拔毒生肌散調(diào)控Keap1/Nrf2通路促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的機(jī)制研究?

王雙勛,李大勇

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽(yáng) 110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,沈陽(yáng) 110032)

糖尿病皮膚潰瘍屬中醫(yī)消渴病變證之一,中醫(yī)認(rèn)為其主要病機(jī)為正氣虧虛,伏毒內(nèi)侵,遇感誘發(fā)[1]。祛腐生肌是治療皮膚潰瘍的重要方法。拔毒生肌散是臨床祛腐生肌的經(jīng)典藥物,源于清代名醫(yī)趙廷海所著《救傷秘旨》,“凡破傷不論新久,敷之極效”[2]。本方在臨床廣泛用于治療糖尿病足潰瘍、褥瘡、肛瘺、臁瘡等慢性潰瘍,療效顯著[3-4],但其作用機(jī)制研究尚不多見(jiàn)。本研究通過(guò)觀察拔毒生肌散對(duì)糖尿病大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織的病理形態(tài)、真皮層膠原纖維沉積、CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響,并分析拔毒生肌散對(duì)糖尿病大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Kelch-like ECH-associated protein,Keap)-1/核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)通路相關(guān)蛋白與mRNA的調(diào)節(jié)作用,擬探討拔毒生肌散促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍愈合的機(jī)制。本研究已通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,編號(hào):21000042021078。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠60只,雄性,體質(zhì)量220～260 g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,環(huán)境溫度(25±1)℃、濕度50%～60%,光照時(shí)間早7點(diǎn)～晚7點(diǎn)。

1.2 藥物

拔毒生肌散,購(gòu)于健民集團(tuán)葉開(kāi)泰國(guó)藥(隨州)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20044390,散劑,每瓶3 g;一效散,購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,批號(hào):遼藥制字Z05010275,散劑,每袋50 g。一效膏,由香油和一效散按1:1比率自行調(diào)配。康惠爾清創(chuàng)膠購(gòu)于丹麥康樂(lè)保公司,批號(hào):國(guó)食藥械(進(jìn))字2008第3640515(更),每盒25 g。

1.3 主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ),北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào) 630E024。β-actin抗體(貨號(hào)4970)、KEAP1抗體(貨號(hào)7705)、NRF2抗體(貨號(hào)33649)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記兔二抗(貨號(hào)7074),美國(guó)Cell Signaling公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012)、Western細(xì)胞裂解液(貨號(hào)P0013)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(貨號(hào)P0012AC)、超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒(貨號(hào)P0018),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒(貨號(hào)9767)、DNA提取試劑盒(貨號(hào)RR047A)、定量PCR試劑(貨號(hào)RR820A),日本TaKaRa公司。

1.4 主要儀器

MR1822低溫高速離心機(jī),法國(guó)Jouan SA公司;DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠; RM2016病理切片機(jī),上海徠卡儀器有限公司;Giotto染色機(jī),意大利DIAPATH公司;Pannoramic DESK/MIDI/250/1000全景切片掃描儀,匈牙利3DHISTECH公司;Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀,德國(guó)Agilent Technologies公司;BioDrop Duo核酸蛋白分析儀,英國(guó)Bio Drop公司。

2 方法

2.1 模型制備

2.1.1 糖尿病大鼠模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、拔毒生肌散組、一效膏組、清創(chuàng)膠組,每組12只。造模前12 h禁食不禁水,稱體質(zhì)量,測(cè)血糖。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,喂食普通飼料28 d。另外4組大鼠以單次30 mg/kg劑量腹腔注射2%的STZ溶液,72 h后尾尖采血測(cè)隨機(jī)血糖,血糖≥16.7 mmol/L則視為糖尿病模型建立成功。造模成功后繼續(xù)用高糖高脂飼料(配方:66.5%大小鼠維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉)喂食28 d。

2.1.2 背部皮膚潰瘍大鼠模型制備 28 d后麻醉各組大鼠并于腰背正中部剃毛備皮,用直徑為2 cm的印章蘸龍膽紫標(biāo)記圓形切口線。于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)進(jìn)行手術(shù),碘伏消毒剃毛區(qū),鋪無(wú)菌孔巾,沿標(biāo)記線切開(kāi)皮膚,深達(dá)深筋膜層淺層,剪除皮膚組織。紗布?jí)浩戎寡?。一層凡士林紗布和兩層無(wú)菌紗布外敷創(chuàng)口,膠布包扎。

2.2 藥物干預(yù)

各組大鼠于術(shù)后第2天開(kāi)始換藥。換藥方法:碘伏消毒,正常對(duì)照組和模型組大鼠用0.9% 氯化鈉溶液沖洗潰瘍面;拔毒生肌散組大鼠于潰瘍面均勻外敷約6 mg藥粉;一效膏組大鼠于潰瘍面均勻外涂約2 mm厚度藥膏;清創(chuàng)膠組大鼠于潰瘍面均勻外涂約2 mm厚度凝膠。涂藥后均用1層凡士林紗布和2層無(wú)菌紗布外敷創(chuàng)口,膠布包扎固定。每日換藥1次,共治療14天。換藥期間正常對(duì)照組大鼠喂食普通飼料,另4組大鼠繼續(xù)喂食高糖高脂飼料。

2.3 取材

各組大鼠于治療第7天和第14天時(shí)分別測(cè)算潰瘍面愈合率。第7天測(cè)算完成后每組隨機(jī)選取6只大鼠,麻醉處死,無(wú)菌手術(shù)操作,切取潰瘍創(chuàng)面肉芽組織,面積約1 cm×0.5 cm,一半組織浸泡于多聚甲醛溶液,備做(hematoxylin and eosin,HE)染色、Masson染色和CD34免疫組化,另一半組織液氮冷凍后于-80 ℃冰箱凍存,備做Western blot和熒光定量PCR檢測(cè)。第14天時(shí)處死剩余大鼠,具體操作內(nèi)容同第7天。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 潰瘍面愈合率 藥物治療第7天和第14天,分別應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件計(jì)算各組大鼠潰瘍面愈合率。公式如下:潰瘍面愈合率=[(初始潰瘍面積-拍照時(shí)潰瘍面積)/初始潰瘍面積]×100%。

2.4.2 蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色 藥物治療第7天和第14天,分別觀察各組大鼠潰瘍創(chuàng)面區(qū)域的病理學(xué)變化。將固定于多聚甲醛中的組織取出,包埋,切片,脫蠟至水,蘇木素染色,伊紅染色,脫水,封片。分析潰瘍創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞、新生血管、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞等變化。

2.4.3 Masson染色 每組隨機(jī)選取3只大鼠,藥物治療第14天時(shí)采用Masson染色觀察潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中真皮層膠原纖維的沉積情況。采用Aipathwell軟件分析膠原纖維陽(yáng)性面積比。公式如下:膠原纖維陽(yáng)性面積比=陽(yáng)性面積/組織面積×100%。

2.4.4 CD34免疫組化染色 每組隨機(jī)選取3只大鼠,評(píng)估藥物治療第14天時(shí)潰瘍創(chuàng)面肉芽組織的血管新生情況。將包埋好的蠟塊切片,脫蠟至水,抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,血清封閉,滴加1:200大鼠CD34一抗,加對(duì)應(yīng)1:100二抗,二氨基苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,細(xì)胞核復(fù)染,脫水,封片。通過(guò)CD34標(biāo)記潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞,陽(yáng)性產(chǎn)物顯示為棕黃色,蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核為藍(lán)色。采用Aipathwell軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率。公式如下:血管內(nèi)皮陽(yáng)性細(xì)胞比率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4.5 Western blot檢測(cè) 藥物治療第7天和第14天,分別檢測(cè)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1、Nrf2的蛋白表達(dá)。取出凍存的樣品進(jìn)行總蛋白提取,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,電泳,轉(zhuǎn)模,5%脫脂奶粉封閉,加入1:1000大鼠Nrf2、Keap1一抗,添加1:5000二抗,顯影,放入成像儀中拍照。

2.4.6 熒光定量PCR檢測(cè) 藥物治療第7天和第14天,分別檢測(cè)各組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1、Nrf2 mRNA的表達(dá)水平。取出凍存樣本,提取總RNA并檢測(cè)濃度,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,配置反應(yīng)體系后加入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠潰瘍面愈合率比較

藥物治療第7天和第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍面愈合率顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組、清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍面愈合率顯著升高(P<0.01)。各治療組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

注:與正常對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01;7天時(shí)每組檢測(cè)12只大鼠,14天時(shí)每組檢測(cè)6只大鼠

3.2 各組大鼠HE染色結(jié)果

藥物治療第7天和第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面區(qū)域可見(jiàn)較多的壞死細(xì)胞碎片(綠色箭頭)、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭);與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組和清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍邊緣可見(jiàn)較多新生的表皮層(藍(lán)色箭頭),肉芽組織中成纖維細(xì)胞與纖維細(xì)胞(黑色箭頭)、新生血管(黃色箭頭)較多,而壞死細(xì)胞碎片、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少,見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織HE染色結(jié)果

3.3 各組大鼠Masson染色結(jié)果

藥物治療第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠愈合的潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中膠原纖維藍(lán)染少,膠原纖維排列紊亂,分布稀疏。與模型組比較,拔毒生肌散、一效膏組和清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中藍(lán)染的膠原纖維沉積較多,排列相對(duì)整齊有序,見(jiàn)圖3。與正常組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織膠原纖維陽(yáng)性面積比顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組、清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織膠原纖維陽(yáng)性面積比顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖3 各組大鼠藥物治療第14天皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織Masson染色結(jié)果 (×200)

注:與正常對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較#P<0.05

3.4 各組大鼠CD34免疫組化檢測(cè)結(jié)果

藥物治療第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中CD34標(biāo)記新生血管較少,管徑較細(xì)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組、清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中CD34標(biāo)記新生血管多,管徑較粗,見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中CD34標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組、清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中CD34標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖6。

圖5 各組大鼠藥物治療第14天皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織CD34免疫組化染色圖(×200)

注:與正常對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組組比較##P<0.01

3.5 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1、Nrf2蛋白檢測(cè)結(jié)果

藥物治療第7天和第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.01),Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組和清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.01),Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖7、圖8。

注:Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)

注:核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)

3.6 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA檢測(cè)結(jié)果

藥物治療第7天和第14天,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.01),Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,拔毒生肌散組、一效膏組和清創(chuàng)膠組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織中Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.01),Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖9。

注:與正常對(duì)照組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01

4 討論

近年來(lái),臨床代謝類疾病患者數(shù)量不斷增加,其中糖尿病性潰瘍已超越創(chuàng)傷性潰瘍,成為慢性潰瘍的主要原因。糖尿病性潰瘍的存在可能導(dǎo)致糖尿病患者面臨嚴(yán)重的致殘和致命后果。在我國(guó),糖尿病皮膚潰瘍患者的特點(diǎn)為高齡、教育水平低、經(jīng)濟(jì)收入有限,血糖控制不佳,并常伴有糖尿病腎病、心血管疾病、視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥。及時(shí)治愈糖尿病皮膚潰瘍對(duì)避免深層組織(如肌腱、肌肉、骨骼)的損傷至關(guān)重要,可進(jìn)一步防止截肢和致殘,對(duì)患者及其家庭具有重要意義[5-6]。

中醫(yī)將糖尿病皮膚潰瘍歸為“脫疽”范疇,《靈樞·癰疽》記載其“發(fā)于足趾,名脫癰。其狀赤黑,死不治;不赤黑,不死。不衰,急斬之,不則死矣”[7]。明代陳實(shí)功在《外科正宗·脫疽》中提到“夫脫疽者,外腐而內(nèi)壞也。此因平昔濃味膏粱熏蒸臟腑,丹石補(bǔ)藥消爍腎水,房勞過(guò)度,氣竭精傷……多致陽(yáng)精煽惑,淫火猖狂,其蘊(yùn)蓄于臟腑者,終成燥熱火癥,其毒積于骨髓者,終為疽毒陰瘡”[8],并記載了解毒濟(jì)生湯、陰陽(yáng)二氣丹、清神散、雌雄霹靂火等方劑,提出可將脫疽分為初期、潰爛期、恢復(fù)期3期,分期治療。中醫(yī)重視外治之法,以祛腐生肌、煨膿長(zhǎng)肉為治療糖尿病皮膚潰瘍的主要治法。拔毒生肌散具有拔毒祛腐、斂瘡生肌、止血止痛的功效。其君藥紅粉、黃丹具有拔毒提膿、生肌斂瘡之效;臣藥輕粉可助君藥拔毒生肌;佐藥?kù)咽唷t甘石和煅龍骨能清熱收濕斂瘡、減君藥毒性;使藥冰片、蟲白蠟可助清熱止血、止痛、消腫生肌之功。查春麗[9]報(bào)道應(yīng)用拔毒生肌散治療糖尿病足感染性潰瘍,療效顯著。路麗艷[10]研究證明爐甘石內(nèi)的鋅成分具有抗氧化應(yīng)激的作用,能夠降低汞對(duì)人體的損害。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射STZ結(jié)合喂食高脂高糖飼料的方法進(jìn)行糖尿病模型復(fù)制,模型大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、毛發(fā)枯黃、精神萎靡的表現(xiàn),且在造模后第28天體質(zhì)量降低,血糖升高,說(shuō)明模型復(fù)制成功。使用拔毒生肌散治療后,糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合率、皮膚潰瘍?nèi)庋拷M織膠原纖維陽(yáng)性面積比例明顯高于模型組,提示拔毒生肌散對(duì)糖尿病皮膚潰瘍具有顯著的治療作用。另外本研究選用一效膏和清創(chuàng)膠作為治療方案對(duì)照,結(jié)果顯示拔毒生肌散、一效膏與清創(chuàng)膠對(duì)糖尿病皮膚潰瘍的治療效果相當(dāng)。一效膏是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑,由“瘡?fù)酢蓖跗啡鶆?chuàng),臨床用于治療糖尿病足、褥瘡等慢性創(chuàng)面,臨床療效顯著[11-13]。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)一效膏能夠上調(diào)創(chuàng)面肉芽組織中Ⅰ型膠原與纖維結(jié)合蛋白的表達(dá),促進(jìn)CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子 (hypoxia inducible factor,HIF)-1α、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的基因表達(dá),促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合[14-16]?？祷轄柷鍎?chuàng)膠主要成分為羥甲基纖維素鈉、藻酸鈣和純化水,可以使慢性創(chuàng)口自溶性清創(chuàng)并濕潤(rùn)環(huán)境,促進(jìn)肉芽的生長(zhǎng)和上皮細(xì)胞的爬行?？祷轄柲z與中醫(yī)的祛腐生肌藥功效相似,臨床廣泛應(yīng)用于糖尿病性潰瘍、壓瘡等慢性創(chuàng)面的治療[17-18]。與此兩種陽(yáng)性對(duì)照藥比較,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明拔毒生肌散對(duì)創(chuàng)面的愈合也具有促進(jìn)作用。

糖代謝紊亂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)破壞DNA結(jié)構(gòu)、氧化蛋白質(zhì)、降解細(xì)胞外基質(zhì)成分導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。糖尿病皮膚潰瘍的患者體內(nèi)出現(xiàn)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡現(xiàn)象,氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重。Keap1/Nrf2通路是抗氧化應(yīng)激的通路,也是糖尿病皮膚潰瘍實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn),多種藥物通過(guò)調(diào)控此通路促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍的愈合[20-23]。拔毒生肌散對(duì)模型大鼠肉芽組織中Keap1和Nrf2的蛋白與mRNA表達(dá)具有較好的調(diào)節(jié)作用,可能通過(guò)抗氧化的Keap1/Nrf2通路促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍的愈合。另外糖尿病大鼠模型的潰瘍創(chuàng)面表現(xiàn)為慢性創(chuàng)面特點(diǎn):炎癥明顯,肉芽組織少,肉芽色灰白,易出血。其潰瘍面愈合率明顯低于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色、Masson染色和CD34免疫組化結(jié)果均顯示模型組與糖尿病患者皮膚潰瘍病理表現(xiàn)相似。拔毒生肌散組相對(duì)糖尿病模型組大鼠組織病理學(xué)改善明顯,提示拔毒生肌散具有消炎、生肌、促進(jìn)毛細(xì)血管新生的作用。

綜上所述,拔毒生肌散可以通過(guò)降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)成纖維細(xì)胞和膠原纖維的沉積、促進(jìn)血管新生以及調(diào)控抗氧化的Keap1/Nrf2通路等方面促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合。今后計(jì)劃結(jié)合創(chuàng)面濕性愈合理論,進(jìn)一步研究拔毒生肌散的水凝膠制劑,使這一清代名方能夠結(jié)合現(xiàn)代制藥工藝,提高療效,造福廣大糖尿病皮膚潰瘍等慢性創(chuàng)面患者。