MOFs的制備及其載藥性能初步評價

葛健文,陳浩,楊可欣,朱倩鈺,曹高潔,徐青清,秦貴琳,牟伊,季鵬

(泰州學院 醫(yī)藥與化學化工學院,江蘇 泰州 225300)

金屬有機骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由有機配體與金屬離子通過配位作用形成的結(jié)晶性、多孔性固體材料,具有周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1-2]。Robson在1989年首次發(fā)現(xiàn)MOFs,在此之后研究人員對其開展了一系列研究,目前MOFs應用廣泛,包括藥物遞送、氣體分離和吸附、催化、傳感等多個領(lǐng)域。MOFs的合成需要仔細考慮幾個關(guān)鍵因素如pH值、溫度、溶劑和添加劑,因為它們主要影響連接劑的溶解度、擴散速率和連接劑去質(zhì)子化的程度[3]。因此,合成條件的改變會極大地影響金屬的配位性、反應速度以及產(chǎn)物質(zhì)量。常見的幾種MOFs的合成方法有水熱/溶劑熱合成法、微波輔助合成法、機械化學合成法和噴霧干燥合成法等[4]。

青蒿琥酯(Artesunate,AS)是青蒿素的半合成水溶性衍生物,它從傳統(tǒng)中藥青蒿中被提取,最初用于臨床治療瘧疾。AS表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性[5],但因其本身的生物利用度低,在臨床上受到一定的限制。與原始藥相比,可以攜帶藥物的藥物載體,在維持原本藥理活性的基礎(chǔ)上,不僅能降低或消除原始藥的毒副作用、改善藥物的傳遞效果,同時可以提高藥物的生物利用度。因此,研發(fā)一種生物相容性好、安全性高且可降解的藥物載體就顯得尤其重要。因為MOFs具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和過高的孔隙率,同時在裝載多種藥物方面有較高的利用性,所以選其作為藥物載體[6]。目前,含有二價鐵的MOFs比較少,從這方面考慮,選用二價鐵作為金屬中心,氨基對苯二甲酸作為有機配體,通過溶劑熱合成法制得MOFs。隨后將AS載入MOFs中,在單因素考察的基礎(chǔ)上,從而評價MOFs的載藥性能。最后將制得的AS@MOFs進行體外釋放實驗和溶血實驗,考察其是否具有pH響應性的降解特性和良好的生物相容性,從而評價MOFs載藥后的理化性質(zhì)。

1 材料

1.1 主要儀器

FA2004型電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司(中國上海);pHS-3C型pH計購自上海儀電科學儀器股份有限公司(中國上海);TDL-80-2B型臺式低速離心機購自上海安亭科學儀器廠(中國上海);DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司(中國上海);HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌浴購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司(中國鄭州);KQ-500DB型數(shù)控超聲儀購自昆山市超聲儀器有限公司(昆山);UV-1200型紫外-可見分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司(中國上海);RE3000A型旋蒸儀購自上海亞榮生化儀器廠(中國上海)。

1.2 主要藥品與試劑

N,N-二甲基甲酰胺(DMF,批號C12749151)購自上海麥克林生化科技有限公司;2-氨基對苯二甲酸(2-NH2-BDC,批號C12066283,純度98%)購自上海麥克林生化科技有限公司;乙酸亞鐵四水合物(Acetate tetrahydrate,批號C11956657,純度95%)購自上海麥克林生化科技有限公司;青蒿琥酯(AS,批號C10692323)購自上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO,批號20191228)購自上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇(Ethanol absolute,批號20201029)購自中國醫(yī)藥集團有限公司;PBS購自中國醫(yī)藥集團有限公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格,水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 MOFs的合成

采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑的溶劑熱合成法,同時在醋酸存在的條件下,使用氨基對苯二甲酸(NH2-BDC)就不會出現(xiàn)副產(chǎn)物,從而實現(xiàn)合成MOFs的目的。具體方法如下:取0.5 g FeAc2溶于5 mL水中得到溶液A,稱取0.45 g NH2-BDC溶于15 mL DMF中得到溶液B。用玻璃棒攪動溶液B的同時將溶液A緩緩滴入,隨后在100 ℃條件下反應1 h,反應完畢后將反應液冷卻至室溫,然后離心(3 500 r/min,30 min)除去上清液,用DMF洗2次。接著用無水乙醇渦旋充分洗滌2次并離心(3 500 r/min,15 min),最終得到MOFs。

2.2 AS@MOFs的合成

稱取適量的AS、MOFs分別加入20 mL無水乙醇中,然后將兩個溶液混合,將其用超聲充分混合。隨后,在室溫下繼續(xù)恒定攪拌一定時間,使AS與MOFs混合更加充分,然后將混合溶液放置于旋蒸儀進行旋蒸至無溶液。最后用無水乙醇洗滌產(chǎn)物3次,離心(3 500 r/min,15 min),得到產(chǎn)物AS@MOFs。

2.3 MOFs納米粒載藥性能評價

2.3.1 測定方法

準確稱量AS(10.0 mg)到容量瓶(10 mL)中,加入5%碳酸氫鈉溶液到標記處,搖勻,得到備用溶液(1 000 μg/mL)。然后,用2%NaOH-無水乙醇混合溶液稀釋至不同濃度(10,20,30,40,80,120和200 μg/mL),在60 ℃下水解30 min,冷卻形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的衍生物(λ=290 nm)。以2% NaOH-無水乙醇混合溶液為空白對照,采用紫外-可見分光光度計對不同樣品的吸光度進行測定。

將二甲基亞砜(DMSO)與乙醇混合制得30%乙醇-DMSO混合溶液并從混合液中取5.2 mL,精確稱量AS@MOFs 2.1 mg放于該混合液中,隨后在超聲的作用下使其充分溶解。溶解完全后使混合液在針式過濾器中通過孔徑為0.45 μm的微孔濾膜。再利用紫外可見分光光度計在290 nm波長處測定其吸光度,然后利用標準曲線求出AS的含量,最后計算AS@MOFs的載藥量。載藥量(%)=We/Wm×100%;式中We表示AS@MOFs復合物中AS的質(zhì)量,Wm表示稱取的AS@MOFs的總質(zhì)量。

2.3.2 結(jié)果與分析

2.3.2.1 AS標準曲線

為計算AS@MOFs中青蒿琥酯的載藥量,精準繪制青蒿琥酯標準曲線:y=0.003 2x-0.005,R2=0.999 1 (y:290 nm處的吸光度值;x:AS濃度)。如圖1所示,在5～200 μg/mL范圍內(nèi)青蒿琥酯溶液具有很好的線性關(guān)系。

圖1 青蒿琥酯標準曲線圖

2.3.2.2 MOFs的載藥影響因素

1)MOFs和AS比例的影響:將制備AS@MOFs的實驗條件固定,選用AS和MOFs質(zhì)量比分別為2∶2,3∶2,4∶2,5∶2,然后將制備好的AS@MOFs用紫外分光光度法,通過吸光度進行載藥量的測定,可得出AS和MOFs質(zhì)量比的改變對載藥量的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 AS和MOFs比例對載藥量的影響

從圖2可以看出,藥物載藥量先增大后降低,在AS與MOFs的質(zhì)量比為4∶2時,載藥量最大。在此之后,增加AS的比例并不能增加藥物的載藥量,這是由于MOFs的載藥量逐漸達到飽和的原因。

2)反應溫度的影響:將制備AS@MOFs的實驗條件固定,確定AS和MOFs質(zhì)量比為4∶2。在25,55,75 ℃時,對不同反應溫度下的載藥量進行了測定,結(jié)果如圖3所示。藥物載藥量先增大后降低,過高的反應溫度會使MOFs的載藥量下降,55 ℃時MOFs的載藥量最高。超聲會促進AS滲透進入MOFs孔道里,但是相關(guān)研究表示AS較優(yōu)水解溫度是83 ℃,所以過高溫度可能會使AS水解。

圖3 反應溫度對載藥量的影響

3)攪拌時間的影響:將制備MOFs@AS的實驗條件固定,確定AS和MOFs質(zhì)量比為4∶2,反應溫度為55 ℃。攪拌其間,分別在1,3,6,9,12 h時間點,吸取溶液并測其吸光度,查看載藥量的改變,結(jié)果如圖4所示。

圖4 攪拌時間對載藥量的影響

隨著載藥時間的增長,MOFs的載藥能力也隨之增加,載藥時間到達6 h時,載藥量最大,這說明載藥時間為6 h時,MOFs的載藥量已經(jīng)處于飽和狀態(tài),可能是由于經(jīng)過6 h的作用,藥物的吸附與解吸達到了平衡點,以致載藥量出現(xiàn)最大。但是時間到達12 h時,MOFs的載藥量明顯降低,可能是因為長時間浸泡導致MOFs表面吸附的AS脫落。

2.4 AS@MOFs的體外釋放行為

2.4.1 測定方法

以含20%乙醇、不同酸堿度為7.4,6.4和5.0的PBS為釋放介質(zhì)。將AS@MOFs置于相對分子質(zhì)量為14 000 Da的透析袋,然后將其浸入釋放介質(zhì)(10 mL)中,并在37.0 ℃的黑暗中以100 r/min的攪拌速率進行釋放試驗。以預定的間隔(0.5,1,2,4,6,8,14,24,48 h),取出等份試品(0.4 mL),然后在0.45 μm微孔濾膜濾過,同一時間補充相同體積的新鮮PBS。之后,濾液被30%乙醇-DMSO混合溶液稀釋到適當濃度,通過290 nm處的紫外-可見吸收光譜測定不同孵育時間的上清液中的AS。最后,計算藥物釋放量,并繪制與時間的關(guān)系函數(shù)。釋放量計算如下:釋放量(%)=釋放的AS量/負載的AS總量。

2.4.2 結(jié)果分析

AS@MOFs在不同pH值下的體外釋放:MOFs是一種具有pH響應性的骨架材料,在一定酸性條件下,MOFs結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,會導致孔道崩塌,然后釋放出包載的藥物。因此,為了探究在酸性環(huán)境下AS@MOFs中青蒿琥酯的釋放行為,對AS@MOFs的pH響應釋放行為進行測試。如圖5所示,該圖證明AS@MOFs中青蒿琥酯的釋放行為具有明顯的pH響應性。在pH值5.0,6.4和7.4環(huán)境下青蒿琥酯在前4 h釋放速率較快,4 h釋放量分別為57.70%,38.30%,24.47%,這是由于與金屬有機骨架作用力弱的青蒿琥酯脫落,并快速進入釋放介質(zhì)中的原因。在隨后的時間釋放曲線比較平緩,48 h后在pH值5.0和6.4環(huán)境下的釋放量分別達到79.44%,72.54%,而在pH值7.4環(huán)境下累計釋放量為51.26%,表明酸性條件下青蒿琥酯的釋放效果更明顯,這是因為MOFs孔道里的青蒿琥酯隨著時間的延長被釋放。由此可見AS@MOFs具有pH響應釋放的功能,能夠有針對性地釋放所包載的青蒿琥酯。

圖5 AS@MOFs在不同pH條件下體外釋放曲線

2.5 AS@MOFs的溶血實驗

2.5.1 測定方法

將新鮮鼠血通過生理鹽水洗滌,并以2%(體積分數(shù))的細胞密度重懸制得2%紅細胞懸液,然后將不同濃度(0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mg/mL)的AS@MOFs與紅細胞懸浮液混合,在37 ℃培養(yǎng)1 h。然后,將離心混合物(1 000 r/min,15 min)通過紫外可見分光光度計在540 nm處測定上清液的吸光度。此外,將生理鹽水和蒸餾水分別與紅細胞懸液在相同條件下一起孵育,用作陰性對照和陽性對照。溶血率計算如下:溶血率(%)=(As-An)/(Ap-An)×100%;在上式中,As是樣品的吸光度,Ap是陽性對照品的吸光度,An是陰性對照品的吸光度。根據(jù)國際性標準ISO 10993.4規(guī)定α%溶血率小于5%,則被認為是合格的。

2.5.2 結(jié)果分析

溶血實驗主要是以實驗制得的生物材料對紅細胞的作用,來評價該材料的溶血性能。本實驗中對裝載青蒿琥酯的MOFs溶血性進行初步評價。當AS@MOFs的質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL用紫外分光光度計檢測得到的溶血率均小于5%,符合溶血實驗要求,具體如表1所示。同時,肉眼觀察到質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL的溶液上清無色澄清,表明無溶血。因此,可以認為制備出來質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL的AS@MOFs的生物相容性良好,沒有明顯的溶血作用,可以用于靜脈注射。質(zhì)量濃度大于1 mg/mL的溶血率大于5%,說明其濃度較高導致紅細胞破裂。由于MOFs制備中用到了亞鐵離子,而亞鐵離子可以幫助人體血紅蛋白運輸氧氣,對人體有益,但是亞鐵離子容易氧化成三價鐵離子,會在一定程度上影響實驗的準確性。此外,MOFs的吸附能力強,會吸附溶液中的水分子等,當達到一定程度,MOFs的孔道會坍塌,釋放出AS,因此也會影響實驗。

3 討論

MOFs材料因具有優(yōu)異的孔道內(nèi)部結(jié)構(gòu),所以其具有優(yōu)良的物理化學性能[7]。本實驗采用溶劑熱合成法制得MILs系列的MOFs(二價鐵為金屬中心),由于合成MOFs的有機配體NH2-BDC在常溫常壓下不易溶于水,且在溶劑熱條件下其溶解度會增加,這樣更有利于反應的進行,為后續(xù)合成一種負載青蒿琥酯的MOFs材料AS@MOFs提供可行性。之后在MOFs與AS的比例、反應溫度、攪拌時間這三方面對MOFs載藥能力進行研究,發(fā)現(xiàn)當m(AS)∶m(MOFs)為2∶4、反應溫度為55 ℃、攪拌時間為6 h時MOFs呈現(xiàn)優(yōu)異的載藥性能。藥物釋放實驗得到的結(jié)果充分證明了AS@MOFs在體外釋放評價中具有良好的緩釋效果,并且在酸性環(huán)境中也具有響應行為。在酸性條件下AS@MOFs會緩慢釋放其包載的青蒿琥酯,48 h后在pH值5.0,6.4,7.4環(huán)境下的釋放量達到79.52%,68.39%,47.12%?？梢夾S@MOFs是一個很有前途的pH響應藥物傳遞系統(tǒng)。溶血實驗中AS@MOFs的質(zhì)量濃度為0.5,1.0 mg/mL用紫外分光光度計檢測溶血度均小于5%,且肉眼觀察上清無色澄清,因此可以認為制備出來濃度為0.5,1.0 mg/mL的AS@MOFs具有良好的生物相容性,沒有明顯的溶血作用,可以作為靜脈注射。

綜上所述,本研究成功制備出了MOFs材料,該材料具有良好的載藥性能和生物相容性。后續(xù)將繼續(xù)從動物水平入手,對材料的藥效學、藥動學等方面進行進一步探討。