通過CD20單抗打破小鼠HBV免疫耐受研究Bregs細(xì)胞在慢性乙型肝炎中的作用

劉中天 張嘉靜 林濤發(fā) 舒丹 王少揚

在感染、炎癥和自身免疫性疾病中B細(xì)胞可以通過呈遞抗原和分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),即便抗原低濃度下仍能精準(zhǔn)識別并呈遞[1]。HBcAg特異性B細(xì)胞能在慢性乙型肝炎(CHB)患者體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生抗-HBc,而抗-HBc的存在又能破壞肝臟細(xì)胞活性和影響HBV的清除,說明同樣是特異性B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,卻能出現(xiàn)不同的結(jié)果[2]。接種疫苗的人群可在體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗體,抗體能阻斷HBV的感染和復(fù)制,推斷當(dāng)B細(xì)胞功能障礙會引起體內(nèi)HBsAg的持續(xù)存在和復(fù)制。臨床治療中發(fā)現(xiàn)使用針對B細(xì)胞增生為主的利妥昔單克隆抗體治療淋巴瘤時,如果不同時采取抗病毒措施將會引起HBV再激活甚至引起暴發(fā)性肝炎,極易進(jìn)展為肝功能衰竭[3]。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell,Bregs)可以通過產(chǎn)生IL-10細(xì)胞因子,負(fù)性調(diào)控其他免疫細(xì)胞同時對效應(yīng)B細(xì)胞也產(chǎn)生抑制作用,能下調(diào)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。Bregs細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-10、IL-35和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),被認(rèn)為是先于Tregs細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的細(xì)胞[4]。Bregs細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、艾滋病和丙型肝炎中的作用已有較多研究,但對乙型肝炎的作用鮮見報道。本研究探討B(tài)regs細(xì)胞在CHB發(fā)病機制中的作用。

材料與方法

一、實驗材料

實驗動物為6～8周雄性C57BL/6小鼠20只,飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院動物實驗中心,符合清潔級飼養(yǎng)條件。入組前均排除相關(guān)病毒感染、艾滋病、先天性免疫缺陷障礙等。研究方案經(jīng)過聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

目前已知小鼠和人類都高表達(dá)CD1d+和CD19,在另外一種超敏模型中發(fā)現(xiàn)表面標(biāo)志物為CD1d+CD5的B細(xì)胞能產(chǎn)生IL-10,抑制超敏反應(yīng)過程[5, 6]。多種標(biāo)志物組合檢測能提高檢測成功率,因此擬用anti-mouse CD1d+、CD5、CD19標(biāo)志物作為檢測指標(biāo)。

二、實驗方法

將p AAV/HBV 1.2質(zhì)粒溶于無菌生理鹽水中,通過尾靜脈注射含質(zhì)粒的鹽水,注射體積為小鼠質(zhì)量的8%～10%,構(gòu)建小鼠HBV感染模型。

將20只小鼠隨機分為實驗組和對照組各10只。實驗組小鼠尾靜脈注射CD20利妥昔單抗(Rituximab),對照組小鼠給予同劑量鹽水。比較兩組小鼠的肝功能、凝血功能、HBV DNA、Bregs細(xì)胞和IL-10。

Bregs細(xì)胞及IL-10分子水平檢測:分離脾臟、外周血、肝臟淋巴細(xì)胞,按說明書加入 anti-mouse CD1d+、CD5、CD19進(jìn)行細(xì)胞表面及胞內(nèi)因子染色,流式細(xì)胞儀檢測2組Bregs細(xì)胞比例。以前向散射角和側(cè)向散射角為坐標(biāo)設(shè)門識別肝臟、脾臟以及外周血淋巴細(xì)胞,對CD1d+細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門,分析CD5+和CD19+Bregs細(xì)胞在臟器的分布比例。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。偏態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,比較采用Mann-WhitneyU檢驗,雙變量相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實驗組與對照組小鼠血清學(xué)比較

實驗組和對照組小鼠HBV DNA比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組小鼠的ALT和AST均高于對照組,而血清IL-10水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。打破免疫耐受后,實驗組小鼠體內(nèi)IL-10水平和ALT、AST水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66、-0.65,均P<0.05)。

表1 實驗組與對照組ALT、AST以及IL-10水平比較[M(P25, P75)]

二、實驗組與對照組小鼠凝血功能比較

實驗組凝血酶原時間(PT)低于對照組,而纖維蛋白原(FIB)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);活化部分凝血酶原時間、凝血酶時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表2。

表2 兩組小鼠凝血功能比較[M(P25, P75)]

三、實驗組與對照組小鼠Bregs細(xì)胞在不同器官中的分布

實驗組肝臟脾臟、外周血Bregs細(xì)胞比例均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);見表3。實驗組肝臟、脾臟、外周血Bregs細(xì)胞和IL-10因子行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)Bregs細(xì)胞與IL-10呈正相關(guān)(r=0.73、0.74、0.71,均P<0.05)。

表3 實驗組與對照組小鼠Bregs細(xì)胞在不同器官中的比例[%,M(P25,P75)]

討 論

本研究發(fā)現(xiàn),隨著小鼠HBV感染免疫耐受的破壞,在第7天時出現(xiàn)了肝功能破壞,實驗組小鼠肝臟、脾臟、外周血Bregs細(xì)胞與對照組相比有明顯的下降,與IL-10存在明顯相關(guān)性,隨著Bregs細(xì)胞的破壞,IL-10的水平也降低。Bregs細(xì)胞的功能和數(shù)量的下降,伴隨著肝臟炎癥活動的增加。

通過研究打破HBV感染免疫耐受小鼠模型,充分證明在慢性乙型肝炎免疫狀態(tài)的激活過程中存在Bregs細(xì)胞的數(shù)量以及功能的變化,提示Bregs細(xì)胞對慢性乙型肝炎的炎癥活動和控制以及病情的進(jìn)展有主要作用。而在打破免疫耐受過程中沒有發(fā)現(xiàn)HBV DNA的變化,提示乙型肝炎通過免疫途徑清除病毒是多方面的,可能包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的參與,以及與γ-IFN、IL-2等多個細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)控制。

Bregs細(xì)胞在自身免疫性疾病、感染性疾病、預(yù)防腫瘤相關(guān)生長、抑制免疫移植耐受中能通過分泌細(xì)胞因子抑制體內(nèi)過度的炎癥反應(yīng),對Tregs細(xì)胞、CD4+、CD8+T細(xì)胞、DC細(xì)胞水平以及Th1/Th2的比例產(chǎn)生影響,且Bregs細(xì)胞數(shù)量的增減或功能強弱的變化都能導(dǎo)致疾病向不同的方向發(fā)展,尤其體現(xiàn)在后期的病情恢復(fù)的快慢,但Bregs細(xì)胞的表面標(biāo)志物、參與激活的信號通路、細(xì)胞的分化狀態(tài)和不同的作用機制在HBV感染中并不明確[7]。

Bregs細(xì)胞在體內(nèi)的變化能影響炎癥,可能與體內(nèi)細(xì)菌和(或)病毒的負(fù)荷有關(guān),將Bregs細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到重癥免疫缺陷的炎癥性腸病的小鼠模型中后,發(fā)現(xiàn)能減輕炎癥程度[8]。Liu等[9]建立的自身免疫性肝炎的小鼠模型發(fā)現(xiàn)缺乏Bregs細(xì)胞后增加了EAH嚴(yán)重性。Gutiérrez等[10]在對HIV患者的研究中發(fā)現(xiàn),未接受治療的新發(fā)患者Bregs(CD24hiCD38hi)或CD19+Tim-1+與Tregs呈正相關(guān),而CD19+CD24hiCD27+或CD19+PD-L1+等Bregs亞群并沒有表現(xiàn)出相關(guān)性,可能是由于患者之間免疫系統(tǒng)的不同或?qū)regs細(xì)胞表型的影響。

Bregs細(xì)胞通過多種途徑來發(fā)揮免疫抑制功能,除了分泌IL-10,還有IL-35和TGF-β等細(xì)胞因子,或者能通過細(xì)胞間的接觸傳遞信號,調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞的分化,降低炎癥因子的釋放和減弱致病原T細(xì)胞的反應(yīng)[11]。不同組織來源的Bregs細(xì)胞收到誘導(dǎo)的信號不同,如在淋巴細(xì)胞中的信號是促炎細(xì)胞因子或已被激活的CD4+T細(xì)胞,而有研究指出脂肪趨化因子和代謝組織中的特異性信號,如CXCL12和游離脂肪酸在脂肪細(xì)胞中的重要作用之一就是能促進(jìn)Bregs的分泌功能[12, 13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)IL-10的水平與Bregs細(xì)胞的數(shù)量和功能存在明顯的相關(guān)性,提示在乙型肝炎的免疫發(fā)病機制中,Bregs細(xì)胞通過分泌IL-10可能是發(fā)揮功能的重要途徑。近年來對Bregs細(xì)胞分泌IL-35以及Bregs細(xì)胞是否和其他免疫細(xì)胞通過細(xì)胞間的接觸而發(fā)揮作用,還需要進(jìn)一步觀察。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。