高抗氧化活性黑皮雞樅優(yōu)良菌株篩選

李春蘭，李佳歡，胡開輝，梁 鵬*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

黑皮雞樅（Hymenopellis raphanipes）是長根菇的商品名，又名長壽菇、露水雞樅、卵孢小奧德蘑、二孢擬奧德蘑，俗稱黑皮雞樅菌，是近年來食用菌工廠化栽培的熱門菌種之一。其在分類學(xué)上屬擔(dān)子門傘菌綱傘菌目膨瑚菌小奧德蘑屬[1]。由于黑皮雞樅菌香味馥郁，肉質(zhì)鮮嫩，含有豐富的氨基酸、維生素、多糖及礦物質(zhì)元素等多種營養(yǎng)成分，并有抗氧化[2]、保護(hù)肝臟[3-4]、調(diào)整腸道菌群[5]、抑制病原菌[6]等生物活性，具有極高的食藥用價(jià)值，受到眾多消費(fèi)者的喜愛。盧彩會等人測定黑皮雞樅水提物和醇提物的抗氧化活性，證實(shí)了2 種提取物對DPPH 自由基、羥自由基和ABTS 自由基均有較好的清除能力，對鐵離子的還原能力隨著添加量的增加而逐漸提高，且水提物比醇提物的抗氧化能力更強(qiáng)[2]；安曉雯等則通過比較分析黑皮雞樅、平菇、海鮮菇、白玉菇、香菇和金針菇等6種食用菌的營養(yǎng)成分、抗氧化活性等，得出黑皮雞樅的抗氧化能力最高[7]。因此，選育高抗氧化活力的菌株對于黑皮雞樅產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。目前，國內(nèi)外研究人員對黑皮雞樅的研究重點(diǎn)在其營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面，鮮見關(guān)于對不同黑皮雞樅菌株抗氧化活性的報(bào)道。本試驗(yàn)通過比較8 個(gè)黑皮雞樅菌株篩選出高抗氧化活性的優(yōu)良菌株，以期對黑皮雞樅的深加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試8 個(gè)黑皮雞樅菌株編號分別為HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8，全部由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA）：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 自然。115 ℃滅菌30 min，緩慢冷卻。

加富培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO4·7H2O 1 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO4·7H2O 1 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑和儀器

試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、ABTS、DPPH、無水乙醇、水楊酸、FeSO4·7H2O、無水碳酸鈉、過氧化氫等。

儀器：超凈工作臺、水浴鍋、酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)、電磁爐、制冰機(jī)、離心機(jī)、分析天平、高壓滅菌器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將4 ℃保藏的黑皮雞樅菌株接種于PDA 固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d左右；選取已活化好的試管菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用接種鉤挑取0.5 cm×0.5 cm 接種塊接種于加富培養(yǎng)基平皿中心，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后倒置培養(yǎng)。

1.2.2 液體菌種的制備

將200 mL 液體培養(yǎng)基裝入500 mL 搖瓶中，115 ℃滅菌30 min，冷卻備用。將已經(jīng)活化好的平皿刮去氣生菌絲，再使用8 mm 打孔器在距舊接種塊相同距離處進(jìn)行打孔，取25個(gè)接種塊于液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h，再放入25 ℃、150 r·min-1搖床中培養(yǎng)。第3天開始用磁力攪拌器攪拌20 min·d-1，培養(yǎng)5 d。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵

250 mL 搖瓶裝100 mL 液體培養(yǎng)基，115 ℃滅菌30 min，冷卻備用。液體菌種接種，接種量為5%，25 ℃、150 r·min-1搖床發(fā)酵6 d。培養(yǎng)完成后將發(fā)酵液進(jìn)行過濾，測定菌球濕重、干重，再將發(fā)酵液9 000 r·min-1離心15 min，測定還原糖、總酚等活性物質(zhì)含量及發(fā)酵液的抗氧化活性。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 菌絲生長性狀

觀察各菌株菌絲在加富培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，采用“十”字交叉法測定菌落半徑（R），用游標(biāo)卡尺測量生長長度，單位為mm；液體發(fā)酵，觀察菌球生長情況，發(fā)酵結(jié)束測定生物量。菌絲生長速度按以下公式計(jì)算。

1.3.2 還原糖含量測定

發(fā)酵液中還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[8]，稍作修改。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。取適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液0.5 mL，再加入0.75 mL DNS 試劑，混勻，沸水浴7 min 后立即放入冰水混合物中冷卻，然后定容至5 mL，于540 nm處測定吸光度（A）。

1.3.3 可溶性蛋白含量測定

發(fā)酵液中可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[9]，稍作修改。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。取適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液1 mL，加入5 mL Bradford 工作液，顯色10 min后在595 nm下測定吸光度（A）。

1.3.4 總酚含量測定

發(fā)酵液中總酚含量測定采用Folin-Ciocalten 法[10]，稍作修改。以沒食子酸（Gallic acid）為標(biāo)準(zhǔn)品。25μL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液加入96 孔板中，然后加入125 μL福林酚試劑，室溫下反應(yīng)10 min 后加入125 μL 飽和Na2CO3溶液，振蕩器上搖1 min，搖勻后室溫下放置反應(yīng)30 min，然后在765 nm下測定吸光度。

1.3.5 總黃酮含量測定

采用氯化鋁絡(luò)合分光光度法測定發(fā)酵液總黃酮含量[11]，稍作修改。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。取適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液50 μL 于96 孔板中，依次加入100 μL 的AlCl3和50μL醋酸-醋酸鈉緩沖液，搖勻40 ℃反應(yīng)15 min，于400 nm處測定吸光度。

1.3.6 ABTS自由基清除活性測定

參照Re R 等[12]測定ABTS 抗氧化能力方法并稍作修改。以VC作陽性對照。取250μL發(fā)酵液于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入75μL 稀釋的發(fā)酵液，再加入125 μL 的ABTS 工作液，緩慢搖勻，避光放置15 min，在734 nm下測定吸光度（As），同時(shí)取75μL 蒸餾水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），以無水乙醇代替ABTS 工作液測得稀釋液本底吸光度（Aj）。每個(gè)樣品做4個(gè)平行，取其平均值。

清除率計(jì)算公式為：

1.3.7 DPPH自由基清除活性測定

參照趙琳琳等[13]測定DPPH 清除自由基能力方法并稍作修改。以VC作陽性對照。取2.5 mL 發(fā)酵液于10 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入100μL 稀釋液，再加入100μL 的DPPH 溶液，室溫避光震蕩30 min，在517 nm 下測定吸光度（As），取100μL 水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），以無水乙醇代替DPPH 溶液測得稀釋液本底吸光度（Aj）。每個(gè)樣品做4個(gè)平行，取其平均值。按公式（2）計(jì)算清除率。

1.3.8 羥自由基清除活性測定

參照Liu Y 等[14]測定羥自由基清除能力時(shí)采用的水楊酸法并稍作修改。以VC做陽性對照。取250 μL發(fā)酵液于10 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入50μL 稀釋液，依次加入50μL 的FeSO4（現(xiàn)配現(xiàn)用）、50 μL 的水楊酸-乙醇溶液、50 μL 的H2O2，37 ℃反應(yīng)30 min，然后于510 nm 處測定吸光度（As）；取50 μL 水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），不加H2O2溶液為稀釋液本底吸光度（Aj）。每個(gè)樣品做4 個(gè)平行，取其平均值。按公式（2）計(jì)算清除率。

1.3.9 還原能力測定

參照Liu Q 等[15]測定還原能力方法并稍作修改。吸光值越大，還原力越強(qiáng)。取100μL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液于2 mL 離心管，依次加入250 μL 磷酸鈉緩沖液和250 μL 的K3Fe(CN)6，50 ℃水浴20 min，加入100 μL的TFA 終止反應(yīng)，4 000 r·min-1離心10 min。取上清100μL和去離子水混合，加入20μL的FeCl3室溫孵育15 min，于700 nm 下測定吸光度（A）。水代替發(fā)酵液作空白對照，以0.25 mg·mL-1的VC作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的菌絲形態(tài)特征比較

2.1.1 菌絲生長情況

由表1 可知，不同黑皮雞樅菌株在加富培養(yǎng)基上的菌絲長勢存在差異，其中HP1、HP6、HP7、HP8的菌絲長勢較強(qiáng)，菌絲粗壯濃密；HP2、HP3、HP4、HP5 長勢弱，菌絲纖細(xì)稀疏。同時(shí)不同黑皮雞樅菌的菌絲生長速度間差異明顯，其中以HP5 生長速度最快，達(dá)5.09 mm·d-1，與HP3、HP4 無顯著性差異，但是顯著快于其他菌株；其次是HP6、HP1，生長速度為4.80、4.60 mm·d-1；生長速度最慢的是HP8，為4.36 mm·d-1。

表1 不同黑皮雞樅菌株的菌絲生長情況

2.1.2 菌株液體發(fā)酵生物量

由表2 可知，不同黑皮雞樅菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)生物量存在差異，其中以HP6 的菌球干重最大，達(dá)1.308 8 g·(100 mL)-1，顯著高于其他菌株；其次是HP8、HP1，分別為0.848 0、0.827 1 g·(100 mL)-1，顯著高于剩余菌株；HP2 的生物量最低，菌球干重僅0.182 8 g·(100 mL)-1。

表2 不同黑皮雞樅菌株發(fā)酵生物量

2.2 不同菌株的營養(yǎng)成分比較

2.2.1 還原糖含量

由表3 可看出，黑皮雞樅菌株HP2、HP5 發(fā)酵液中還原糖含量最高，為56.71、54.62 mg·mL-1，顯著高于其他6 個(gè)菌株；其次是HP1，為50.29 mg·mL-1；其余菌株的還原糖含量均低于50.00 mg·mL-1。

表3 不同黑皮雞樅菌株發(fā)酵液的還原糖、可溶性蛋白含量

2.2.2 可溶性蛋白含量

由表3 可看出，黑皮雞樅菌株HP6 發(fā)酵液中可溶性蛋白含量最高，達(dá)47.44 μg·mL-1，顯著高于其他7個(gè)菌株；其次是HP3、HP8、HP1，分別為42.29、39.06、38.47μg·mL-1；其余菌株的可溶性蛋白含量均低于35.00μg·mL-1。

2.3 不同菌株的抗氧化活性比較

2.3.1 抗氧化活性物質(zhì)含量

2.3.1.1 總酚含量

總酚具有清除自由基、抗氧化的作用，其含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)。由表4 看出，黑皮雞樅菌株HP1 發(fā)酵液中總酚含量最高，達(dá)240.12 μg·mL-1，顯著高于其他7 個(gè)菌株；其余依次為HP2、HP6、HP7、HP3、HP5、HP8、HP4，分別是229.80、223.85、223.85、212.55、207.19、207.09、198.52μg·mL-1。

表4 不同黑皮雞樅菌株發(fā)酵液的總酚、總黃酮含量

2.3.1.2 總黃酮含量

黃酮是一種強(qiáng)抗氧化劑，可有效清除多種自由基，黃酮含量高說明其抗氧化能力強(qiáng)。由表4 可知，比較8個(gè)黑皮雞樅菌株的總黃酮含量發(fā)現(xiàn)，HP6的含量最高，達(dá)24.72μg·mL-1；其次是HP1，總黃酮含量為23.23μg·mL-1；最低的是HP4，含量僅為18.79μg·mL-1。

2.3.2 抗氧化活性分析

2.3.2.1 ABTS自由基清除能力

由表5可知，黑皮雞樅菌株發(fā)酵液對ABTS自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數(shù)下，菌株HP1 發(fā)酵液的清除率最高，為54.28%；其次是HP2、HP4 菌株，清除率為52.88%、52.73%；其余菌株的清除率均低于52%。

表5 不同黑皮雞樅菌株發(fā)酵液對氧化活性物質(zhì)的清除率 單位：%

2.3.2.2 DPPH自由基清除能力

由表5 可知，黑皮雞樅菌株發(fā)酵液對DPPH 自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數(shù)下，菌株HP1發(fā)酵液的清除率最高，為78.08%，明顯高于其他菌株；其次是HP7、HP2 菌株，清除率為75.81%、74.90%；其余菌株的清除率均低于74%。

2.3.2.3 羥自由基清除能力

由表5可知，黑皮雞樅菌株發(fā)酵液對羥自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數(shù)下，菌株HP2、HP3發(fā)酵液的清除率最高，分別為69.53%、68.10%，兩者略有差異，但差異不顯著；其次是HP1、HP5菌株，清除率為66.06%、65.80%；其余菌株的清除率均低于65%。

2.3.2.4 還原能力分析

由圖1 可知，黑皮雞樅菌株發(fā)酵液對鐵離子有一定的還原能力，其中菌株HP1 的吸光度最大，為0.598，顯著高于其他7 個(gè)菌株，還原力最強(qiáng)；其次是HP3、HP7，吸光度為0.560、0.555；其余菌株的吸光度均低于0.550。

圖1 不同黑皮雞樅菌株發(fā)酵液的還原能力

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，不同黑皮雞樅菌株的菌絲生長速度、菌球干重、抗氧化成分含量及抗氧化活性存在差異，這與張?jiān)揭皩Σ煌`芝誘變菌株抗氧化活性研究結(jié)果一致，誘變菌株A14、A19的DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力、ABTS 自由基清除能力顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性[16]；也與曲德輝篩選桑黃優(yōu)良菌株的研究結(jié)果一致，在7 個(gè)桑黃菌株中篩選出了1 株菌絲生長活力、發(fā)酵生物量、抗氧化能力均優(yōu)于其他6個(gè)菌株的優(yōu)良菌株SH1[17]。綜合不同菌株的菌絲生長速度、菌球干重、抗氧化成分及活性結(jié)果，HP1菌絲活力強(qiáng)，菌球干重大，為0.827 1 g·(100 mL)-1，還原糖含量為50.29 mg·mL-1，可溶性蛋白含量為38.47μg·mL-1；抗氧化物質(zhì)含量高，總酚、總黃酮含量為240.12、23.23 μg·mL-1，抗氧化能力最強(qiáng)，其稀釋液對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除率為54.28%、78.08%、66.06%，對鐵離子的還原能力最強(qiáng)，吸光度為0.598。研究結(jié)果表明黑皮雞樅HP1 菌株是8 株黑皮雞樅菌株中抗氧化能力最強(qiáng)的菌株，可用于后續(xù)黑皮雞樅抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)利用。