棉類(lèi)紡織品文物霉變菌株的分離與鑒定

曾祥鶴

(開(kāi)封大學(xué)藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院,河南開(kāi)封 475000)

0 引 言

紡織品文物作為我國(guó)文化遺產(chǎn)的重要組成部分,是古代文明的載體之一,也是我國(guó)文化軟實(shí)力的重要代表。紡織品文物通常是由蠶絲、棉麻、葛布等天然材料織造而成,在掩埋、挖掘以及保存的過(guò)程中易受侵蝕細(xì)菌、軟腐真菌和腐生真菌等微生物的侵蝕和降解[1]。霉菌對(duì)紡織品的危害是持久的、多樣的,霉菌能夠?qū)⒑刑?、硫等營(yíng)養(yǎng)源的棉、毛和絲纖維分解為養(yǎng)分,促進(jìn)自身快速繁殖和生長(zhǎng);同時(shí)霉菌分泌有機(jī)酸和色素對(duì)文物造成酸蝕、顏色污染,甚至造成腐爛和降解等危害[2],并且霉菌具有頑強(qiáng)的生命力,有的能持續(xù)幾十年的休眠期。目前留存在世的紡織品文物服飾通常是從棺槨、土壤中發(fā)掘,有研究表明埋藏于地下的服飾類(lèi)文物微生物降解主要來(lái)自侵蝕細(xì)菌和軟腐真菌,在紡織品文物中至今已發(fā)現(xiàn)30余屬200多種霉菌[3-4];博物館中常見(jiàn)的霉菌有根霉菌、曲霉菌、球毛殼菌、青霉菌等,紡織品文物相較于瓷器文物、木質(zhì)文物、金屬文物等更容易受到腐蝕[5]。陶婭妃[6]對(duì)紡織物上霉變微生物進(jìn)行分離鑒定,共得到三種致霉菌,分別為曲霉屬、青霉屬和根霉屬。王毅婧[7]對(duì)真絲文物上的霉變微生物進(jìn)行分離鑒定,共得到三種致霉菌孢霉屬、曲霉屬和芽枝霉屬。紡織品文物又因其材質(zhì)、染料、顏料、性質(zhì)等因素,在館藏過(guò)程中易受外界環(huán)境影響[8]。因此,對(duì)紡織品文物上的真菌進(jìn)行分離鑒定,確定致霉優(yōu)勢(shì)菌屬,根據(jù)其生長(zhǎng)規(guī)律和生理生化特性,為紡織品文物開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效防霉技術(shù)靶標(biāo)菌株[9-10],對(duì)文物保護(hù)具有重要意義。目前對(duì)紡織品霉變菌株的研究多利用生物技術(shù)手段對(duì)霉變菌株進(jìn)行分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定以及生物學(xué)鑒定,從而確定致霉優(yōu)勢(shì)菌屬,為文物的清洗、修復(fù)、保存奠定理論基礎(chǔ)[11-12]。

本研究從已發(fā)生霉變的棉類(lèi)紡織品文物上的酶菌斑塊提取霉菌,利用PDA培養(yǎng)基分離純化,得到了單一的菌株,再采用顯微形態(tài)學(xué)觀察與18S rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法對(duì)霉變微生物進(jìn)行鑒定[13-16],確定致霉優(yōu)勢(shì)菌屬,為紡織品文物的博物館防霉保護(hù)工作以及抗霉材料的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 樣品和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1霉變織物 本次實(shí)驗(yàn)所采集的霉菌來(lái)自河南省開(kāi)封市汴繡私人博物館中一件表面明顯發(fā)生霉變的棉織物文物(圖1),據(jù)記載該文物屬于晚清年間,文物常年保存在室內(nèi)溫度23～25 ℃,相對(duì)濕度65%～70%之間的環(huán)境中。通過(guò)對(duì)織造組織以及毛邊顯微鏡觀察分析可知該文物是棉織物。霉菌附著在紡織品文物表面,成散落狀,服裝對(duì)襟領(lǐng)口處霉斑較為明顯,暫無(wú)侵蝕織物內(nèi)部結(jié)構(gòu)跡象。

圖1 霉變紡織品文物Fig.1 Mildewed textile relics

1.1.2試劑 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯切塊200 g,煮沸20～30 min,過(guò)濾,濾液加入葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L。液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基成分和配制方法相同,不加瓊脂。以上培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)高壓滅菌后使用。引物采用真菌通用引物(表1),由上海生物工程有限公司合成。Taq PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司;Agarose LE購(gòu)自河南東格生物技術(shù)有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái):蘇州蘇潔凈化設(shè)備股份有限公司;振蕩培養(yǎng)箱:上海智誠(chéng)科學(xué)儀器公司;可見(jiàn)分光光度計(jì):海精密科學(xué)儀器有限公司;滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;顯微鏡:Nikon;凝膠成像系統(tǒng):東勝有限公司。

1.2 方法

1.2.1霉變菌株采集、分離、純化 用無(wú)菌棉簽輕輕擦拭汴繡文物表面霉斑部位,輕輕涂在PDA培養(yǎng)基平板中,于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d形成菌落[17]。挑選菌落,在新的PDA培養(yǎng)基平板中劃線,繼續(xù)培養(yǎng)。5～7 d后選擇菌落形態(tài)典型、分離效果明顯的平板,分別挑取單菌落邊緣的菌絲,轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng),經(jīng)此方法3次純化后獲得單菌落菌株。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定 利用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量純化后的菌落菌絲,在PDA培養(yǎng)基平板中間點(diǎn)植接種。于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d形成菌落,觀察菌落的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征,并拍照,按照《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)分離得到的霉菌進(jìn)行初步鑒定[18]。利用乳酸石炭酸染料對(duì)菌絲進(jìn)行染色,觀察顯微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.3霉菌DNA提取 取純化過(guò)的菌落或菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中,于28 ℃條件下于搖床震蕩培養(yǎng)3 d。收集1～2 mL菌液,離心棄上清。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)霉菌DNA進(jìn)行提取。

1.2.4分子生物學(xué)鑒定 擴(kuò)增真菌ITS序列,使用通用引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)體系以及條件如表2所示。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),觀察條帶形狀。同時(shí)委托上海生工公司對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析對(duì)比,使用Mega7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表2 PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

2 結(jié)果和討論

2.1 分離純化結(jié)果

通過(guò)分離純化獲得6株霉菌。依次編號(hào)為A、B、C、D、E、F(圖2)。

圖2 霉菌菌落形態(tài)與顯微形態(tài)(100×)Fig.2 Mold colony morphology and microscopic morphology (100×)

2.2 形態(tài)觀察結(jié)果

菌株A:生長(zhǎng)速度緩慢,28 ℃培養(yǎng)7 d菌落直徑約25～40 mm,菌落呈絨毛狀,初期呈白色,后變?yōu)榫G褐色,但邊緣呈白色,PDA培養(yǎng)基中未見(jiàn)菌絲,但在液體PDA培養(yǎng)基中有菌絲,且呈白色。反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌絲較長(zhǎng),分生孢子梗在頂端分枝產(chǎn)生小梗如帚狀,偶有單論生或不規(guī)則者,孢子多數(shù)呈雙胞,呈球形或卵圓形,壁光滑,分生孢子鏈?zhǔn)杷刹灰?guī)則。

菌株B:生長(zhǎng)速度比較緩慢,28 ℃培養(yǎng)7 d菌落直徑約25～30 mm菌落初期呈白色,后期呈綠色,邊緣為白色,未見(jiàn)菌絲。反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長(zhǎng),菌絲上有較多散落的孢子,大多數(shù)為單孢且易脫落,有些孢子聚團(tuán)形成孢囊,呈圓盤(pán)狀。分子孢子梗發(fā)生于基質(zhì),?；o湊,瓶梗呈柱狀。

菌株C:生長(zhǎng)速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約25～40 mm,菌落呈絨毛狀,初期呈白色,后期變?yōu)槟G色,中央凹陷,顏色較深;反面觀中央呈墨綠色,邊緣呈白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長(zhǎng),上面有較多散落的孢子,菌絲不易被乳酸石炭酸棉藍(lán)色染液染色,呈淡黃色,孢梗莖呈褐色,表面光滑,分生孢子呈圓形或橢圓形,灰褐色。

菌株D:生長(zhǎng)速度適中,28 ℃培養(yǎng)6 d菌落直徑達(dá)30～40 mm菌落呈菊花心樣結(jié)構(gòu),中央呈綠色,邊緣呈白色,帶有放射性溝紋。初期為黃色,中期變?yōu)辄S綠色,最后顏色變淡,反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲較短,分生孢子梗無(wú)橫隔,梗的定端形成球狀膨脹形成頂囊,上面附著許多分生孢子。

菌株E:生長(zhǎng)速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約40～50 mm,菌絲體較長(zhǎng)、呈白色,絨狀、纖細(xì)、具隔膜,中央凸起,呈輻射狀向周?chē)L(zhǎng)。背面觀中央呈紅色,其余為白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲分叉較多,孢子較小呈紡錘形,附著在菌絲上,菌核形狀多為球形,單生或叢生。

菌株F:生長(zhǎng)速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約60～80 mm,菌落呈絨毛狀,菌絲較長(zhǎng)呈灰白色,中央凸菌絲較少,呈墨綠色;反面觀,呈墨綠色,邊緣呈白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長(zhǎng)成簇,孢子梗較短,單生或叢生,大多不分枝,分生孢子較長(zhǎng)呈淡褐色附著在菌絲上,呈紡錘狀或倒棒狀,頂端呈喙?fàn)?成鏈生長(zhǎng)。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.11.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū),提取菌株基因組DNA按照上述條件對(duì)ITS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ITS基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500 bp到750 bp之間有特異性擴(kuò)增條帶,大小與預(yù)期值相符。

2.3.2測(cè)序結(jié)果 根據(jù)生工公司(上海)測(cè)序結(jié)果,將得到的基因序列與NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),選取數(shù)據(jù)庫(kù)中得分最高的序列作為參比對(duì)象,測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。菌株A和菌株B與青霉菌屬(Penicillium)霉菌同源性高達(dá)92%,但是菌株A和菌株B的18S rDNA-ITS序列有所差異,因此猜測(cè)菌株A和菌株B為同屬不同種,初步斷定為青霉菌屬;菌株C和菌株F與交鏈孢霉屬(Alternaria)霉菌同源性分別為99%和98%,但是菌株C和菌株F的18S rDNA-ITS序列有所差異,因此猜測(cè)菌株C和菌株F為同屬不同種,初步斷定為交鏈孢霉屬;而菌株D與曲霉屬(Aspergillus)霉菌同源性高達(dá)98%,初步斷定為曲霉屬;菌株E與鐮刀菌屬(Fusarium)霉菌的同源性高達(dá)100%,初步斷定為鐮刀菌屬。

表3 霉變微生物的18S rDNA-ITS序列分析Table 3 Sequence analysis of 18S rDNA-ITS in molds

在Mega7.0中構(gòu)建6種霉菌18S rDNA-ITS序列的統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的自展值均超過(guò)50,表明構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可信。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果,菌株A和菌株B與草酸青霉在一個(gè)分支,均為青霉屬;菌株C與鏈格孢霉在一個(gè)分支,均為交鏈孢霉屬;菌株D與米曲菌在一個(gè)分支,為曲霉屬;菌株E與赤霉菌在一個(gè)分支,為鐮刀菌屬;菌株F與交鏈孢霉在一個(gè)分支,為交鏈孢霉屬。通過(guò)以上分析得出,菌株A和菌株B為青霉屬,菌株C和菌株F為交鏈孢霉屬,而菌株D為曲霉屬,菌株E為鐮刀屬,但以上6種菌株無(wú)法確定到種。

2.4 討論

針對(duì)本研究鑒定出的霉菌種類(lèi)與其生存特征,對(duì)后期博物館貯藏棉類(lèi)紡織品文物提出以下建議:博物館在保存紡織品文物時(shí)應(yīng)注意環(huán)境衛(wèi)生,可選用防霉建筑材料,做到空氣凈化,文物入庫(kù)與出庫(kù)均需要經(jīng)過(guò)消毒處理,庫(kù)房還可通過(guò)熏蒸的方式進(jìn)行環(huán)境消毒;微生物適宜生存的溫度為25～37 ℃,相對(duì)濕度為80%～90%,因此博物館可通過(guò)控制環(huán)境溫度、濕度降低霉菌活性;博物館還可通過(guò)放置霉敵、滅霉凈、鄰位苯基苯酚鈉等防霉劑抑制霉菌的生命活動(dòng)。

目前國(guó)內(nèi)多家單位均進(jìn)行了博物館防霉、殺蟲(chóng)等技術(shù)研究,通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)量各類(lèi)試劑抑菌程度。然而各類(lèi)防霉劑是否對(duì)紡織品文物直接或間接產(chǎn)生損害還需進(jìn)一步的研究,單純的抑菌實(shí)驗(yàn)只能判斷藥劑是否抑菌,卻不一定能應(yīng)用于實(shí)際當(dāng)中。如植物提取精油雖能有效抑菌,但會(huì)影響紡織品面料表面色澤,給文物保護(hù)帶來(lái)不可逆轉(zhuǎn)的損害。肖雨嫣[19]等對(duì)霉變棉織物上的霉菌進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn),采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑,雖證明此類(lèi)試劑對(duì)霉菌的抑制作用,但無(wú)法排除此類(lèi)試劑對(duì)棉類(lèi)紡織品文物的傷害,因此,紡織品文物抑菌實(shí)驗(yàn)的實(shí)現(xiàn)與突破,需要生物技術(shù)手段、文物復(fù)制技術(shù)等多方面努力。根據(jù)不同菌屬的生長(zhǎng)習(xí)性和紡織品文物特性,有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)防霉劑以及選擇合適的儲(chǔ)存條件,對(duì)紡織類(lèi)文物的保護(hù)具有重要意義。

3 結(jié) 論

本研究選取已產(chǎn)生霉變的棉類(lèi)紡織品文物衣襟上的霉株,利用PDA培養(yǎng)基分離純化共得到6種不同形態(tài)的霉菌。通過(guò)對(duì)6種霉菌基因組DNA的ITS區(qū)擴(kuò)增測(cè)序,同時(shí)與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌種序列對(duì)比以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),鑒定結(jié)果顯示,2種為青霉屬、2種為交鏈孢霉屬、1種為曲霉屬、1種為鐮刀屬,但無(wú)法鑒定到種。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該件棉類(lèi)紡織品文物霉變菌屬分別為青霉菌屬、交鏈孢霉屬、曲霉屬、鐮刀屬,霉菌的產(chǎn)生原因暫時(shí)不明,人體皮脂污染、穿著污染、保存環(huán)境等均會(huì)對(duì)文物的侵蝕產(chǎn)生一定的影響。