“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”對LIDD模型白兔神經(jīng)及血管內(nèi)皮生長因子的影響?

蔣雨晴,趙小艷,姜建振,葉江南,張 鑫,李文翰,盧群文,朱 俊,蘇程果△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,成都 610075;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,成都 610075;3.黃岡市中心醫(yī)院,湖北黃岡 438000)

腰椎間盤退行性病變(lumbar intervertebral disc degeneration,LIDD)是指腰椎間盤等組織結(jié)構(gòu)老化、退變,從而發(fā)生的一系列病變,包括腰椎間盤突出癥、退行性腰椎滑脫癥、椎間盤源性腰痛等疾病,而椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是其最重要的病理基礎(chǔ),嚴(yán)重危害人類健康、降低患者的生活質(zhì)量[1-3]。研究證實,推拿在防治LIDD方面發(fā)揮著極其重要的作用,能有效延緩IDD進程,具有安全性高、療效確切的雙重優(yōu)勢[4-5]。

課題組前期研究證實,“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”能延緩IDD白兔椎間盤(intervertebral disc,IVD)的退變,具體機制與調(diào)控IVD中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1、肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白(coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein, Beclin-1)、自噬蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈(autophagy proteins microtubule-associated protein light chain,LC)3、白細胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表達有關(guān)[6-7]。研究表明,神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在IDD病情進展過程中發(fā)揮重要作用[8-12]。因此,本研究以LIDD模型白兔為載體,從神經(jīng)和血管內(nèi)皮生長因子角度探討“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”對LIDD的作用機制。研究已通過成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),編號:2021-23。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級4月齡健康雄性新西蘭大白兔15只,體質(zhì)量(2.5±0.2)kg,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(蘇)2017-0002。于籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,予自由進食、飲水,標(biāo)準(zhǔn)光照周期(12 h光照/12 h黑暗),室內(nèi)溫度20～26 ℃,濕度50%～70%。

1.2 主要試劑及儀器

青霉素鉀(貨號140051251),江西省科達動物藥業(yè)有限公司;神經(jīng)肽(neuropeptide,NP)Y ELISA試劑盒(貨號MM-8270402)、血漿P物質(zhì)(substance P,SP)ELISA試劑盒(貨號MM-020402)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)ELISA試劑盒(貨號MM-8253702)、5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)ELISA試劑盒(貨號MM-3720302),江蘇酶聯(lián)免疫分析工業(yè)有限公司;NGF蛋白一抗(貨號DF6061)、Trk(tyrosine kinase receptor,Trk)A蛋白一抗(貨號DF6822),美國Affinity公司;VEGF蛋白一抗(貨號GB11034B)、VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)1蛋白一抗(貨號GB13554)、VEGFR2蛋白一抗(貨號GB11190),美國Servicebio公司。

JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機、JB-L5型凍臺,武漢俊杰電子有限公司;RM2016型石蠟切片機,上海徠卡儀器有限公司;D3024型離心機,美國賽洛捷克SCILOGEX公司;SLAN-96S型全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng),上海宏石醫(yī)療科技有限公司;ChemiScope 6100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 分組與造模

采用隨機數(shù)字表法將白兔分為對照組、模型組和推拿組3組,每組5只。模型組和推拿組動物采用經(jīng)腹膜后間隙穿刺纖維環(huán)的方法建立LIDD白兔模型[13]。使用穿刺針對L2～L3、L3～L4、L4～L5進行IVD穿刺。對照組不穿刺IVD,其余操作同模型組。術(shù)后處理:穿刺部位消毒包扎,肌肉注射青霉素鉀,4×105U/只,1次/d,共5 d。參照病理評分標(biāo)準(zhǔn)進行模型評價:干預(yù)結(jié)束后處死取材,比較對照組與模型組IVD組織HE染色病理評分,若模型組相較于對照組顯著升高(P<0.05),提示造模成功[14]。

1.4 治療方法

完成造模5 d后開始干預(yù)。推拿組白兔參考“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿法”進行推拿干預(yù),參考《獸醫(yī)針灸學(xué)》及《實驗針灸學(xué)》進行穴位定位[15-17]。具體操作方法如下:1)按揉法:自上而下按揉腰背部雙側(cè)豎脊肌,重點是脊柱兩側(cè)膀胱經(jīng),側(cè)重L2～L5部位,操作480次,共4 min;2)點按法:采用近部取穴原則,點按雙側(cè)膀胱經(jīng)的腎俞、三焦俞、脾俞,操作30次,共3 min;3)彈撥法:順膀胱經(jīng)彈撥脊柱兩側(cè)豎脊肌,操作450次,共3 min。為了避免推拿治療過程中由于手法熟練程度、取穴準(zhǔn)確性、節(jié)奏頻率以及力度大小等差異所引起的誤差,推拿手法干預(yù)均由同一位熟練掌握峨眉傷科流派手法的資深醫(yī)師經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)操作程序培訓(xùn)后實施操作。每周一至周五固定時段進行推拿干預(yù)治療,每次10 min,每周5次,共計4周。對照組和模型組白兔僅抓取固定,不予其他任何干預(yù)。

1.5 標(biāo)本制備

推拿干預(yù)4周后,所有白兔采用3%濃度戊巴比妥鈉(1.3 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉,取腹主動脈血備用[18]。隨后采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死后取出L2～L3、L3～L4和L4～L5的IVD,其中L2～L3的IVD放入4%多聚甲醛固定,剩余IVD和血液樣本于-80 ℃冷凍保存。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 HE染色 將IVD樣本使用4%多聚甲醛固定后,脫鈣、脫水,石蠟包埋,3 μm連續(xù)切片,蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色后封片,在光學(xué)顯微鏡下(×100)觀察IVD組織退變情況。隨后,參照IVD組織病理學(xué)分級量表進行HE染色評分,量表中將IVD分為纖維環(huán)、髓核和纖維環(huán)邊界、髓核細胞數(shù)、髓核基質(zhì)4類,每類按照1～3分級記1、2、3分。總分4分為正常,12分代表嚴(yán)重退變[14]。

1.6.2 ELISA檢測 將白兔血液樣本離心后取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中NPY、SP、CGRP、5-HT的表達。通過酶標(biāo)儀進行光密度(optical density,OD)測定,再代入方程計算樣品濃度。

1.6.3 熒光定量PCR檢測 將IVD組織勻漿后提取總RNA,使用核酸分析儀檢測RNA濃度及純度,使其終濃度為500 ng/μL。反轉(zhuǎn)錄后配置熒光定量PCR反應(yīng)體系測定RNA表達情況。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行分析。GAPDH、NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1和VEGFR2的引物序列見表1。

1.6.4 Western blot檢測 將 IVD組織提取總蛋白,蛋白定量,電泳,轉(zhuǎn)膜,加入稀釋好的一抗NGF(1:1 000)、TrkA(1:500)、VEGF(1:1 000)、VEGFR1(1:1 000)、VEGFR2(1:1 000),孵育過夜后再加入相應(yīng)二抗,超敏增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑顯影,在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下采集圖像并進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組白兔椎間盤組織HE染色結(jié)果比較

HE染色結(jié)果顯示(圖1),對照組IVD組織內(nèi)髓核與纖維環(huán)界限清晰、連接緊密無中斷,髓核形狀規(guī)則,髓核內(nèi)細胞豐富且分布均勻,凝膠狀結(jié)構(gòu)中含有大液泡,髓核基質(zhì)呈正常凝膠狀表現(xiàn),纖維環(huán)排列整齊無破裂,呈同心圓狀。模型組與對照組比較,可見IVD組織內(nèi)髓核與纖維環(huán)互相分離且有中斷,髓核形狀不規(guī)則,髓核細胞數(shù)量和液泡顯著減少,髓核基質(zhì)呈中重度凝結(jié)狀態(tài)。推拿組IVD組織內(nèi)髓核與纖維環(huán)連接較緊密有輕度中斷,髓核形狀較規(guī)則,髓核細胞數(shù)量略有減少、液泡較少,髓核基質(zhì)呈輕微凝結(jié)狀態(tài)。

圖1 各組白兔椎間盤組織HE染色結(jié)果(×100)

HE染色結(jié)果評分顯示(表2),與對照組比較,模型組IVD組織HE染色評分顯著升高(P<0.01),提示造模成功;與模型組比較,推拿組IVD組織HE染色評分顯著降低(P<0.05)

表2 各組白兔椎間盤組織HE染色結(jié)果評分比較(分,

2.2 各組白兔血清NPY、SP、CGRP、5-HT水平比較

如表3所示,與對照組比較,模型組血清NPY、SP、CGRP、5-HT表達顯著升高(P<0.01);與模型組比較,推拿組血清NPY、SP、CGRP、5-HT表達顯著降低(P<0.05)。

表3 各組白兔血清NPY、SP、CGRP、5-HT水平比較

2.3 各組白兔椎間盤組織NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達比較

如表4所示,與對照組比較,模型組IVD組織中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,推拿組IVD組織中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表達水平顯著降低(P<0.01),TrkA mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組白兔椎間盤組織中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平比較

2.4 各組白兔椎間盤組織NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 蛋白表達比較

如圖2和表5所示,與對照組比較,模型組IVD組織中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表達顯著升高(P<0.01);與模型組比較,推拿組IVD組織中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表達顯著降低(P<0.05)。各組TrkA蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注:神經(jīng)生長因子(NGF);酪氨酸激酶受體A(TrkA);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1);血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)

表5 各組白兔椎間盤組織NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達比較

3 討論

LIDD屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“腰痛”等范疇,其主要癥狀為腰痛,可伴下肢活動受限[19-20]?！岸朊紓屏髋伞闭J(rèn)為腰痛者腎虛為其根本,外邪引動致氣血失和,水濕不利,經(jīng)脈痹阻。因此,該流派主張采用按揉法和彈撥法作用于腰背部足太陽膀胱經(jīng),以行氣和血,松解粘連、理順經(jīng)筋,通經(jīng)止痛;點按腎俞、三焦俞、脾俞以固腎、利水、強腰。現(xiàn)代研究證實,按揉和點按椎間盤突出癥大鼠腰背部具有鎮(zhèn)痛消炎、改善局部血液循環(huán)的作用,彈撥脊柱兩側(cè)豎脊肌可以改善腰椎小關(guān)節(jié)紊亂及神經(jīng)根受壓的情況,促進骨與肌肉動力平衡,在多種手法的共同作用下能有效延緩LIDD發(fā)展進程[21-23]。

健康的IVD沒有血管組織,而Freemont等[24-25]發(fā)現(xiàn)在纖維環(huán)破裂的腰椎間盤中,纖維環(huán)裂隙和椎間盤髓核內(nèi)存在血管肉芽組織,神經(jīng)纖維又可沿著血管肉芽組織區(qū)域向IVD纖維內(nèi)層甚至是髓核內(nèi)生長,且退變的IVD中NGF和TrkA的表達水平較高。NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和組織疼痛方面有重要作用,可促進神經(jīng)軸突生長,從而加重IVD神經(jīng)浸潤現(xiàn)象[26-27]。VEGF通過結(jié)合并激活受體酪氨酸激酶VEGFR1和VEGFR2來介導(dǎo)血管的新生,使退變的IVD內(nèi)出現(xiàn)血管化現(xiàn)象[28]。TrkA是NGF的高特異性親和力受體,結(jié)合后可刺激NPY、SP、CGRP、5-HT的釋放,引起中樞和外周敏化,在調(diào)節(jié)炎性疼痛中起到關(guān)鍵作用[29]。研究證實,IDD患者血清中NPY、SP、CGRP、5-HT的表達升高是椎間盤源性疼痛的重要原因[30-31]。本研究結(jié)果顯示,模型組白兔IVD組織中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA和NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白含量顯著上升,并且血清中NPY、SP、CGRP、5-HT含量增加,提示退變的IVD組織中有大量血管和神經(jīng)生長因子聚集,有新生血管形成和神經(jīng)浸潤現(xiàn)象。

馬惠昇[32]發(fā)現(xiàn)推拿手法可刺激皮膚表面的感受器,反射性興奮血管運動中樞,促使毛細血管擴張、增強血管壁的彈性,加快血液循環(huán),達到“化瘀”的作用。劉家遠等[33]采用循經(jīng)點穴推拿治療腰椎間盤突出癥患者,發(fā)現(xiàn)患者炎癥反應(yīng)減輕,血漿NGF水平顯著下降,受損神經(jīng)得到修復(fù)。裘興棟等[34]發(fā)現(xiàn)穴位刺激能通過下調(diào)軟骨終板中VEGF、IL-1β表達水平,增加軟骨終板內(nèi)血管芽數(shù)目、降低鈣化層厚度,從而發(fā)揮延緩頸椎間盤退變的作用。本實驗顯示,推拿組白兔IVD組織中NGF、VEGF及受體VEGFR1、VEGFR2的mRNA和蛋白表達顯著減少,提示“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”可能具有延緩IDD的作用。但是,TrkA的蛋白表達水平同IDD的關(guān)系目前仍不完全清楚,并且TrkA在IVD細胞中可能具有其他重要功能,在本實驗中各組間TrkA的蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,其對延緩?fù)肐VD退化的作用仍需進一步研究。

再者,NPY、SP、CGRP、5-HT表達受NGF影響,故當(dāng)NGF水平下降后,NPY、SP、CGRP、5-HT的表達也顯著降低。其中NPY和SP可促進背根神經(jīng)節(jié)細胞組織形態(tài)的修復(fù)[35],李江濤等[36]發(fā)現(xiàn)推拿聯(lián)合針灸治療血瘀型腰椎間盤突出癥患者,可降低患者外周血中NPY、SP的含量,減輕疼痛。研究顯示,CGRP參與了椎-基底動脈供血不足的“神經(jīng)-血管”反饋調(diào)控機制[37]。賈國志等[38]發(fā)現(xiàn)推拿可以通過下調(diào)具有致痛作用的5-HT、上調(diào)具有止痛作用的β-內(nèi)啡肽從而達到鎮(zhèn)痛效果。本研究結(jié)果顯示推拿組白兔血清中NPY、SP、CGRP、5-HT呈現(xiàn)表達量顯著降低的趨勢,結(jié)合以上研究,均提示推拿對血管和神經(jīng)生長因子,以及血清中疼痛物質(zhì)的表達有顯著的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述,“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”可能通過調(diào)控IVD組織中神經(jīng)和血管內(nèi)皮生長因子表達從而延緩LIDD模型白兔的IVD退變進程。然而,LIDD受多條信號通路機制的調(diào)控,今后將進一步探究“峨眉傷科膀胱經(jīng)推拿”對LIDD的作用機制。