基于質量常數評價方法的艾葉飲片等級評價研究?

陳芳芳,劉 艷,倪鳳燕,3,趙桉熠,章 軍,閆智勇,劉 安,郭 叢△,毛超一

(1. 中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京 100700; 2. 西南交通大學生命科學與工程學院,成都 610031; 3. 南通市第二人民醫(yī)院,江蘇南通 226002; 4. 中國中醫(yī)科學院,北京 100700)

艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant. 的干燥葉,于夏季花未開時釆摘,除去雜質,曬干而得[1]。艾葉在全國各地均有生長,主產于湖北、河南、河北等省份[2]。其味辛、苦,性溫,歸肝、脾、腎經,具有溫經止血、散寒止痛、調經安胎、祛濕止癢的功效。現代研究表明,艾葉主要含有揮發(fā)油、黃酮類、苯丙素類等化學成分,有著抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、抗菌等多種藥理作用[3-6]。

作為中華民族最常用的傳統中藥之一,艾葉至今已有幾千年的藥用歷史[7]。早在戰(zhàn)國時期的《五十二病方》中,就有用艾熏、艾灸來治療癲疝與痔病的記載[8]。除了艾灸及其他藥用外,艾葉也作為食品,如人們在清明節(jié)食用的傳統點心青團。近年來,隨著人們生活水平的提高,艾葉亦被應用于各種保健品、生活用品中[9]。廣泛的用途極大地增加了艾葉的需求量,據統計,艾葉近20年產需量增長超過了120倍。然而,因缺乏明確的等級劃分依據,目前市場上艾葉的質量良莠不齊,不同產地、不同采收及儲存時間等都影響艾葉的品質[10]。

為了將艾葉劃分為不同等級以適應不同的市場需求,本研究采用質量常數法對其進行了評價。質量常數法是一種結合飲片外觀形態(tài)與內在成分的等級評價方法,相較于傳統經驗鑒別更具科學性、合理性。目前,該方法已經成功應用于山楂、梔子、山豆根、丹參、黃芪[11-15]等中藥飲片的等級劃分中。本研究將艾葉的出絨量與指標成分含量相結合,建立了艾葉飲片的等級評價新方法,以期統一市場上艾葉飲片的等級劃分標準,促進艾葉的優(yōu)質、規(guī)范化發(fā)展。

1 材料

1.1 藥物

從湖北、河北、河南等地收集了13批不同廠家、不同批號的艾葉飲片,具體飲片信息見表1,飲片形態(tài)見圖1。

圖1 13批艾葉飲片樣品形態(tài)

表1 13批艾葉飲片信息

1.2 主要試劑與儀器

桉油精對照品(江西佰草源生物科技有限公司,批號001176-202105,純度98%);龍腦對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號881-200001,供含量測定用);乙酸乙酯(北京市通廣精細化工公司,批號20220723);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司,貨號C11995500BT);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,美國Gibco公司,貨號10099-141);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,德國Sigma公司,貨號L4391)。

7890A型氣相色譜儀(美國安捷倫公司,包括7890A GC System、FID 氫離子火焰檢測器);FW100型高速粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ-600E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FDU-1110型冷凍干燥機(東京理化器械株式會社);Multiskan FC型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 艾葉樣品中指標成分的含量測定

參考2020版《中華人民共和國藥典》一部艾葉的含量測定方法測定艾葉中桉油精(C10H18O)及龍腦(C10H18O)的含量[1]。

2.1.1 色譜條件 Agilent DB-17色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);柱溫為程序升溫,初始溫度45 ℃,先以2 ℃/min的速率升溫至75 ℃,保持5 min;然后以1 ℃/min 的速率升溫至90 ℃,保持6 min;再以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃;最后以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃,保持5 min;進樣口溫度為240 ℃;檢測器溫度為250 ℃。流量為0.6 mL/min;分流進樣,分流比為5:1。理論板數按龍腦峰計算應不低于50 000。對照品及樣品色譜圖見圖2。

注: 1. 桉油精;2. 龍腦 A. 對照品;B. 艾葉供試品

2.1.2 對照品溶液的制備 取桉油精及龍腦對照品適量,精密稱定,加乙酸乙酯制成每1 mL含桉油精0.2 mg、龍腦0.1 mg的混合溶液,即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 將艾葉剪碎成約0.5 cm的碎片,取約2.5 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加水300 mL,連接揮發(fā)油測定器。從測定器上端加水,使其溢流入燒瓶時為止,再加入乙酸乙酯2.5 mL,連接回流冷凝管。加熱至沸騰,再加熱5 h,放冷,收集乙酸乙酯層于10 mL量瓶中,用乙酸乙酯分次洗滌測定器及冷凝管,移入同一量瓶中,再用乙酸乙酯定容,搖勻,即得。

2.1.4 測定法 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1 μL,注入氣相色譜儀中,照上述色譜條件進行含量測定。

2.2 艾葉中艾絨的制備

分別取各批次的艾葉樣品3份,每份10 g,置于高速粉碎機內,粉碎1 min,篩分(40目)30 s,除去粉末,記錄出絨量,繼續(xù)粉碎艾絨,重復此步驟直至相鄰兩次出絨量差小于10%時,視為終點。每批樣品3組重復的末次出絨量的平均值為m。

2.3 艾葉質量常數計算

前期等級評價的有關研究中,將中藥飲片按照不同形態(tài)建立了不同的質量常數計算公式[16]。艾葉飲片屬于未切制類飲片,這里選用公式(1)計算各樣品的質量常數(A),式中m指10 g艾葉樣品的出絨量;c為指標成分的含量,此為桉油精及龍腦的含量。

A=c×m

(1)

因艾葉有桉油精及龍腦兩個指標成分,為避免兩種成分含量差異所帶來的影響,使用相對質量常數(A’)來進行等級劃分,具體計算方法見公式(2)。式中,A1、A2分別為桉油精及龍腦的質量常數;C1,C2分別為2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的桉油精及龍腦的最低含量。

(2)

由于不同飲片的A或A’在數值上差異較大,無法通過其來直接比較不同飲片的等級情況。為此,使用公式(3)計算得到百分質量常數(A%),可以更直觀地反映艾葉飲片的等級。式中,A’i為某個樣品的相對質量常數,A’max為相對質量常數最大值。

(3)

2.4 不同等級艾葉水提物和揮發(fā)油的抗炎作用評價

2.4.1 不同等級艾葉水提物凍干粉的制備 根據分級結果,分別在各等級艾葉飲片中隨機選取一個代表性樣品,參考何柳等[17]的提取方法并稍加調整,具體為:將艾葉剪碎,稱取20 g,加入600 mL水,浸泡過夜,用600 w超聲提取30 min,再于水浴加熱2 h(80 ℃),趁熱過濾,真空冷凍干燥后,得到凍干粉,稱重并計算出膏率。

2.4.2 不同等級艾葉揮發(fā)油的制備 取上述所選各等級的代表性艾葉樣品各100 g,剪碎,置圓底燒瓶中,加水2.5 L,參考2.1.3的方法提取艾葉揮發(fā)油(不加乙酸乙酯),讀取揮發(fā)油體積并收集備用。

2.4.3 RAW264.7細胞株的培養(yǎng) 將實驗室保存的小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7復蘇,取適量培養(yǎng)于配制的DMEM培養(yǎng)基中(含10% FBS、1×105U/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素),培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2,37 ℃。

2.4.4 細胞上清液中NO含量的檢測 分別取各等級代表樣品對應10 g生藥量的水提物凍干粉和對應20 g生藥量的揮發(fā)油,溶解于DMEM完全培養(yǎng)基中備用。將培養(yǎng)的RAW264.7細胞以1×105個細胞/孔種植于96孔板中,在37 ℃,5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,分別加入配置好的不同等級艾葉水提物和揮發(fā)油處理細胞。2 h后,每孔加入LPS(1 μg/mL),作用24 h后,取上清液,采用Griess法檢測上清液中NO濃度,依照說明書步驟進行操作,使用酶標儀測定540 nm處的吸光度。

3 結果與分析

3.1 艾葉指標成分含量測定結果

2020版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定艾葉含桉油精不得少于0.050%,含龍腦不得少于0.020%。經測定,所收集的13批艾葉樣品中桉油精及龍腦的含量見表2。其中,樣品7、9、11的含量不合格,其余10個艾葉樣本含量符合規(guī)定。在合格樣品中,桉油精的含量范圍為0.054%～0.202%,龍腦含量范圍為0.021%～0.117%,最大值與最小值間分別相差約4倍及6倍,可見不同艾葉樣本間的指標成分含量差異較大。

表2 13批艾葉飲片的形態(tài)參數及計算結果

3.2 艾葉出絨量測定結果

艾葉樣品經重復粉碎后制得質地柔軟細膩、顏色土黃的高品質艾絨,具體的出絨量見表2。由表2可知,這13批艾葉樣品10 g原料可以得到0.42～0.96 g的艾絨。其中,艾葉樣品1的出絨量最高,樣品9、10、12的出絨量較低,其他樣品間的差異較小,三個樣品出絨量較低的原因可能是樣品中含有較多的葉柄及莖類雜質。

3.3 質量常數計算與等級劃分結果

根據方法2.3的公式,計算13批艾葉樣品的質量常數,結果見表2。在指標成分含量合格的基礎上,以A%≥80%為一等品,50%≤A%<80%為二等品,A%<50%為三等品。由此得到,樣品中共有5個一等艾葉,3個二等艾葉和2個三等艾葉。其中,一等艾葉A’≥5.19,二等艾葉3.24≤A’<5.19,三等艾葉A’<3.24。百分質量常數分布圖見圖3。

圖3 艾葉樣品百分質量常數分布

所有艾葉樣品中,品質最好的為產自湖北蘄春的樣品3,其指標成分含量及出絨量均較高,綜合兩個指標后為最佳的艾葉飲片。樣品1雖然出絨量最高,但其成分含量很低,僅高于2020版《中華人民共和國藥典》年版規(guī)定的最小值,綜合評價為三等艾葉飲片。樣品10的桉油精及龍腦含量均較高,而出絨量很低,綜合評價為二等飲片。因此,單從外觀或者含量來評價艾葉等級較為片面,將二者相結合能更好地反映飲片的品質。此外,各批次艾葉飲片指標成分含量間的差異明顯大于形態(tài)指標,因而前者對于艾葉的等級影響更大。

3.4 不同等級艾葉樣品水提物和揮發(fā)油的抗炎活性

為了驗證等級劃分的合理性,對各等級艾葉飲片的藥效活性進行了探究。利用LPS誘導RAW264.7細胞株模型,檢測了3個等級艾葉水提物和揮發(fā)油對炎癥反應的抑制作用。LPS誘導會引起細胞上清液中炎癥因子NO濃度升高[18],而加入三個等級的艾葉水提物或揮發(fā)油后,NO濃度均有不同程度的下降,結果如圖4所示。

注:與對照組比較##P<0.01;與LPS模型組比較*P<0.05, **P<0.01A.不同等級艾葉水提物抗炎活性;B.不同等級艾葉揮發(fā)油抗炎活性

從圖4可以看出,與LPS模型組相比,一等及二等艾葉飲片的水提物可顯著抑制炎癥反應(P<0.01),并且一等艾葉的抗炎效果較二等更強,而三等幾乎沒有抗炎作用(P>0.05);三個等級艾葉的揮發(fā)油均可顯著抑制炎癥反應(P<0.05),且一等品的抗炎活性明顯優(yōu)于二等和三等。由上述結果可知,依據質量常數法評價的艾葉樣品,在藥理活性方面表現出與其等級一致的抗炎效果。

4 討論

有“醫(yī)草”美譽的艾葉對人體有著諸多益處,隨著艾灸需求的不斷增加,龐大的艾葉市場迫切地需要一個明確的等級劃分標準。本研究選取了13批不同來源的艾葉樣本,結合了傳統經驗鑒別與現代科學技術,綜合考慮外觀形態(tài)與內在成分,建立了艾葉的質量常數等級評價方法,并將樣品劃分為了三個等級,旨在促進艾葉的等級劃分規(guī)范化、具體化。

目前,關于艾葉等級劃分的研究較少,更多的是對其質量評價方法的探究。陳昌婕等[19]通過測定艾葉的出絨率、總揮發(fā)油及黃酮等成分的含量,對不同艾種資源葉片的品質進行了比較,胡吉清等[20]同樣采用這些指標來評價中、韓兩地艾葉的質量?？梢?研究者們在對中藥的進行質量評價時,既重視外觀形態(tài)也關注內在成分。艾葉的傳統經驗鑒別以“絨毛多,香氣濃郁,無雜質者為佳”[1,21],而且實際應用中艾絨使用量大,因此本研究選擇出絨量作為形態(tài)指標。研究發(fā)現艾葉揮發(fā)油具有平喘、祛痰、抗菌、消炎等活性[6],桉油精、龍腦、樟腦是其主要活性成分[22-23],且2020版《中華人民共和國藥典》也將桉油精和龍腦作為含量測定指標,所以最終選擇桉油精及龍腦作為等級評價的指標成分。

從艾絨的結果發(fā)現,若按照市場上原料與艾絨的比例即艾絨的等級[24],本研究中各等級的艾葉所得高純度艾絨的等級大部分在20:1以內,此時繼續(xù)粉碎幾乎沒有雜質。然而,由于原料的差異,即使是相同等級的艾絨,所用艾葉的品質也不一樣,這一點黃顯章等[25]也在文獻中提到。因此,除關注出絨量外,還需考慮其他因素來評價艾葉。關于指標成分的含量,13批樣本中有3批不符合藥典規(guī)定,不合格率較高,這可能是因為存放時間較長,導致了成分的損失[26]。由最終的等級劃分結果可知:一等艾葉飲片的成分含量及出絨量均較高,且艾葉中無其他雜質;而品質差的三等艾葉,兩項指標中至少有一項指標很低,且樣本中含有較多的枝梗。這與經驗鑒別的“絨毛多、香氣濃郁、無雜質者為佳”和現代要求活性成分的“含量高”相符合。藥效是評價中藥品質的“黃金指標”[27]。本研究對三個等級艾葉飲片的水提物及揮發(fā)油的抗炎作用進行了檢測。結果發(fā)現,由此方法劃分的艾葉樣本,等級越高,其抗炎活性越強,這進一步證明本方法用于艾葉飲片等級劃分的合理性。

綜上,本研究采用質量常數等級評價法對艾葉進行等級劃分,具有科學性、客觀性。量化的分級形式,有利于艾葉的質量控制與市場規(guī)范化。在實際應用中,可以根據不同的需求選擇不同的艾葉等級,使“醫(yī)草”物盡其用,發(fā)揮更廣、更深的作用。但本研究所采用的樣品偏少,后期需要通過大量的應用進一步驗證本標準的合理性。