白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細(xì)胞平衡和細(xì)胞凋亡的影響?

吳紫陸,趙 斌,丁 虹,蔡紀(jì)堂△,宋會(huì)玲

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,鄭州 450002;2.河南省中醫(yī)院,鄭州 450002)

白塞病(Behcet’s disease, BD)是一種以血管炎性疾病為主要病理表現(xiàn)的自身免疫性疾病[1]。作為機(jī)體最大免疫器官的脾臟是免疫反應(yīng)的中心,與機(jī)體免疫狀態(tài)有密切關(guān)系。最新研究表明,T細(xì)胞在BD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中輔助性T細(xì)胞(T helper cells, Th)17與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell, Treg)比例失衡以及淋巴細(xì)胞過(guò)度凋亡,在白塞病發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[2-3]。

目前有關(guān)白塞病的早期治療主要使用扶正補(bǔ)益類藥物,其中白術(shù)(Atractylodes macrocephala)既可補(bǔ)氣健脾、燥濕利水;又兼以養(yǎng)陰避免滋膩太過(guò)[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白術(shù)的主要成分主要包含白術(shù)多糖、白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)氨基酸及蒼術(shù)酮等,其中白術(shù)內(nèi)酯I具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善胃腸道功能以及抗腫瘤的效果[5-6]?？缒な荏w蛋白Notch信號(hào)通路在維持機(jī)體免疫平衡中具有重要作用,Notch廣泛表達(dá)在CD4+T細(xì)胞表面,它不僅能夠調(diào)控Th17/Treg平衡和細(xì)胞凋亡,還可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-10和IL-17等抗炎因子的分泌[7-9]。本研究旨在探討Notch信號(hào)在白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ改善白塞氏病小鼠脾臟中Th17/Treg細(xì)胞失衡和細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)小鼠40只,雌雄各半,6～8周齡,體質(zhì)量(20±5)g,購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(豫)20210007。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物均于室溫20～25 ℃、普通飼料、自由進(jìn)食飲水環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)PZ-HNSZYY-2021-001。

1.2 藥物

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司,規(guī)格10 mg/支,貨號(hào):JOT-10489。

1.3 主要試劑與儀器

Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自北京Solarbio公司,貨號(hào)LA9510;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翌日圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號(hào)40306ES20;IL-4 ELISA試劑盒(貨號(hào)mL064310)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號(hào)mL064299)、IL-17 ELISA試劑盒(貨號(hào)mL063129)、IL-22 ELISA試劑盒(貨號(hào)mL063138),均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;維甲酸相關(guān)孤兒受體(Retinoic acid-related orphan receptor, ROR)γt抗體(貨號(hào)16450S)、叉頭框蛋白 P3(Forkhead Box Protein P3, Foxp3)抗體(貨號(hào)12653 T)、Notch1抗體(貨號(hào)3608 S)、Hes1抗體(貨號(hào)11988 S)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)抗體(貨號(hào)9662 S)、β-actin抗體(貨號(hào)4970 T),均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology生物公司;FITC-anti-mouse CD4(貨號(hào)100406-1),percp-cy5.5-anti-mouse IL-17(貨號(hào)506920-1),PE-anti-mouse Foxp3(貨號(hào)126403-1)、APC-anti-mouse CD25(貨號(hào)162106),均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

Gallios型流式細(xì)胞儀,美國(guó)beckman公司;Varioskan型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;164-5050型基礎(chǔ)電泳儀、170-3930型轉(zhuǎn)膜儀,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 模型建立[10]

將40只SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、白術(shù)內(nèi)酯I(40 mg/kg)組和Jagged1(1 mg/kg)組,每組10只。0.1 mL原肌球蛋白為致敏原,以0.1 mL弗氏為佐劑,濃度0.6 mg/mL,模型組與實(shí)驗(yàn)組20只小鼠腹腔注射0.5 mL,每周1次,共4次,對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 分組及給藥方法

小鼠分組后,對(duì)照組與模型組小鼠給予等劑量濃度0.9%的0.9%氯化鈉溶液,白術(shù)內(nèi)酯I組給予白術(shù)內(nèi)酯I (40 mg/kg);Jagged1組給予Jagged1 (1 mg/kg),2次/日,灌胃連續(xù)給藥4周,所有SPF小鼠均在同等條件下飼養(yǎng)。末次給藥后1周,取小鼠新鮮脾臟組織,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 Western Blot檢測(cè)小鼠脾臟中Notch1、Hes1、Foxp3和RORγt蛋白表達(dá)水平 稱取脾臟組織50 mg,研磨勻漿后加入RIPA裂解液在冰上裂解,4 ℃, 12000 r/min離心15 min,提取蛋白上清液,按比例加入上樣緩沖液后于水浴鍋內(nèi)100 ℃煮沸10 min變性。蛋白定量試劑盒(Bicinchoninicacid, BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。電泳轉(zhuǎn)膜后用含有5%脫脂奶粉的封閉液4 ℃封閉2 h。用抗體稀釋液稀釋一抗,Notch1(1:1 300);Hes1(1:1 200)、Foxp3(1:1 000)、RORγt(1:1 000)、β-actin(1:3 000),將聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜浸泡于一抗中,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST充分洗滌3次;加入二抗室溫孵育2 h,TBST充分洗滌3次,加入化學(xué)發(fā)光底物(electro-chemi-luminescence, ECL)顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照,用Image-J分析條帶灰度值,測(cè)定蛋白表達(dá)水平。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Th17/Treg細(xì)胞平衡情況 使用Percoll液分離1.5項(xiàng)下脾臟組織的單核細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度(1×106/mL),分別通過(guò)加入CD4-FITC、CD25-APC、IL-17PE和Foxp3-PE進(jìn)行來(lái)進(jìn)行染色;分別避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)Th17與Treg細(xì)胞的比例。

1.6.3 ELISA法檢測(cè)小鼠脾臟中的含量IL-17、IL-22、IL-4和IL-10的水平 取50 mg脾臟組織,用預(yù)冷后的PBS進(jìn)行洗滌,勻漿后離心分離上清液,于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩⒄誆LISA試劑盒說(shuō)明書步驟,檢測(cè)小鼠脾臟上清液中IL-17、IL-22、IL-4和IL-10的水平。

1.6.4 TUNEL法檢測(cè)小鼠脾臟中陽(yáng)性細(xì)胞凋亡數(shù) 取各組小鼠脾臟組織充分脫蠟(60 ℃, 20 min)后水化(梯度乙醇浸洗),使用蛋白酶K孵育(20 min),參照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟,檢測(cè)小鼠脾臟組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞凋亡數(shù)。截取高倍鏡下圖像,計(jì)數(shù)高倍鏡下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞凋亡數(shù)量,并計(jì)算其與TUNEL細(xì)胞總數(shù)的比例。

1.6.5 免疫組化法檢測(cè)小鼠脾臟中caspase-3蛋白表達(dá)水平 取各組小鼠脾臟組織石蠟切片,脫蠟及水化后高壓熱修復(fù)抗原;3% H2O2孵育(37 ℃, 10 min),常規(guī)洗滌吸干后加入血清封閉;滴加Caspase-3抗體(1:100),孵育過(guò)夜(4 ℃);常規(guī)洗滌后滴加二抗(1:100)(37 ℃, 30 min);常規(guī)洗滌吸干后滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)工作液顯色,光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察每張切片的不同視野,Image J分析單位面積內(nèi)Caspase-3染色的平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Notch通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1處理組小鼠脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達(dá)明顯增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟中Th17、Treg淋巴細(xì)胞比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Treg細(xì)胞比例則較對(duì)照組明顯降低(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組脾臟中Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值明顯降低,而Treg細(xì)胞比例明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1處理組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值升高,Treg細(xì)胞比例降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖2。

注:與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術(shù)內(nèi)酯I組比較△P<0.05

2.3 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Th17和Treg相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟中Th17細(xì)胞因子IL-17和IL-22的水平明顯升高,而Treg細(xì)胞因子IL-4和IL-10的水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組小鼠IL-17、IL-22水平明顯降低,而IL-4和IL-10的水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1組中IL-17和IL-22的水平升高,而IL-4和IL-10的水平降低,差異顯著(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖3。

注:與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術(shù)內(nèi)酯I組比較△P<0.05

2.4 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Foxp3和RORγt蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,模型組小鼠Foxp3水平明顯降低,而RORγt表達(dá)水平明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組小鼠Foxp3水平明顯升高,RORγt表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中Foxp3水平降低,RORγt表達(dá)水平升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如圖4。

注:與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術(shù)內(nèi)酯I組比較△P<0.05

2.5 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較,模型組小鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組小鼠脾臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如圖5。

2.6 白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟中caspase-3水平的影響

免疫組化結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組小鼠凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,白術(shù)內(nèi)酯I組小鼠脾臟caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與白術(shù)內(nèi)酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如圖6。

注:與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術(shù)內(nèi)酯I組比較△P<0.05

3 討論

BD又稱口、眼、生殖器三聯(lián)征,臨床表現(xiàn)多以反復(fù)性口腔潰瘍、眼部炎癥、外陰潰瘍及皮膚損害為主。中醫(yī)古籍對(duì)此并無(wú)詳細(xì)記載,但依據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸納于“狐惑病”?！督饏T要略·百合狐惑陰陽(yáng)毒病脈證治》最早記載為“狐惑之為病……蝕于喉為惑,蝕于陰為狐……狐蝕于上部則聲嘎”[11]。中醫(yī)認(rèn)為脾位中焦,主運(yùn)化水谷精微,為人體后天正氣之本,氣血生化之源,氣機(jī)升降出入之樞紐,脾臟異常與否與BD的發(fā)病有密切關(guān)系[12]。徐玲擬黃芪補(bǔ)中湯健脾溫陽(yáng)治療BD,方中以白術(shù)、蒼術(shù)、豬苓、茯苓及澤瀉助黃芪、人參補(bǔ)益脾氣而助運(yùn)降[13];王新陸對(duì)于BD的治療則擬白術(shù)、陳皮健脾運(yùn)濕,絕生濕之源[14]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是白術(shù)的主要活性成分之一,具有廣泛的生物和藥理學(xué)活性[15]。

免疫細(xì)胞的紊亂與BD的形成和發(fā)展密切相關(guān)。Th17和Treg細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的CD4+細(xì)胞亞群,兩者相互拮抗[16]。研究發(fā)現(xiàn),BD患者血清中由Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高。此外,IL-22是臨床常見(jiàn)的炎性因子,IL-22可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化,在BD發(fā)病過(guò)程中明顯升高[17]。Treg可以通過(guò)分泌IL-10 來(lái)抑制Th17細(xì)胞的活化。細(xì)胞因子IL-10能夠抑制T淋巴細(xì)胞的成熟與分化,降低機(jī)體炎癥反應(yīng),從而緩解BD癥狀[18]。Th17細(xì)胞的重要因子RORγt可以有效引導(dǎo)增多IL-17的分泌,在皮膚與黏膜的生理及病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用,通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞因子刺激炎癥的產(chǎn)生并使其加重[19-20]。高水平的IL-4也是白塞病發(fā)病的重要因素之一,其參與調(diào)節(jié)Th17/Treg比例的平衡。Hamzaoui等[21]發(fā)現(xiàn),BD患者外周血中IL-4和IL-10的水平有顯著降低。此外,RORγt和Foxp3蛋白相互拮抗,在兩者的共同作用下來(lái)維持Th17/Treg細(xì)胞比例的平衡[20]。本研究結(jié)果表明,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ治療后,BD小鼠脾臟Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg比值明顯降低,而Treg細(xì)胞比例明顯升高。白術(shù)內(nèi)酯I處理后,BD小鼠脾臟中RORγt和Foxp3蛋白比例逐漸恢復(fù)正常。綜上,這些結(jié)果表明,白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細(xì)胞比例的失衡具有改善作用。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡在免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占有重要地位[22]。張誼之等[3]研究發(fā)現(xiàn),白塞病皮損中會(huì)伴隨較多淋巴細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果也表明,BD小鼠脾臟細(xì)胞凋亡比例升高,而經(jīng)白術(shù)內(nèi)酯I治療后,BD小鼠脾臟中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的表達(dá)水平均明顯降低。

Notch信號(hào)可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化為Th17和Treg細(xì)胞,在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[23-24]。此外,有研究也表明Notch信號(hào)在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中也起著重要作用,Jagged1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上Notch受體的主要配體蛋白之一,與細(xì)胞表面Notch結(jié)合后,能夠通過(guò)細(xì)胞間的相互作用激活Notch信號(hào)[25-28]。在BD鼠中可以觀察到Notch信號(hào)的異?；罨?并且抑制Notch信號(hào)活化可以起到治療BD的作用[29]。本研究結(jié)果表明,BD會(huì)激活小鼠脾臟中的Notch信號(hào)。為了進(jìn)一步探究白術(shù)內(nèi)酯I是否通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)來(lái)改善BD小鼠脾臟Th17/Treg比例失衡和細(xì)胞凋亡,本研究采用Notch信號(hào)通路激活劑Jagged1激活Notch信號(hào)通路,結(jié)果表明,Jagged1可顯著減弱白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡的改善效果。

綜上,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)BD小鼠的治療作用與其改善脾臟Th17/Treg細(xì)胞比例失衡以及降低脾臟細(xì)胞凋亡有關(guān),其作用機(jī)制可能與抑制Notch信號(hào)的活化有關(guān)。