沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱制備及在線檢測(cè)軟骨藻酸應(yīng)用

陳清愛(ài), 李 玨, 林旭聰, 3

(1. 福建商學(xué)院 旅游與休閑管理學(xué)院, 福建 福州 350012; 2. 福州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108;3. 福建省產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全檢測(cè)試劑與儀器工程技術(shù)研究中心, 福建 福州 350108)

在豐富的氨基酸、 不飽和脂肪酸等,因此在貝類毒素分析中需要對(duì)分析樣品進(jìn)行高效的預(yù)處理。在DA毒素的分析中,現(xiàn)有前處理技術(shù)主要包括快速、 簡(jiǎn)易、 廉價(jià)、 高效、 安全的樣品前處理技術(shù)QuEChERS[3]、 固相萃取[4]、 磁性固相萃取[5]等。整體柱型管內(nèi)固相微萃取(In-tube SPME)技術(shù)[6]具有自動(dòng)化、 小型化和高通量等優(yōu)點(diǎn),作為一種新興的在線前處理技術(shù)得到了重視。Song等[7-8]合成了一種磁增強(qiáng)管內(nèi)微萃取整體柱,與高效液相色譜(HPLC)-紫外光譜(UV)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)鉛、有機(jī)錫等污染物的靈敏檢測(cè)。上述研究為In-tube SPME技術(shù)應(yīng)用于DA毒素污染物的在線富集和分析提供了良好支撐,然而普通的整體柱存在的比表面積小(18.4～4.36 m2/g)[9]、 作用位點(diǎn)少的問(wèn)題,導(dǎo)致整體柱對(duì)目標(biāo)物的吸附作用弱, 不利于DA在柱內(nèi)的在線富集。 為了解決這個(gè)問(wèn)題, 許多的功能材料可被用于改善色譜固定相的比表面。 其中, 金屬有機(jī)骨架(MOF)多孔結(jié)晶材料具有可調(diào)節(jié)的孔徑、 高度有序的骨架拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和較大的比表面積, 越來(lái)越多地被用于改善色譜固定相的性能[10]。 目前, MOF與整體柱的結(jié)合主要是通過(guò)將MOF顆粒摻入整體柱的預(yù)聚液中, 通過(guò)一鍋法將MOF顆粒嵌入整體聚合材料[11-12], 但是導(dǎo)致MOF在整體柱中分布不均勻、 MOF被嚴(yán)重包埋等缺陷[13]。迄今, 在整體柱內(nèi)原位生長(zhǎng)MOF的報(bào)道甚少,基于MOF修飾的整體柱對(duì)DA進(jìn)行高效在線富集研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

沸石咪唑酯骨架ZIF-8具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、 比表面積大的優(yōu)點(diǎn)[14],可以極大地改善整體柱聚合相表面吸附性能,并且ZIF-8結(jié)構(gòu)中豐富的Zn2+離子可以與DA毒素中羧基(—COOH)和仲氨基(—NH—)發(fā)生有效的配位作用而實(shí)現(xiàn)高效吸附[15]。本文基于整體柱柱后衍生引入咪唑基團(tuán)、 ZIF-8原位生長(zhǎng)技術(shù)[16], 在多面體低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共聚物表面包覆ZIF-8, 制備ZIF-8修飾整體柱, 并以此構(gòu)建一種基于ZIF-8高比表面吸附和Zn2+配位作用的DA毒素在線In-tube SPME新技術(shù),發(fā)揮MOF表面吸附和金屬配位作用的協(xié)同應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)DA在ZIF-8功能化整體柱上的高效在線富集。本文中對(duì)整體柱結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征,考察整體柱的選擇性,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件對(duì)DA富集的影響,結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)技術(shù)(HPLC-PDA),實(shí)現(xiàn)貝類產(chǎn)品中DA的在線管內(nèi)微萃取和靈敏分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 試劑

甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)[純度97%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)]、 多面體低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)(純度98%)、 γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(γ-MAPS)(純度98%)、 環(huán)己醇、 十二醇(純度98%)均購(gòu)自默克Sigma Aldrich公司; 偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純)、 六水合硝酸鋅(純度95%)、 2-甲基咪唑、 1-(3-氨基丙基)咪唑(純度99%)均購(gòu)自Aladdin公司; 軟骨藻酸(純度98%)購(gòu)自Across公司; 所用二次水均為科爾頓超純水系統(tǒng)處理水。

1.1.2 儀器設(shè)備

EasySep-1020LC型液相色譜泵, 美國(guó)通微技術(shù)股份有限公司; PHS-3C型精密酸度計(jì), 上海大普儀器有限公司; DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; LC-20A型高效液相色譜儀,日本島津公司; XL30型掃描電子顯微鏡, 賽默飛世爾科技有限公司; Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀, 美國(guó)Nicolet公司; D8 ADVANCE A25型X射線衍射儀,德國(guó)布魯克公司。

1.2 整體柱制備和在線富集檢測(cè)

ZIF-8修飾整體柱的制備過(guò)程及對(duì)DA的在線富集檢測(cè)流程如圖1所示。

1.2.1 整體柱基質(zhì)的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.5%、 12.5%的GMA單體、 POSS-MA單體溶解于由質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30%、 40%的環(huán)己醇、 十二醇混合而成的溶劑中,混合均勻,加入單體和致孔劑總質(zhì)量1%的引發(fā)劑AIBN,將所得的混合液渦旋混勻、 脫氣,配成聚合液。將預(yù)聚液使用容積1 mL注射器緩緩注入烯基衍生的石英毛細(xì)管中,密封兩端,平放置于60 ℃水浴中聚合反應(yīng)20 h,制得整體柱基質(zhì)。使用液相色譜泵通入甲醇,洗去前體、 致孔劑以及低聚物殘留,備用。

1.2.2 ZIF-8修飾整體柱的制備

將1-(3-氨基丙基)咪唑的濃度為1 mol/L的甲醇溶液注入20 μL定量環(huán)中,體積流量為1 μL/min,通過(guò)液相色譜泵將1-(3-氨基丙基)咪唑的甲醇溶液推入裝有整體柱基質(zhì)的石英毛細(xì)管中,直到pH試紙變藍(lán)后繼續(xù)通10 min。將兩端密封,置于65 ℃水浴反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后采用液相色譜泵通入甲醇將1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整體柱清洗至流出液呈中性,保存。

(a)ZIF-8修飾整體柱的制備

(b)在線管內(nèi)富集-高效液相色譜(HPLC)分析流程

將硝酸鋅的濃度為20 mmol/L的甲醇溶液注入定量環(huán)中,以6.5 mPa的壓力將溶液推入1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整體柱中反應(yīng)30 min;將濃度為20 mmol/L的2-甲基咪唑通入Zn2+衍生的整體柱,反應(yīng)形成ZIF-8,完成一次生長(zhǎng)。將整體柱清洗5 min后循環(huán)重復(fù)若干次上述反應(yīng),在整體柱內(nèi)原位生長(zhǎng)ZIF-8。

1.2.3 在線富集檢測(cè)方法

ZIF-8修飾整體柱對(duì)DA的在線富集檢測(cè)過(guò)程包括柱上富集吸附、洗脫和檢測(cè)。

1)柱上富集吸附。 將含有DA的樣品注射入2 mL樣品環(huán), 采用計(jì)量泵將定量環(huán)中樣品溶液注入所制備的ZIF-8修飾整體柱中, 進(jìn)行In-tube SPME富集。

2)洗脫。向整體柱內(nèi)繼續(xù)通入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液,清洗背景物質(zhì)和未結(jié)合的DA分子;切換流動(dòng)相,選擇濃度為10 mmol/L、 pH為6.5的磷酸鹽緩沖液為洗脫液[15], 通入整體柱中, 洗脫DA, 所得洗脫液通入HPLC系統(tǒng)六通閥的采樣管, 收集洗脫液20 μL。

3)HPLC檢測(cè)。切換六通閥到注射狀態(tài),使樣品注入HPLC中進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件如下:色譜柱為C18色譜柱(填料粒徑為5 μm,內(nèi)徑為4.6 mm,長(zhǎng)度為250 mm), 流動(dòng)相為乙酸與乙腈體積比為83∶17的水溶液, 測(cè)定波長(zhǎng)為242 nm,體積流量為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為20 μL。

1.2.4 貝類樣品的準(zhǔn)備

取新鮮的花蛤、 貽貝貝肉,剪碎后勻質(zhì)。稱取1.00 g勻漿貝肉樣品放置于容積10 mL離心管內(nèi),加入2 mL提取液(甲醇與水的體積比為4∶6),渦旋混勻 2 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心分離5 min,取上清液。殘?jiān)捎? mL提取液重復(fù)提取2次,合并上清液,混勻,離心分離;上清液用 0.22 μm濾膜過(guò)濾,置于4 ℃避光環(huán)境保存。

加標(biāo)樣品: 取1.00 g勻漿貝肉品樣置于離心管中,加入不同質(zhì)量的DA,振蕩混勻。后續(xù)提取、 離心、 過(guò)濾等操作同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱制備與表征

2.1.1 結(jié)構(gòu)表征

聚合單體中GMA和POSS-MA用量、致孔劑中環(huán)己醇和十二醇的比例對(duì)整體柱基質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響如表1所示。結(jié)果表明,隨著POSS-MA用量的增加,ZIF-8修飾整體柱滲透性減弱,整體柱結(jié)構(gòu)變得致密;隨著致孔劑中十二醇用量的增加,整體柱滲透性增強(qiáng)。配方3所制備的整體柱滲透性適中,因此應(yīng)用于后續(xù)研究。圖2為制備的ZIF-8修飾整體柱的SEM圖像。由圖可以看出,整體柱柱內(nèi)填料與柱壁結(jié)合緊密,整體聚合結(jié)構(gòu)較為均勻、 通透。

2.1.2 紅外光譜和物相表征

圖3為整體柱基質(zhì)、 ZIF-8、 ZIF-8修飾整體柱的紅外光譜和X射線衍射(XRD)譜圖。由圖3(a)的紅外光譜可以看出,相比于整體柱基質(zhì),ZIF-8修飾整體柱在波數(shù)421 cm-1處出現(xiàn)了明顯的Zn—N鍵的吸收峰以及位于波數(shù)1 153、 1 572 cm-1的咪唑基團(tuán)的吸收峰,這些譜峰與ZIF-8的特征峰一致,表明ZIF-8在整體柱表面進(jìn)行有效修飾。

表1 整體柱基質(zhì)的配方及滲透性

圖2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱的掃描電子顯微鏡圖像

(a)紅外光譜(b)XRD譜圖圖3 整體柱基質(zhì)、 沸石咪唑酯骨架ZIF-8、 ZIF-8修飾整體柱的紅外光譜和X射線衍射(XRD)譜圖

由圖3(b)的 XRD譜圖可看出,在ZIF-8修飾整體柱中,位于衍射角2θ為7.3°、 10.36°、 12.72°、 14.72°、 16.5°、 18.039°、 22.16°、 24.52°、 24.72°等處的衍射峰對(duì)應(yīng)于ZIF-8的(011)、 (002)、 (112)、 (022)、 (013)、 (222)、 (114)、 (233)、 (134)等晶面的衍射峰,表明ZIF-8在整體柱聚合相中成功合成。

2.1.3 比表面積表征

整體柱基質(zhì)、 ZIF-8修飾整體柱的氮?dú)馕?脫附曲線如圖4所示。由圖可見(jiàn),ZIF-8修飾整體柱聚合相的基于靜態(tài)氮?dú)舛鄬游降谋缺砻娣e大幅度增加。整體柱基質(zhì)的比表面積為25.16 m2/g,整體柱基質(zhì)表面原位修飾ZIF-8之后,比表面積大幅增長(zhǎng)到了230.92 m2/g。整體柱表面被ZIF-8修飾后比表面積的大幅增加,并引入了更多的結(jié)合位點(diǎn),可以有效提高整體柱的吸附性能。

2.2 性能

2.2.1 pH的影響

ZIF-8與DA的結(jié)合是通過(guò)Zn2+與DA分子中的羧基發(fā)生螯合作用產(chǎn)生的。DA分子中存在著3個(gè)羧基和1個(gè)仲氨基,羧基的解離常數(shù)pKa分別為2.10、3.72、 4.97,DA在溶液中的存在形態(tài)受溶液pH影響較大,導(dǎo)致DA分子中的羧基質(zhì)子化,與Zn2+的螯合效率受到影響。

圖4 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱和整體柱基質(zhì)的氮?dú)馕?脫附曲線

pH對(duì)ZIF-8修飾整體柱在線富集DA效率的影響如圖5所示。可以看出,隨著pH由6.0增大到7.0,ZIF-8修飾整體柱在線富集DA的效率逐漸提高,其原因是,隨著pH增大,DA分子中羧基的解離程度逐漸增大,而ZIF-8上的Zn2+正電性受影響較小,DA分子中的負(fù)電荷羧基與Zn2+結(jié)合程度增大。隨著pH由7.0增大到8.0,整體柱在線富集DA的效率顯著下降,主要原因是ZIF-8上的Zn2+結(jié)合OH-,使得整體柱表面的正電性降低,Zn2+與DA分子中羧基結(jié)合效率降低,整體柱對(duì)DA的回收率隨之下降。

圖5 pH對(duì)沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集軟骨藻酸效率的影響

2.2.2 流動(dòng)相流量的影響

流動(dòng)相流量對(duì)ZIF-8修飾整體柱在線富集DA性能的影響如圖6所示。通過(guò)在定量環(huán)前并聯(lián)反壓閥,調(diào)整柱前壓力為0.5～7.5 mPa,從而調(diào)節(jié)流動(dòng)相的流量。隨著流動(dòng)相流量的變化,整體柱對(duì)DA的回收率保持在92.4%～95.7%,流動(dòng)相流量的變化未對(duì)整體柱在線吸附DA的效率產(chǎn)生明顯影響。

圖6 流動(dòng)相流量對(duì)沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集軟骨藻酸效率的影響

2.2.3 共存金屬離子和氨基酸的影響

以色氨酸和金屬離子(K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+)為干擾物,將DA和干擾物按質(zhì)量比為1∶100混合,對(duì)DA進(jìn)行富集洗脫,考察DA回收率來(lái)衡量ZIF-8修飾整體柱對(duì)DA吸附性能的影響,結(jié)果如圖7所示。從色氨酸和金屬離子作為干擾物時(shí)的洗脫液色譜圖可以看出,兩者中均出現(xiàn)了明顯的DA的色譜峰,回收率分別為無(wú)干擾物情況下的(93.4±1.5)%和(91.2±1.3)%(重復(fù)3次)。由于DA分子中有3個(gè)pKa不同的羧基,相比氨基酸,DA與Zn2+有更強(qiáng)的結(jié)合能力,因此ZIF-8與DA結(jié)合能力比對(duì)高濃度色氨酸的強(qiáng)。貝肉樣品中常見(jiàn)的堿金屬和堿土金屬與DA中羧基作用弱,對(duì)ZIF-8上Zn2+結(jié)合DA的作用不產(chǎn)生干擾。

2.2.4 方法檢測(cè)限、 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

采用所制備的ZIF-8修飾整體柱, 對(duì)DA進(jìn)行100倍富集, 聯(lián)用HPLC-PDA, 對(duì)DA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定, 方法的檢測(cè)限(LOD)(信噪比(S/N)為3)達(dá)到0.03 ng/mL, 定量限(LOQ)(S/N為10)為0.05 ng/mL。 鑒于貝類樣品提取液中存在較多的共存物質(zhì), 樣品處理過(guò)程中1.0 g貝肉采用4 mL提取液提取后進(jìn)行分析, 貝肉樣品中DA的檢測(cè)限分析結(jié)果如圖8所示。 可以看出, 貝類樣品中DA經(jīng)過(guò)100倍富集后的檢測(cè)限 (S/N=3)為0.3 μg/kg,方法靈敏。

所制備的ZIF-8修飾整體柱在線富集檢測(cè)DA的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性結(jié)果見(jiàn)表2。 ZIF-8修飾整體柱對(duì)DA在線富集檢測(cè)的日內(nèi)、 日間、 批次間的回收率均在92%以上,3次重復(fù)測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

(a)色氨酸(b)金屬離子(c)無(wú)干擾物圖7 色氨酸、 金屬離子為干擾物及無(wú)干擾物條件下軟骨藻酸(DA)萃取洗脫液色譜圖

圖8 貝肉樣品中軟骨藻酸(DA)的檢測(cè)限

分別為1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%, 表明整體柱具有良好的重現(xiàn)性。 進(jìn)一步考察ZIF-8修飾整體柱的穩(wěn)定性以及使用壽命, 對(duì)同一根整體柱進(jìn)行同上操作, 連續(xù)使用30 d后的回收率仍大于86%, ZIF-8鍵合整體柱具有良好的使用壽命。

2.3 在線檢測(cè)DA應(yīng)用

將花蛤和貽貝的貝肉樣品分別經(jīng)ZIF-8修飾整體柱富集、 洗脫, 聯(lián)用HPLC-PDA進(jìn)行DA檢測(cè)(簡(jiǎn)稱本文方法), 結(jié)果見(jiàn)表3。 由表可見(jiàn): 對(duì)于未加標(biāo)的空白樣品, 均沒(méi)有檢測(cè)到DA的色譜峰; 對(duì)不同濃度DA的加標(biāo)樣品, DA的檢出信號(hào)隨著DA濃度的增大而增大, 所制備的ZIF-8修飾整體柱聯(lián)用HPLC-PDA對(duì)樣品中的DA有較好的富集和檢出能力, 在加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.4～4.0 μg/kg時(shí), 方法回收率為(91.4±2.4)%～(94.5±1.0)%, 與采用C18填料萃取柱進(jìn)行固相萃取(SPE)前處理的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)方法相比, 兩者檢測(cè)結(jié)果基本一致, ZIF-8修飾整體柱聯(lián)用HPLC-PDA在線富集檢測(cè)貝肉樣品中DA的結(jié)果良好。

表2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修飾整體柱在線富集檢測(cè)軟骨藻酸的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

3 結(jié)論

基于整體柱柱后衍生引入咪唑基團(tuán)、 ZIF-8原位生長(zhǎng)技術(shù), 本文中制備了ZIF-8修飾整體柱, 聯(lián)用HPLC-PDA, 實(shí)現(xiàn)了DA的在線富集及靈敏分析。 結(jié)果表明, ZIF-8修飾整體柱的比表面積達(dá)到230.92 m2/g, DA分子中的羧基與ZIF-8表面的Zn2+發(fā)生配位作用, 對(duì)DA的在線吸附效果顯著,對(duì)DA標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)限為0.03 ng/mL, 對(duì)貝肉提取液的檢測(cè)限達(dá)到0.3 μg/kg, 對(duì)DA分析靈敏度高;

表3 貝類樣品中軟骨藻酸的回收率(重復(fù)3次)

對(duì)DA在線富集檢測(cè)的日內(nèi)、 日間、 批次間的回收率均在92%以上,3次重復(fù)檢測(cè)RSD分別為1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%,具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。應(yīng)用于花蛤和貽貝樣品分析,DA回收率分別達(dá)到了(92.4±2.5)%～(94.5±1.0)%、 (91.4±2.4)%～(92.6±1.5)%,結(jié)果良好,可為貝類產(chǎn)品中DA毒素在線高效富集和靈敏檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)。