金橡樹葉冬青組織培養(yǎng)和快速繁殖

樊 靖，孫麗娜，張俊林，彭志聲，彭悠悠，袁虎威

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州 310005；2.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 311300）

冬青屬（Ilex）隸屬于冬青科（Aquifoliaceae），全球約有600 種［1］，廣泛分布于溫帶至熱帶氣候區(qū)，以熱帶美洲和東亞地區(qū)為主要產(chǎn)區(qū)［2］。中國擁有眾多冬青屬植物資源［3］，主要分布于秦嶺南坡、長江流域一帶及其以南的溫帶地區(qū)，《中國植物志》記載的中國產(chǎn)冬青屬植物約204 種［4］。

冬青屬植物多為常綠樹種，樹冠濃密優(yōu)美、果實常為紅色且經(jīng)冬不落，花多且密為良好蜜源植物，果實可為鳥類提供越冬食物，是良好的庭園觀賞和城市綠化樹種，擁有巨大的園林應(yīng)用潛力，北美和歐洲栽培冬青屬種類十分普遍，經(jīng)長期選育，培育出許多園藝品種［5］。金橡樹葉冬青（IlexבGold oak leaf’）是2018 年從美國引進的，經(jīng)栽培觀察適應(yīng)江浙滬地區(qū)自然氣候，生長速度中等，耐修剪，彩葉期可全年呈現(xiàn)，春夏及夏秋交替時節(jié)色彩尤為絢麗，亮麗的色彩很適合與其他彩葉植物搭配種植營造景觀，是一種優(yōu)良的園林綠化彩化及家庭園藝植物。

彩葉冬青從國外引種的有10 多個，但在中國卻尚未得到充分開發(fā)，主要限制因子是繁殖率低。冬青屬種子具有種胚后熟的特性［6］，常規(guī)播種繁殖生長緩慢，且后代性狀易發(fā)生分離；扦插較難生根，彩葉冬青品種扦插繁殖尤為困難；嫁接繁殖步驟繁瑣，操作技術(shù)不易掌握，還存在嫁接親和力問題，繁殖效率較低，嚴(yán)重制約了該屬植物的推廣和應(yīng)用［7］。對于引進的彩葉冬青品種，利用組織培養(yǎng)技術(shù)開展種苗快繁研究，建立工廠化育苗技術(shù)體系，是加速彩葉冬青快速繁育及種苗推廣的重要途徑。

關(guān)于彩葉冬青的組織培養(yǎng)技術(shù)研究有一些報道，也取得了一定的研究進展［8-11］，但鮮見金橡樹葉冬青組織培養(yǎng)技術(shù)研究的報道。本研究以金橡樹葉冬青半木質(zhì)化莖段為材料進行組織培養(yǎng)技術(shù)研究，以期建立組培快繁技術(shù)體系，為其工廠化育苗提供技術(shù)支撐，旨在短期內(nèi)培育出大量無性系優(yōu)質(zhì)種苗，滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2020 年3 月至2022 年10 月在杭州市園林綠化股份有限公司組織培養(yǎng)技術(shù)實驗室（臨安區(qū)）內(nèi)進行。

1.2 試驗材料

試驗材料為金橡樹葉冬青半木質(zhì)化莖段，取自杭州市園林綠化股份有限公司苗木種質(zhì)資源圃（臨安區(qū)）。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體處理 取當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，將其剪成長度為2～5 cm 的單節(jié)或雙節(jié)小段，剪除葉片，保留0.5～1.0 cm葉柄。用飽和洗衣粉溶液浸泡0.5 h，然后用自來水沖洗20～30 min。在超凈工作臺上用75%乙醇溶液浸泡20～30 s，無菌水沖洗1 次，然后用0.1%（m/V）升汞（HgCl2）溶液（添加幾滴吐溫-80）滅菌5～8 min；最后用無菌水沖洗6 次，在無菌不銹鋼接種盤中風(fēng)干莖段表面水分。然后用無菌手術(shù)刀將莖段兩端各切去0.5 cm，葉柄切去0.2 cm，把處理好的材料切成1 cm 左右的莖段，莖段形態(tài)學(xué)下端接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 將處理好的莖段迅速接入含有0.1 mg/L 吲哚丁酸（IBA）和1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）且添加玉米素（ZT）（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS 作為基本培養(yǎng)基，卡拉膠7 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.6～5.8。每處理接種30 個外植體，每瓶接種1～3 個外植體；以不添加玉米素（ZT）的培養(yǎng)基作為對照（CK）。培養(yǎng)條件（無特殊說明均同此條件）：培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間12 h/d，光照度2 000 lx。以萌生嫩莖長度大于1 cm 計為成活（有效萌芽），小于1 cm 計為萌動，培養(yǎng)60 d 后，統(tǒng)計分析不同處理對金橡樹葉冬青外植體萌動率和成活率的影響。

1.3.3 增殖培養(yǎng) 選取長勢較好的金橡樹葉冬青無菌苗，在超凈工作臺上用無菌手術(shù)刀切割成0.5～1.5 cm 帶腋芽的莖段或莖尖，接種到不同的培養(yǎng)基中。設(shè)置基本培養(yǎng)基［WPM、1/2 MS（大量元素減50%）、MS］、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IBA（0.01、0.05、0.10 mg/L）和ZT（0、0.2、0.5 mg/L）4 因素3 水平，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，每處理接種30 瓶，每瓶接種5 個嫩莖或莖段，重復(fù)3 次。培養(yǎng)60 d 后，統(tǒng)計增殖倍數(shù)，并記錄增殖情況。

1.3.4 生根培養(yǎng) 選取生長良好的繼代苗，切割成1.0 cm 以上的嫩莖，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)以1/2MS（大量元素減50%）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用以下6 種培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)：①1/2MS+IBA 0.5 mg/L +活性炭（Ac）0.1 g/L；②1/2MS+NAA 0.5 mg/L+Ac 0.1 g/L；③1/2MS+IBA 0.8 mg/L +Ac 0.1 g/L；④1/2MS+NAA 0.8mg/L+Ac0.1g/L；⑤1/2MS+IBA1.0mg/L+Ac0.1g/L；⑥1/2MS+NAA 1.0 mg/L+Ac 0.1 g/L。每處理接9 瓶，每瓶8 株。接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔3 d 觀察1 次，40 d 后統(tǒng)計生根率及根條數(shù)，觀察各處理間組培苗的生長情況，有效生根為根長0.5 cm 以上。

圖1 金橡樹葉冬青組織培養(yǎng)和快速繁殖

1.3.5 煉苗移栽 生根苗根長1.5 cm 左右時即可進行煉苗移栽。移栽前，溫室馴化適應(yīng)3～5 d。取出小苗，用清水洗凈根系，移栽到泥炭土∶珍珠巖=3∶2（體積比）混合基質(zhì)的育苗床上，移栽完成后澆透定根水。移栽初期用塑料薄膜小拱棚保濕保溫，濕度為80%以上，溫度保持在15～30 ℃。移栽30 d 后統(tǒng)計成活率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007 和DPS 12.01 專業(yè)版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體誘導(dǎo)

以金橡樹葉冬青（圖1A）半木質(zhì)化莖段為材料，接種后7 d，可見金橡樹葉冬青外植體莖段葉柄開始松動脫落；10 d 后莖段開始萌動；30 d 后腋芽伸長形成新梢。部分外植體莖段雖然萌動，但是出現(xiàn)了僵化不抽生的新梢。

不同處理對金橡樹葉冬青外植體莖段萌發(fā)及成活率的影響結(jié)果見表1。由表1 可以看出，添加玉米素（ZT）對外植體的萌動率、成活率以及生長情況有一定的影響，較低濃度的玉米素（ZT）可以提高萌動率和成活率；較高濃度時抑制外植體的生長發(fā)育，造成愈傷化和玻璃化。萌動數(shù)和萌動率較高且生長情況優(yōu)良的為處理2，即MS+IBA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L 培養(yǎng)基配方適合金橡樹葉冬青外植體的誘導(dǎo)（圖1B）。

表1 不同培養(yǎng)基配方對金橡樹葉冬青外植體誘導(dǎo)萌發(fā)及成活率的影響

2.2 增殖培養(yǎng)基篩選

通過L9（34）正交試驗設(shè)計，從極差分析結(jié)果（表2）可以看出，6-BA 是影響金橡樹葉冬青增殖倍數(shù)的主要因子（R=1.35），玉米素對試管苗的增殖倍數(shù)影響也較大（R=0.57），IBA 濃度的影響不大（R=0.49），基本培養(yǎng)基影響最?。≧=0.46）。以不定芽增殖倍數(shù)為考察指標(biāo)，通過分析T1、T2、T3篩選出最佳增殖配方為MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.01 mg/L+ZT 0.5 mg/L（圖1C），在此優(yōu)選增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，增殖倍數(shù)可達5.8。

表2 不同培養(yǎng)基對金橡樹葉冬青增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)基篩選

對金橡樹葉冬青組培苗生根誘導(dǎo)設(shè)置6 個試驗處理，試驗結(jié)果如表3 所示。由試驗結(jié)果可以看出，NAA 不適合用于金橡樹葉冬青組培苗誘導(dǎo)生根，起抑制生根作用，嫩莖基部形成松軟狀愈傷，隨使用濃度增加，還會造成愈傷褐化死亡，導(dǎo)致嫩莖吸收營養(yǎng)困難呈現(xiàn)黃化甚至死亡現(xiàn)象。單獨使用IBA 的試驗處理均能誘導(dǎo)生根，說明金橡樹葉冬青組培苗生根誘導(dǎo)適宜的生長調(diào)節(jié)劑為IBA，隨著IBA 濃度的增加，嫩莖基部愈傷增大。試驗結(jié)果也表明，金橡樹葉冬青誘導(dǎo)生根階段對生根劑的選擇具有專一性，IBA 的濃度在0.5～0.8 mg/L 較適宜，生根率可達100.00%，愈傷小，根系發(fā)達，生根條數(shù)4 條以上，根系還有分枝（圖1D）。

表3 不同培養(yǎng)基對金橡樹葉冬青生根的影響

2.4 煉苗移栽

選擇高度1.5 cm 以上，根系發(fā)達且健壯的小苗移栽到泥炭土∶珍珠巖=3∶2（體積比）混合基質(zhì)72 孔穴盤上，經(jīng)過30 d 的移栽管理，移栽成活率可達95%以上（圖1E、圖1F）。

3 小結(jié)與討論

冬青屬植物大多為常綠喬木或灌木樹種，耐寒性強，樹姿優(yōu)美，葉、花、果均具有較高觀賞價值，是優(yōu)良的園林綠化彩化樹種，有些品種作為茶飲樹種，具有很高的保健及經(jīng)濟價值。國外對冬青屬植物的研究利用較多，在歐美國家，多種冬青已成為園林中常見的觀賞樹［12］，而國內(nèi)對冬青屬植物在園林綠化應(yīng)用及繁育技術(shù)方面的研究不多，主要集中在扦插繁育方面。繁殖困難、繁育效率低、生長較慢是制約冬青屬優(yōu)良品種推廣應(yīng)用的主要因素。彩葉雜交冬青金橡樹葉冬青是園林綠化彩化中的優(yōu)良品種，具有很好的市場開發(fā)及應(yīng)用前景，亟待應(yīng)用開發(fā)及推廣。

在組織培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基對目標(biāo)培養(yǎng)物的脫分化和再分化起重要作用，貫穿外植體誘導(dǎo)分化、增殖培養(yǎng)以及生根誘導(dǎo)3 個階段，起著提供營養(yǎng)、維持滲透壓等作用。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在進行正交試驗中，采用WPM 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時，均出現(xiàn)組培苗葉色偏黃的現(xiàn)象，采用MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時，葉色正常表現(xiàn)為濃綠，主要原因可能是2種基本培養(yǎng)基化學(xué)元素組成不同，MS 培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量相對較高，而WPM 培養(yǎng)基中銨態(tài)氮含量低，硝態(tài)氮含量則較高［13］，高比例的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮可能對金橡樹葉冬青的組織培養(yǎng)具有一定的促進作用。這與王歡等［14］和方宇鵬等［15］的研究報道一致。

植物生長調(diào)節(jié)劑被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，通常是營養(yǎng)基質(zhì)的組成部分。在細(xì)胞水平上，生長素控制著基礎(chǔ)生長，如細(xì)胞的分裂和細(xì)胞的伸長生長。培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑可以改變和影響外植體內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的水平，從而導(dǎo)致外植體在添加不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生誘導(dǎo)分化能力上的差異［16］。植物生長調(diào)節(jié)劑種類、配比及濃度在植物的離體快繁中，也對外植體的誘導(dǎo)分化有很大影響［17］。向培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)劑對外植體的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑水平有一定的影響，因此不同濃度生長調(diào)節(jié)劑及配比的培養(yǎng)基對外植體誘導(dǎo)分化能力產(chǎn)生明顯影響［18］。本試驗在外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)中，以不添加玉米素（ZT）的培養(yǎng)基為對照，發(fā)現(xiàn)與對照組比較外植體的萌動和萌發(fā)情況差異較大。隨著玉米素使用量濃度的提高，金橡樹葉冬青外植體萌動數(shù)和萌動率呈先增高后降低趨勢，過高濃度的玉米素會抑制外植體的萌發(fā)，對萌發(fā)枝條造成玻璃化影響。試驗結(jié)果表明，玉米素的用量為0.5 mg/L 較為適宜。由此可見，植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)過程中對植物細(xì)胞生長有一定的作用，生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度選擇也至關(guān)重要。

試驗結(jié)果表明，金橡樹葉冬青在1/2MS 培養(yǎng)基中添加IBA 可誘導(dǎo)出組培苗生根，0.5～1.0 mg/L 濃度時，生根率均可達100.00%，但是較高濃度的IBA 會形成愈傷化，部分為愈傷出根，勢必影響煉苗移栽成活率；在IBA 較低濃度（0.5～0.8 mg/L）時，愈傷組織較少，發(fā)根為韌皮部直接出根型，根系發(fā)達，條數(shù)多，根系還能分枝，是良好的根系誘導(dǎo)效果表現(xiàn)。在生根誘導(dǎo)對比試驗中發(fā)現(xiàn)，NAA 不適宜金橡樹葉冬青誘導(dǎo)生根，NAA 濃度為0.5～1.0 mg/L 時，生根率低甚至不生根，均表現(xiàn)為愈傷化，隨濃度升高愈傷化加劇，造成培養(yǎng)基褐化，用于誘導(dǎo)生根的嫩莖表現(xiàn)黃化甚至死亡?？梢姡鹣饦淙~冬青生根誘導(dǎo)情況與生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度有一定的關(guān)系。在IBA 和NAA濃度為0～0.5 mg/L 時的生根誘導(dǎo)情況未做試驗，有待進一步研究。

通過對金橡樹葉冬青的組織培養(yǎng)技術(shù)研究，構(gòu)建了能運用于規(guī)模化生產(chǎn)的組培快繁技術(shù)體系，通過該技術(shù)體系可在短時間內(nèi)獲得大批量優(yōu)質(zhì)種苗，奠定了金橡樹葉冬青快速推廣應(yīng)用的技術(shù)基礎(chǔ)，這對豐富園林綠化彩化樹種、推動彩葉冬青在園林中的應(yīng)用具有重要意義。