7]。近紅外光譜是物質(zhì)分子指紋圖譜，藥品光譜包含有效成分、輔料以及包裝等所有信息，是藥品檢驗(yàn)、藥物鑒定中一種有效手段，也用于檢測(cè)藥品中非法添加成分、原料污染或物料配比異常等情況。

本研究運(yùn)用藥品快檢車(chē)上的車(chē)載傅里葉近紅外光譜儀，采用一致性驗(yàn)證方法建立偽品立普妥鑒別模型，用于快速篩查出偽品立普妥，同時(shí)也能準(zhǔn)確區(qū)分不同廠家的阿托伐他汀鈣片，為解決阿托伐他汀鈣片質(zhì)量現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑

乙腈，四氫呋喃（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；枸櫞酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.2 試藥

阿托伐他汀鈣對(duì)照品（純度，94.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100590-201804）；收集市售阿托伐他汀鈣片樣品，共70批次，規(guī)格均為10 mg/片，疑似偽品立普妥2批（批號(hào)X47646，X88639），藥品來(lái)源詳細(xì)見(jiàn)表1。

表1 不同廠家阿托伐他汀鈣片

1.2 儀器與條件

1.2.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（e2695，Waters公司，美國(guó)），配DAD檢測(cè)器；分析天平（MS205DU，梅特勒-托利多，瑞士）；傅里葉變換近紅外光譜儀（MATRIX-F，布魯克公司，德國(guó)），配漫反射光纖探頭附件，光譜處理軟件OPUS 5.0。

1.2.2 儀器條件參數(shù)

（1）液相色譜儀：反相色譜柱C18(5 μm，4.6mm×150 mm, Thermo Syncronis)；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-0.05 mol·L-1枸櫞酸銨溶液（pH值為4.00，27∶20∶53）；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；進(jìn)樣體積均為10μL。

（2）近紅外光譜儀：波數(shù)范圍為4000 cm-1～12000 cm-1，漫反射測(cè)定，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為32次，環(huán)境溫度：20 ℃～25 ℃，空氣相對(duì)濕度：30%～35%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理-高效液相色譜檢測(cè)

取適量樣品，混合均勻，研細(xì)，精密稱(chēng)取（約相當(dāng)于阿托伐他汀鈣10 mg），置100 mL 量瓶中，加混合溶液：乙腈-0.05 mol·L-1枸櫞酸銨溶液（pH 值為7.40，1∶1），溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液備用；取阿托伐他汀鈣對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)重，加上述混合溶液定容至刻度，作為對(duì)照品溶液備用。

1.3.2 鑒別真?zhèn)瘟⑵胀?高效液相色譜法

疑似假冒立普妥樣品采用高效液相色譜法進(jìn)行初篩，參照阿托伐他汀鈣片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（YBH19122005-2014Z）[8]進(jìn)行鑒定。精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，以保留時(shí)間定性鑒定。

1.3.3 光譜采集方法

每批次樣品各取7片，用光纖探頭抵住藥片，按設(shè)定參數(shù)采集70批次樣品光譜，共得到490張樣品光 譜。

1.3.4 一致性檢驗(yàn)原理與評(píng)價(jià)方法

本研究采用一致性檢驗(yàn)的原理進(jìn)行樣品一致性判別，該原理通過(guò)計(jì)算參考樣品集光譜上每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的漫反射吸光度平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，并以此波長(zhǎng)點(diǎn)吸光度的平均值加或減一定倍數(shù)（CI值）的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為該波長(zhǎng)點(diǎn)的可信區(qū)間，以CI值作為一致性檢驗(yàn)的限度值；一致性檢驗(yàn)過(guò)程是將待測(cè)樣品光譜的吸光度值與參考光譜吸光度平均值的差值除以標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，得到該未知樣的一致性指數(shù)CI，即第i個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的CI值：

在譜段內(nèi)所有波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度總體上達(dá)到0.9999 概率下均不超限度，CI 值在Excel中的計(jì)算命令是TINV( ( 1～0. 9999 ^( 1 /a) ) ，( b-1) ) ，式中a是波長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)，b是參考光譜數(shù)量)[9]。

該待測(cè)樣CI與參考光譜集CI限度值進(jìn)行比較，判定待測(cè)樣光譜與參考光譜是否一致；如CI值≤CI限度值，則表示通過(guò)一致性檢驗(yàn)；如CI值＞CI限度值，則判定樣品不一致。不同波長(zhǎng)點(diǎn)CI值不同，一般取重要波長(zhǎng)范圍建立模型，也可以采用全光譜范圍來(lái)建模，以最大CI值（最大一致性指數(shù)max CI值）來(lái)進(jìn)行比較，判斷是否滿(mǎn)足上述條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜法鑒定真?zhèn)伟⑼蟹ニ♀}

圖1為阿托伐他汀鈣對(duì)照品、立普妥（批號(hào)8173）、2個(gè)疑似偽品立普妥以及其他廠家制劑優(yōu)力平的液相色譜圖。從圖中看出，阿托伐他汀鈣對(duì)照品和真品立普妥以及優(yōu)力平樣品中的有效成分色譜保留時(shí)間均在15.92 min附近，而偽品立普妥在該保留時(shí)間未出峰，依此確定兩個(gè)疑似樣品是偽立普妥。

圖1 阿托伐他汀鈣對(duì)照品和真?zhèn)瘟⑵胀讟悠芬合嗌V圖

2.2 近紅外光譜法快速鑒別真?zhèn)瘟⑵胀?/h3>

2.2.1 真?zhèn)瘟⑵胀椎慕t外光譜

圖2 為真、假樣品的近紅外光譜，從圖2可以看出，立普妥真品在4029 cm-1、4764 cm-1、5175 cm-1附近有強(qiáng)吸收峰，而偽品在5715 cm-1和6861 cm-1有兩個(gè)尖銳吸收峰，光譜差異較大，光譜特征明顯不同，因此可以通過(guò)圖譜比對(duì)直觀區(qū)別真、假立普妥。但是考慮到監(jiān)管一線使用人員識(shí)別近紅外光譜存在一定的困難，為了方便使用，提高方法的可靠性，本研究采用一致性原理建立了算法模型判定的方法。

圖2 真、偽品立普妥近紅外光譜圖

2.2.2 建立真?zhèn)瘟⑵胀椎慕t外光譜判別方法

（1）光譜預(yù)處理

由于近紅外光譜峰形較鈍、重疊嚴(yán)重，且含有目標(biāo)成分外其它成分的信息，例如輔料、光的散射、雜散光和噪聲等，這些因素導(dǎo)致光譜圖基線漂移，影響光譜的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對(duì)光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，能夠降低或者消除無(wú)關(guān)信息和噪聲對(duì)光譜的影響[10]。不同樣品在9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-1區(qū)域吸收峰有明顯區(qū)別，而且這3個(gè)譜段分別是CH、NH和OH的合頻和倍頻吸收，信息量豐富，所以建模時(shí)選取這3個(gè)波段。

本研究選擇一階導(dǎo)數(shù)（17點(diǎn)）結(jié)合矢量歸一化預(yù)處理方法，不同廠家阿托伐他汀鈣片（真品）光譜處理后如圖3所示，從圖中可以看出，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，不同樣品光譜基線基本重疊，光譜一致性較好。

圖3 不同廠家阿托伐他汀鈣片特征光譜（一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化）

（2）鑒別一致性驗(yàn)證模型建立與驗(yàn)證

將樣品光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)（17點(diǎn)）結(jié)合矢量歸一化預(yù)處理后，建立一致性模型。以15批次立普妥樣品共計(jì)105張光譜作為參考集，建立一致性驗(yàn)證模型，將其他4個(gè)廠家（55批次）阿托伐他汀鈣制劑樣品共計(jì)385張光譜作為驗(yàn)證集，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖4。建模選取9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-13個(gè)譜段，在分辨率為8 cm-1時(shí)共計(jì)512個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)，參考光譜為105張，根據(jù)1.3.4中計(jì)算公式得到CI值應(yīng)設(shè)定為5.6。從圖上可以看出其他4個(gè)廠家55批次樣品光譜的CI 值都大于5.6但小于30.7，差異明顯，分離效果良好。將2批次偽品立普妥共14張光譜作為未知樣，一致性結(jié)果見(jiàn)圖5，CI值遠(yuǎn)大于5.6，也遠(yuǎn)大于30.7，明顯異于參考光譜，模型判別該樣品為偽品立普妥，該結(jié)果與高效液相色譜判定的一致。

圖4 不同廠家阿托伐他汀鈣片模型驗(yàn)證結(jié)果橫坐標(biāo)為光譜數(shù)量，縱坐標(biāo)為最大CI 值

圖5 偽品立普妥判別結(jié)果橫坐標(biāo)為光譜數(shù)量，縱坐標(biāo)為最大CI 值2.2.4討論

2.2.3 討論

本研究建模針對(duì)的是特定廠家、特定規(guī)格的產(chǎn)品，進(jìn)一步研究可以收集更多不同廠家的各種規(guī)格的制劑，調(diào)整模型參數(shù)，優(yōu)化模型使其應(yīng)用范圍更廣。另外也可以嘗試建立近紅外光譜定量模型，用來(lái)快速測(cè)定阿托伐他汀鈣制劑的含量均勻度或溶出度項(xiàng)目。

3 結(jié)論

針對(duì)偽品立普妥包裝、藥片性狀上與真品無(wú)明顯差異，執(zhí)法人員難以從外觀上判斷真假的問(wèn)題，采用近紅外光譜法建立了真?zhèn)瘟⑵胀滓恢滦詸z驗(yàn)?zāi)Ｐ?，模型?duì)偽品立普妥鑒別的正確率為100%，對(duì)兩個(gè)偽品立普妥判別結(jié)果與液相色譜法一致，結(jié)果表明近紅外光譜法可以快速鑒別出偽品立普妥，且方法簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)成本低，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)無(wú)損檢測(cè)，大大提高藥品流通市場(chǎng)監(jiān)管工作時(shí)效性，為凈化藥品市場(chǎng)提供了有力的技術(shù)支撐。