去泛素化酶JOSD2通過調(diào)控DNA損傷修復影響非小細胞肺癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性

葛孚晶，劉湘寧，張鴻宇，袁 濤，朱 虹，楊 波，何俏軍

浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058

據(jù)統(tǒng)計，近年來亞洲新發(fā)肺癌患者逐年增加，我國肺癌發(fā)病率和病死率也呈逐年上升趨勢［1］。肺癌中80%～85%為NSCLC，其具有發(fā)病隱匿、早期癥狀不明顯的特點，確診時往往為中晚期，病死率居高不下，患者5 年存活率不到20%［2-4］。近年來，雖然針對NSCLC 的分子靶向藥物治療獲得一定進展，但仍有70%～80%的NSCLC 患者無法從中獲益。因此，迫切需要探究NSCLC進展的分子機制，尋找治療NSCLC新的靶點，從而開發(fā)行之有效的靶向治療策略。

泛素化修飾是一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾，在細胞的蛋白降解途徑中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5］。DUB 能夠特異性地移除底物蛋白上的泛素鏈，從而調(diào)控多種底物蛋白的降解過程。近年大量文獻報道，DUB 通過調(diào)控細胞內(nèi)多種信號通路，從而影響細胞周期和凋亡，并最終促進宮頸癌、黑色素瘤和前列腺癌等腫瘤的惡性進展［6-11］。因此，針對DUB展開研究有望發(fā)現(xiàn)治療NSCLC新的靶點，為NSCLC 治療提供新的思路。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的生物信息學分析，全面考察了NSCLC 中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的DUB，并分析其中分子機制，旨在為NSCLC的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

人NSCLC 細 胞 株P(guān)C-9 和NCI-H1299 購 自 中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；依托泊苷、多柔比星和奧拉帕尼為美國MedChemExpress公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM?、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；SRB、丙酮酸鈉、聚凝胺和JOSD2 抗體為美國Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；GADPH抗體為戴格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；γ-H2AX 抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；辣根過氧化合物酶標記二抗（兔抗與鼠抗）為杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；DAPI 為 美 國Dojindo Molecular Technologies 公 司產(chǎn)品；pCDH-JOSD2-HA 質(zhì)粒為山東維真生物科技有限公司產(chǎn)品；jetPRIME?為法國Polyplus 公司產(chǎn)品；si-JOSD2 為上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

細胞培養(yǎng)箱和生物安全柜為美國Thermo Electron 公司產(chǎn)品；普通倒置顯微鏡和熒光顯微鏡為德國Leica 公司產(chǎn)品；電泳及轉(zhuǎn)膜裝置為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；AI 600 成像儀為美國GE 公司產(chǎn)品；多功能酶標儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 NSCLC基因表達數(shù)據(jù)及臨床資料的收集

從基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus）下載NSCLC 轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)及臨床資料，篩選條件:①物種為人類；②疾病類型為NSCLC；③腫瘤原發(fā)位點為肺部；④數(shù)據(jù)形式為高通量測序或芯片數(shù)據(jù)；⑤數(shù)據(jù)類型為基因表達定量；⑥數(shù)據(jù)集樣本數(shù)100 例及以上；⑦其余篩選條件為默認或不選。下載各數(shù)據(jù)集的基因表達矩陣和分組信息，在R 4.2.1 軟件中利用相應的R 軟件包進一步處理。

1.3 篩選與NSCLC 患者預后相關(guān)的DUB 相關(guān)差異表達基因

首先，將不同數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)清洗，并根據(jù)樣本來源分為正常組織和NSCLC組織。然后使用R 軟件包factoMineR 2.8 和factoextra 1.0.7 進行主成分分析及可視化。接著，使用R 軟件包limma 3.42.2 進行數(shù)據(jù)比較并計算差異表達基因，篩選上調(diào)差異表達基因的標準為P＜0.05 且差異倍數(shù)大于 1，篩選下調(diào)差異表達基因的標準為P＜0.05且差異倍數(shù)為＞0～＜1。再將多個數(shù)據(jù)集中的差異表達基因與DUB 列表取交集篩選出DUB 相關(guān)差異表達基因，并使用R 軟件包ggplot2 3.4.2 對各數(shù)據(jù)集中的DUB 相關(guān)差異表達基因的表達水平進行可視化。最后，使用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）數(shù) 據(jù) 庫分析NSCLC 樣本中差異表達的DUB 表達量對患者總生存期的影響，篩選出與NSCLC 患者預后相關(guān)的DUB相關(guān)差異表達基因。

1.4 基因富集分析考察JOSD2 高表達患者信號通路的變化情況

將數(shù)據(jù)集NSCLC 樣本按照JOSD2表達量中位數(shù)分為JOSD2高表達組和低表達組，利用limma 分析篩選組間差異表達基因，并采用R 軟件包clusterProfiler 4.0 進行GO 與GSEA 富集分析。GO 富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組分三個層次。R軟件包org.Hs.eg.db 3.10.0用于ID 轉(zhuǎn)換。GSEA 分析參考基因集數(shù)據(jù)庫MSigDB（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）進行注釋。使用R 軟件包GSVA 1.48.0 進行GSVA 分析，并通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估JOSD2表達水平與DNA修復相關(guān)生物學功能的相關(guān)性。

1.5 細胞培養(yǎng)

PC-9 和NCI-H1299 細胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素 和100 μg/mL 鏈 霉 素 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%二氧化碳）中培養(yǎng)。待細胞生長至合適密度時進行傳代培養(yǎng)，經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化傳代，所有實驗細胞均傳代十代以內(nèi)。

1.6 轉(zhuǎn)染JOSD2過表達質(zhì)粒

待PC-9細胞長至適宜密度時開始轉(zhuǎn)染，按照jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑說明將Jet-Buffer、pCDHJOSD2-HA 質(zhì)粒和Jet-PRIME 共轉(zhuǎn)染至PC-9 細胞，轉(zhuǎn)染4～6 h 后更換成新鮮培養(yǎng)基，并按照實驗目的進行后續(xù)實驗操作。

1.7 構(gòu)建DNA損傷細胞模型

待PC-9 細胞長至適宜密度時，利用DNA 損傷誘導劑多柔比星和依托泊苷構(gòu)建DNA 損傷模型。利用梯度濃度的多柔比星（1、2 μmol/L）和梯度濃度的依托泊苷（100、200 μmol/L）處理細胞8 h，構(gòu)建長時間內(nèi)DNA 損傷修復模型。依據(jù)造模效果，選定200 μmol/L 濃度的依托泊苷分別處理細胞0、1、2、4、6、8 h，構(gòu)建時間梯度的DNA 損傷修復模型。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法考察JOSD2和DNA 損傷修復通路相關(guān)蛋白的表達水平

收集處理后的PC-9 或NCI-H1299 細胞，加入2.5×上樣緩沖液裂解細胞，后置于95 ℃金屬浴加熱變性30 min 制成樣本。樣本進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入γ-H2AX 一抗（1∶1000）、JOSD2 一抗（1∶1000）和內(nèi)參GAPDH 抗體稀釋液（1∶3000），4 ℃孵育過夜。1×PBST 漂洗三次后，加入對應屬性的二抗稀釋液（1∶5000）室溫孵育1 h，1×PBST 漂洗三次將ECL 顯影液按照1∶1 的比例配置，混合后均勻覆蓋于聚偏二氟乙烯膜表面，采用AI-600曝光儀進行曝光采集圖像。

1.9 免疫熒光法考察JOSD2細胞內(nèi)定位

生長至合適密度的細胞棄去培養(yǎng)液，加入適量的4%多聚甲醛固定以及含有0.1% Triton X-100的1×PBS 透化細胞后，使用含有4%牛血清白蛋白的1×PBS 封閉細胞，隨后使用JOSD2 熒光一抗（按1∶100用4%牛血清白蛋白的1×PBS進行稀釋）4 ℃孵育過夜。第二天棄去熒光一抗，用1×PBS 洗滌，并加入熒光二抗孵育液（按1∶100 稀釋），室溫孵育1 h。棄去熒光二抗，用1×PBS洗滌后加入抗褪色的DAPI 染色液（按1∶1000 稀釋），1×PBS 洗滌。加入適量體積的抗淬滅劑封片，置于風機下吹干后，用熒光顯微鏡拍照。

1.10 SRB染色考察細胞存活率

利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)進行RNA 干擾實驗，構(gòu)造陰性對照siRNA 和si-JOSD2 的NCI-H1299 細胞系。待NCI-H1299 細胞生長至合適密度時，分別以3.0×104個/孔 的 細 胞 密 度 接 種 于96 孔 板 中（100 μL/孔），于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，給予梯度濃度的 多 柔比星（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50 和6.25 nmol/L）和奧拉帕尼（50.00、25.00、12.50、6.25、3.13 和1.56 μmol/L）孵育72 h。孵育結(jié)束棄上清液，每孔加入100 μL 10%三氯乙酸溶液固定，棄培養(yǎng)液，用雙蒸水洗滌后烘干。每孔加入100 μL SRB染色液（用1%冰醋酸配置，每500 mL 加入1.5～2.0 g SRB 粉末），室溫放置20 min，用1%冰醋酸洗滌干凈后烘干。每孔加入100 μL Tris-base 堿溶液溶解結(jié)合到細胞內(nèi)的SRB 染色液，置于室溫搖床20 min 后，在波長為515 nm 下檢測吸光度，計算細胞存活率。實驗獨立重復三次，每次設(shè)置三個復孔。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用RStudio、Excel 軟件和Graphpad Prism 7軟件進行實驗數(shù)據(jù)的分析和繪圖。計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用雙側(cè)student’st檢驗分析兩組數(shù)據(jù)間的差異，采用one-way ANOVA 分析多組數(shù)據(jù)間的差異，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 JOSD2 在NSCLC 組織中高表達且與患者預后不良相關(guān)

經(jīng)初步篩選，五個獨立數(shù)據(jù)集GSE19188、GSE33532、GSE43458、GSE44077、GSE75037 納入考察。主成分分析結(jié)果顯示，不同隊列中NSCLC組織與癌旁正常組織的轉(zhuǎn)錄組主成分均存在顯著差異（圖1）。其中，DUB 家族中的JOSD2、USP5和PSMD14的表達量均顯著上調(diào)（P＜0.05，圖2、附圖1）。Kaplan-Meier Plotter 分析結(jié)果顯示，JOSD2表達水平與患者的總生存期和進展后生存期均顯著相關(guān)（P＜0.05），見圖3、附圖2。提示JOSD2表達水平高的NSCLC患者預后不良。

圖1 基因表達數(shù)據(jù)庫各數(shù)據(jù)集中NSCLC組織和正常組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果Figure 1 Principal component analysis results of transcriptome sequencing data of NSCLC tissue and normal tissue in Gene Expression Omnibus

圖2 各數(shù)據(jù)集中非小細胞肺癌組織共同高表達的DUB相關(guān)基因Figure 2 Cross analysis illustrating the overlap of DUB related genes with elevated expression in NSCLC patients within five independent cohorts

圖3 JOSD2、PSMD14 和USP5 對非小細胞肺癌患者預后影響的生存分析結(jié)果Figure 3 Effect of JOSD2， PSMD14 and USP5 on the prognosis of non-small cell lung carcinoma patients

2.2 JOSD2高表達NSCLC組織中DDR相關(guān)通路顯著激活

GO富集分析結(jié)果顯示，JOSD2高表達組樣本中蛋白泛素化調(diào)控、葡萄糖代謝過程等通路發(fā)生顯著富集（均P＜0.05），DNA 生物合成過程的正向調(diào)控、參與DNA修復的DNA合成等途徑也發(fā)生顯著富集（均P＜0.05），見圖4。GSEA 結(jié)果顯示，JOSD2表達量高的樣本中DNA修復、DNA損傷檢查點信號傳遞、DNA構(gòu)象改變和DNA雙鏈斷裂修復途徑發(fā)生顯著激活（均P＜0.05），見圖5。進一步行GSVA 和相關(guān)性分析結(jié)果顯示，JOSD2表達水平與DNA雙鏈斷裂修復、經(jīng)同源重組的雙鏈斷裂修復和經(jīng)非同源末端連接的雙鏈斷裂修復等途徑的激活呈顯著正相關(guān)（均P＜0.01，圖6）。上述結(jié)果提示，JOSD2高表達患者DDR 相關(guān)通路均激活，JOSD2可能通過調(diào)控DDR 途徑發(fā)揮促NSCLC作用。

圖4 JOSD2 高表達組差異基因的基因本體論富集分析結(jié)果Figure 4 Gene ontology enrichment analysis of differentially expressed genes in the JOSD2 high-expression group

圖5 JOSD2高表達組差異基因基因集富集分析結(jié)果Figure 5 Gene set enrichment analysis of differentially expressed genes in the JOSD2 high-expression group

圖6 JOSD2表達水平與DNA損傷反應相關(guān)通路激活程度的相關(guān)性分析結(jié)果Figure 6 Correlation analysis of JOSD2 expression levels and the activation status of DNA damage response related pathways

2.3 JOSD2 是DNA 雙鏈斷裂修復的潛在調(diào)節(jié)因子

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，在多柔比星和依托泊苷處理的情況下，相比對照組，過表達JOSD2的PC-9 細胞中γ-H2AX 的表達水平降低（圖7），提示JOSD2與DNA 損傷修復過程相關(guān)。

圖7 過表達JOSD2 對不同藥物誘導γ-H2AX 表達水平的蛋白電泳圖Figure 7 Western blotting analysis of γ-H2AX expression levels induced by different drugs in cells overexpressing JOSD2

2.4 DNA 損傷后JOSD2 入核并加快DDR過程

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，過表達JOSD2顯著加快了γ-H2AX 的下調(diào)（圖8）。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，200 μmol/L的依托泊苷處理2 h 后，JOSD2 在細胞核區(qū)域發(fā)生顯著富集（圖9）。提示JOSD2 在細胞DNA 損傷后入核并加快DDR過程。

圖8 過表達JOSD2加速γ-H2AX下調(diào)的蛋白電泳圖Figure 8 Western blotting analysis of γ-H2AX down-regulation rate in cells overexpressing JOSD2

2.5 si-JOSD2 顯著提高NSCLC 細胞對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，si-JOSD2 組細胞中JOSD2 的表達量顯著降低（圖10）。SRB 結(jié)果顯示，50 nmol/L 多柔比星處理72 h 的條件下，si-JOSD2組的存活率顯著低于對照組（P＜0.05），對照組和si-JOSD2 組多柔比星的IC50分別為（90.38±8.98）和（46.32±16.11）nmol/L（P＜0.05）；12.5 μmol/L奧拉帕尼處理72 h 的條件下，si-JOSD2 組的存活率顯著低于對照組（P＜0.05），對照組和si-JOSD2組奧拉帕尼的IC50分別為（22.58±1.75）和（13.26±4.14）nmol/L（P＜0.05），見圖11。提示si-JOSD2 可提高NSCLC 細胞對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性。

與二甲基亞砜處理后的細胞比較，200 μmol/L 的依托泊苷處理2 h 后，JOSD2 在細胞核區(qū)域發(fā)生顯著富集.標尺=100 μm.JOSD2:含約瑟芬結(jié)構(gòu)域2蛋白；DAPI:4'，6-二脒基-2-苯基吲哚.

圖11 敲低JOSD2 后在不同濃度多柔比星和奧拉帕尼作用下細胞存活曲線Figure 11 Cell survival curves under different concentrations of doxorubicin and olaparib after depletion of JOSD2

3 討 論

NSCLC 是世界上最為常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一，每年死亡人數(shù)超過6 萬人［12］。研究顯示，50%以上的NSCLC 患者存在致癌驅(qū)動突變，其中KRAS突變患者占比約25%，EGFR突變患者占比約15%，ALK 突變患者占比約7%［13］。靶向NSCLC 的驅(qū)動突變可以顯著改善相關(guān)患者的生存期，為NSCLC 的臨床治療提供了新的范式［14］。盡管隨著腫瘤標志物的不斷發(fā)現(xiàn)和靶向藥物的開發(fā)，NSCLC 患者的存活期顯著延長［15］，但對于缺乏明確致癌驅(qū)動的晚期NSCLC 患者，聯(lián)合化療仍然是主要的治療手段［16］。研究報道，盡管化療藥物改善了晚期NSCLC 患者的生活質(zhì)量，但中位生存期仍不足3 年。因此，亟須探究NSCLC 的全新靶點，以提高晚期NSCLC 患者化療敏感性，延長晚期NSCLC患者的總生存期。

泛素化修飾是一種物種間高度保守的翻譯后修飾類型，其主要依賴于泛素激活酶、泛素偶聯(lián)酶和泛素連接酶將泛素分子連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上［17］。據(jù)研究報道，多聚泛素化修飾與底物蛋白的降解途徑高度相關(guān)，經(jīng)多聚泛素化修飾的蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑降解［18］。DUB 能夠特異性地將底物蛋白上的泛素分子移除，從而逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)泛素化修飾的過程，維持細胞內(nèi)泛素化-去泛素化的平衡［19］。近年來，DUB 被廣泛報道參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和進展［20-21］。例如，USP14 通過結(jié)合并移除IDO1 上的多聚泛素鏈，從而抑制IDO1 的降解并促進色氨酸代謝，最終抑制T 淋巴細胞的活性并促進結(jié)腸癌的進展［20］。研究顯示，USP2 可調(diào)控E2F4 的穩(wěn)定性，促進腫瘤細胞的自噬和鋅穩(wěn)態(tài)，最終調(diào)控腫瘤的惡性進展［21］。因此，靶向DUB 是開發(fā)抗腫瘤藥物的潛在策略?；诖?，本研究考察了多個獨立NSCLC 隊列中均發(fā)生顯著失調(diào)的DUB。結(jié)果顯示，JOSD2、USP5和PSMD14的表達水平均顯著上調(diào)?；跀?shù)據(jù)庫進一步考察了JOSD2、USP5和PSMD14對NSCLC患者預后的影響，結(jié)果顯示JOSD2的表達水平與NSCLC 患者預后不良顯著相關(guān)，提示JOSD2參與NSCLC 的惡性進展。

盡管USP5和PSMD14在預后分析中顯示與患者預后無顯著相關(guān)性，本研究未納入考察，但兩者在NSCLC 和其他腫瘤中的作用有廣泛報道［22-24］。例如，USP5 被證實直接結(jié)合并介導細胞核Beclin 1 的去泛素化，從而穩(wěn)定Beclin 1 并促進p53 的特異性降解，在KRAS 突變驅(qū)動的肺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用［22］。此外，也有研究證實USP5 直接結(jié)合并移除程序性死亡蛋白-1 上的多聚泛素鏈，從而促進程序性死亡蛋白-1 穩(wěn)定和免疫療法的耐受性［23］。除此之外，PSMD14 也被證實通過調(diào)控E2F1 的去泛素化激活AKT 信號通路，并最終介導頭頸部鱗狀細胞癌的化學耐藥［24］。以上報道提示，盡管本研究中所使用的篩選方法具有較高的普適性，仍須對排除在外的潛在靶點進一步研究。

JOSD2 是馬查多-約瑟夫結(jié)構(gòu)域亞家族的成員之一，近年來不少研究報道其參與多種腫瘤的惡性進展［25-27］。例如，JOSD2 被鑒定為YAP/TAZ和CTNNB1 的去泛素化酶，能夠直接結(jié)合并移除YAP/TAZ和CTNNB1 上的多聚泛素鏈，從而提高YAP/TAZ和CTNNB1的穩(wěn)定性，促進肝細胞肝癌的惡性進展［25，27］。此外，JOSD2還被證實直接結(jié)合多種代謝酶，通過發(fā)揮去泛素化作用介導代謝酶的穩(wěn)定和累積，并最終促進NSCLC 細胞的糖酵解和惡性演進［26］。然而，JOSD2 在NSCLC中發(fā)揮促腫瘤作用的分子機制仍未完全闡明。為此，本研究依據(jù)JOSD2相對表達量將隊列中的樣本分組，并基于GO分析和GSEA分析探究發(fā)生顯著改變的信號通路。結(jié)果顯示，DDR 相關(guān)通路被富集且在JOSD2較高表達水平的組中顯著激活。

DDR 是細胞內(nèi)一種維持基因組穩(wěn)定性的復雜生物過程，其主要通過激活細胞周期檢查點和協(xié)調(diào)細胞代謝反應以修復受損的DNA。有研究報道，癌癥中多種參與編碼DDR 的基因發(fā)生突變，從而引起腫瘤細胞基因組不穩(wěn)定性，并最終介導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［28］。因此，靶向DDR 途徑，從而增加腫瘤細胞額外的復制應激和復制壓力，是抗腫瘤藥物開發(fā)過程中的重要思路［29］。近年來，多項研究報道，DUB 廣泛參與細胞中的DDR 過程［30-31］。例如，USP38 通過結(jié)合并移除HDAC1 上的K63 型多聚泛素鏈，從而促進了HDAC1 去乙?；钚裕⒆罱K導致腫瘤細胞中NHEJ 過程的激活和DNA 損傷劑的不敏感性［30］。USP17 通過移除Ku70 上的泛素鏈從而促進NHEJ，是PTEN缺失腫瘤細胞中發(fā)揮DDR的主要原因［31］。本研究基于GSVA 分析，計算了JOSD2表達水平與DDR 途徑的相關(guān)性。結(jié)果顯示，JOSD2的表達水平與DDR 途徑的激活程度呈顯著正相關(guān)。體外實驗進一步證實，細胞在發(fā)生DNA 損傷后JOSD2 的核定位顯著增加，且過表達JOSD2能促進DNA 修復過程。以上結(jié)果提示，JOSD2 可通過調(diào)控DDR 途徑發(fā)揮促NSCLC 進展的作用。

近年來，多種DNA 損傷類藥物體現(xiàn)了靶向DDR 途徑在腫瘤治療中的巨大價值［32］。奧拉帕尼是多腺苷二磷酸核糖聚合酶特異性抑制劑，其通過靶向DDR 過程抑制BRCA 突變腫瘤的惡性進展，被廣泛應用于BRCA 突變型乳腺癌、卵巢癌和急性白血病的臨床治療。多柔比星是一種強效的化療藥物，其主要通過誘導腫瘤細胞的DNA 損傷發(fā)揮抗腫瘤功能，被廣泛用于多種腫瘤的新輔助化療［33］。然而，多柔比星通過誘導氧化應激、細胞自噬和細胞凋亡產(chǎn)生嚴重的心臟毒副反應，極大限制了其在腫瘤治療中的臨床應用［34-35］。通過藥物聯(lián)用策略增強腫瘤細胞對DNA 損傷類藥物的敏感性是提高其抗腫瘤作用并降低其毒副反應的重要思路。本研究通過轉(zhuǎn)染技術(shù)和SRB 技術(shù)考察了敲低JOSD2對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性。結(jié)果顯示，敲除JOSD2能顯著降低多柔比星和奧拉帕尼在NSCLC 細胞系上的IC50，提示靶向JOSD2 是增強NSCLC 細胞系對DNA損傷類藥物敏感性的重要思路。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析和體外實驗證實，JOSD2 通過調(diào)控DDR 發(fā)揮促NSCLC作用，靶向JOSD2是提高NSCLC 化療敏感性的重要舉措，為NSCLC 的臨床治療提供了新的思路。但是，盡管本研究證實JOSD2顯著降低了DNA 損傷劑引起的γ-H2AX 上調(diào)，觀察到JOSD2 在DNA損傷劑的誘導下入核，但具體的分子機制仍未完全闡明。近年研究報道，DUB 通過介導組蛋白和DNA 修復相關(guān)蛋白的去泛素化調(diào)控DNA 損傷修復途徑［30-31］。因此，課題組后續(xù)將從JOSD2 直接結(jié)合的蛋白出發(fā)，通過體內(nèi)外實驗進一步考察JOSD2 經(jīng)由酶活發(fā)揮促DNA 損傷修復作用，探索JOSD2發(fā)揮作用的具體分子機制。

本文附圖見電子版。

志謝 研究得到浙江省重點研發(fā)計劃（2022C03077）支持

Acknowledgements The work was supported by the Key R&D Program of Zhejiang Province (2022C03077)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)