芍藥湯通過PPARγ調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路對潰瘍性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)證腸纖維化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

吳東升 ，李嫣紅 ，陽玉婷 ，謝念佳 ，張彧 ，蘆易 ，曹暉

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜和黏膜下層炎癥為特征的慢性疾病，局限于結(jié)腸，并伴有隱窩和隱窩膿腫[1]，屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種。由于長期慢性腸道炎癥刺激，患者UC相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率逐漸增加[2]。UC病程長，治療難度大，患者可能需要終身治療[3]。目前UC治療策略主要通過免疫抑制控制疾病進(jìn)展，包括美沙拉嗪、糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤和生物制劑等，但大多數(shù)UC患者癥狀無法持續(xù)緩解[4]。此外，由于生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，全球UC患者數(shù)量迅速增加，亟需探索安全有效的治療措施[5]。腸纖維化是IBD發(fā)展過程中不可避免的過程，被認(rèn)為是腸道組織對于慢性炎癥和過度損傷的、不可逆的傷口愈合反應(yīng)。UC患者腸纖維化可導(dǎo)致腸壁硬度增加，引起如結(jié)腸動力異常、肛門直腸功能障礙、直腸急迫和尿失禁等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[6]。防治甚至逆轉(zhuǎn)腸纖維化已成為臨床治療UC亟待解決的問題[7]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腸纖維化形成的重要機(jī)制之一[8]，EMT在UC腸纖維化中的作用和調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明，研究表明，TGF-β/Smads信號通路在調(diào)節(jié)EMT中發(fā)揮重要作用[9]，從TGF-β/Smads信號通路研究EMT在腸纖維化形成中的作用可能為UC腸纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。過氧化物酶體增殖物激活物受體（PPAR）γ通過抑制TGF-β/Smads活化，減少促炎因子轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而下調(diào)過度免疫反應(yīng)，PPARγ過表達(dá)可抑制組織纖維化的發(fā)展，對組織纖維化有保護(hù)作用[10]。

芍藥湯出自《素問病機(jī)氣宜保命集》，是臨床治療UC的代表方之一，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血等功效。課題組前期研究表明，芍藥湯可以調(diào)節(jié)腸道免疫功能，通過下調(diào)促炎因子和上調(diào)抗炎因子調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，減輕腸道炎癥[11-16]。本實(shí)驗(yàn)建立UC濕熱內(nèi)蘊(yùn)證大鼠模型，觀察芍藥湯通過PPARγ調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路對UC腸纖維化EMT的影響，進(jìn)一步明確其治療UC的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

60只雄性SD大鼠（160±10）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004，動物質(zhì)量合格證號430727211101295026。飼養(yǎng)于溫度24～26 oC、濕度40%～60%環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審批（ZYFY20210615）。

1.2 藥物及制備

芍藥湯（白芍30 g，當(dāng)歸、黃連、黃芩各15 g，大黃9 g，檳榔、木香、甘草各6 g，肉桂5 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)該院鄧桂明主任藥師鑒定為正品。所有飲片混勻，加8倍量雙蒸水浸泡2 h，大火煮沸后用小火煎煮0.5 h，重復(fù)1次（加6倍量雙蒸水），合并煎液，1 500 r/min（離心半徑13.5 cm）離心10 min，過濾，濾液濃縮至原藥材濃度為1.1 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪緩釋顆粒，上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號210401，0.5 g/袋。精密稱取美沙拉嗪緩釋顆粒4.2 g，研成細(xì)粉后溶于10 mL蒸餾水，配制成0.42 g/mL美沙拉嗪溶液。

1.3 主要試劑與儀器

2,4,6 -三硝基苯磺酸（TNBS，德國Sigma 公司，批號3LBD6811V），HE染色試劑盒（上海碧云天，批號C0105），兔抗鼠白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10 抗體（北京博奧森生物，批號分別為BS-4539R、bs-6761R），α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白抗體（Alpha Applied Bioscience 公 司， 批 號 分 別 為A23873、A13873），PPARγ、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、p-Smad抗體（湖南艾方生物科技有限公司，批號分別為AF11066、AF03634、AF00903），兔抗鼠β-actin抗體（Immunoway公司，批號為YM3028），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢賽維爾有限公司，批號GB25301）。KD-BM BL型組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），WD-9405C 型電泳儀、DYCZ-24DN型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠），RM2235型精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica公司），YD-AB型組織攤烤片機(jī)（浙江益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

60只大鼠隨機(jī)抽取10只作為正常組，剩余50只采用復(fù)合病因（高糖高脂飲食+濕熱環(huán)境+免疫干預(yù)+TNBS）建立UC濕熱內(nèi)蘊(yùn)證大鼠模型。在普通飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，予大鼠200 g/L蜂蜜水自由飲用，油脂15 g/kg與52%白酒20 mL/kg交替灌胃20 d，并置于人工氣候箱（溫度35 ℃、濕度95%，6 h/d），造模第6、20日于腹股溝、背部及左、右側(cè)足跖皮下注射40 mg/kg抗原乳化液，第21 日大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后用石蠟油潤滑0.4 mm直徑聚乙烯軟管插入直腸，深度8 cm，注入5%TNBS（75 mg/kg）+50%乙醇0.25 mL，再將大鼠提尾倒置60 s，使藥液充分停留[11]。造模第28日，觀察大鼠毛發(fā)、精神狀況、活動量、大便性狀、便血情況、飲食量、體質(zhì)量變化等，取2只大鼠HE染色觀察結(jié)腸黏膜病理改變及炎癥程度，綜合判斷造模是否成功。

2.2 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥對照組（美沙拉嗪）和芍藥湯低、中、高劑量組，每組8只。造模第28日開始給藥，芍藥湯低、中、高劑量組給藥劑量分別為11.1、22.2、44.4 g/kg，西藥對照組為0.42 g/kg，灌胃體積10 mL/kg，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)14 d。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥后禁食24 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，低溫迅速剖取距肛門上約8～10 cm結(jié)腸組織，以生理鹽水沖洗，濾紙吸干，取0.5 cm結(jié)腸組織放于4%多聚甲醛中，剩余結(jié)腸組織于-80 ℃冰箱保存。

2.4 結(jié)腸形態(tài)觀察

自肛門處向上取結(jié)腸（8±2）cm，沿縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)。

2.5 免疫組化檢測

剪取0.5 cm結(jié)腸組織，放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制片，切片二甲苯溶液脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液處理，用0.5%Triton X-100透化20 min，3%H2O2溶液孵育，5%牛血清白蛋白封閉20 min，滴加IL-6、IL-10、α-SMA、E-鈣黏蛋白一抗（1∶500），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，切片加羊抗兔IgG（1∶1 000），37 ℃孵育20 min，經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片后，顯微鏡下觀察并拍照，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，采用Image-Pro Plus軟件測定積分光密度和陽性表達(dá)面積，計算平均光密度（積分光密度/陽性表達(dá)面積）。

2.6 Western blot檢測

結(jié)腸組織用裂解緩沖液提取蛋白，通過12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h，按1∶1 000加入PPARγ、TGF-β1、p-Smad一抗，4 ℃孵育過夜，按1∶2 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，暗室曝光，用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。Image J軟件測定目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值，以二者比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 芍藥湯對模型大鼠一般狀況及結(jié)腸組織損傷的影響

干預(yù)結(jié)束后，正常組大鼠一般狀況良好，攝食、飲水量正常，毛發(fā)光澤，活動敏捷，大便正常；模型組大鼠精神沉郁，攝食、飲水量減少，毛發(fā)欠光澤，活動減少，精神萎靡，喜蜷縮、扎堆，大便不成形、臭穢、黏膩夾帶少許膿血，尿黃，肛溫升高，符合濕熱內(nèi)蘊(yùn)證相關(guān)表現(xiàn)；各給藥組大鼠癥狀好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)恢復(fù)，攝食、飲水量增加，膿血便減少甚至消失，活動量增加，小便較清澈，肛溫降低。結(jié)腸組織肉眼觀察可見，模型組部分腸管狹窄或腸壁增厚變硬，血管紋理模糊，結(jié)腸黏膜嚴(yán)重充血、水腫、糜爛，部分可見小潰瘍；西藥對照組及芍藥湯低、中、高劑量組結(jié)腸黏膜損傷情況明顯改善，結(jié)腸黏膜表面欠光滑，腸黏膜水腫、糜爛減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)

4.2 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10、α-平滑肌肌動蛋白、E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、α-SMA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），IL-10、E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織IL-6、α-SMA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），IL-10、E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與芍藥湯低劑量組比較，芍藥湯高劑量組IL-6、α-SMA表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10、E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖2～圖5。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-10、α-SMA、E-鈣黏蛋白表達(dá)比較（±s，平均光密度）

表1 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-10、α-SMA、E-鈣黏蛋白表達(dá)比較（±s，平均光密度）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01；與芍藥湯低劑量組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

E-鈣黏蛋白0.004 0±0.000 6 0.001 7±0.000 5##0.002 7±0.000 3&&0.002 5±0.000 6&0.002 9±0.000 5&&0.003 3±0.000 8&&*組別正常組模型組西藥對照組芍藥湯低劑量組芍藥湯中劑量組芍藥湯高劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8 IL-6 0.034 1±0.001 7 0.040 8±0.003 1##0.024 1±0.003 2&&0.023 4±0.002 0&&0.019 0±0.001 3&&0.017 5±0.001 7&&*IL-10 0.016 9±0.000 9 0.007 6±0.000 7##0.012 2±0.000 5&&0.011 2±0.001 3&&0.012 3±0.001 7&&0.014 1±0.000 6&&*α-SMA 0.014 6±0.001 1 0.031 3±0.002 8##0.022 9±0.002 6&&0.025 4±0.000 8&&0.020 8±0.002 0&&*0.016 0±0.001 3&&**

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-10陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織α-SMA陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

4.3 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸組織過氧化物酶體增殖物激活物受體γ、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、p-Smad蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織PPARγ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組結(jié)腸組織PPARγ 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與芍藥湯低劑量組比較，芍藥湯中、高劑量組PPARγ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），芍藥湯高劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），芍藥湯中劑量組p-Smad蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖6、表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織PPARγ、TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織PPARγ、TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，&&P＜0.01；與芍藥湯低劑量組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組西藥對照組芍藥湯低劑量組芍藥湯中劑量組芍藥湯高劑量組p-Smad 0.243±0.025 0.359±0.017##0.303±0.024&&0.286±0.022&&0.256±0.007&&*0.269±0.011&&只數(shù)8 8 8 8 8 8 PPARγ 0.405±0.041 0.213±0.042##0.337±0.053&&0.328±0.026&&0.361±0.024&&*0.395±0.026&&**TGF-β1 0.322±0.035 0.697±0.099##0.483±0.077&&0.554±0.077&&0.488±0.091&&0.431±0.027&&*

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織PPARγ、TGF-β1、p-Smad蛋白免疫印跡

5 討論

反復(fù)腸道炎癥可觸發(fā)IBD患者黏膜愈合反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腸道內(nèi)沉積，形成腸纖維化[17]。研究發(fā)現(xiàn)，UC患者結(jié)腸切除標(biāo)本大多存在一定程度的黏膜下纖維化[18-19]。研究表明，EMT與腸纖維化有關(guān)[20]，EMT是上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，是一種復(fù)雜的動態(tài)現(xiàn)象，伴隨著上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白喪失和間充質(zhì)特征蛋白包括α-SMA增加。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去緊密連接轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生大量ECM沉積在腸內(nèi)，導(dǎo)致腸腔變窄[21]。目前普遍認(rèn)為，EMT 可通過誘導(dǎo)ECM 產(chǎn)生促進(jìn)腸纖維化形成[22-23]。

UC屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“痢疾”等范疇，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證是其急性期的主要證型，其實(shí)質(zhì)可能為濕熱膠結(jié)，潛伏于內(nèi)，致濕熱蘊(yùn)腸，脂膜血絡(luò)受傷，氣血不調(diào)。濕為陰邪，其性重濁黏滯，以致UC纏綿難愈；熱為陽邪，其性炎上，易致瘡瘍，熱破血行，可致UC痢下赤白膿血。芍藥湯為清熱劑，可清臟腑熱、清熱燥濕、調(diào)氣和血等，是臨床治療UC濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的代表方，方中以黃連、黃芩為君藥，取其清熱燥濕之功，入大腸除病因，并配以大黃，清中有泄，泄中有清，使?jié)駸岱e滯從大便去。本研究中，模型組大鼠精神萎靡，喜蜷縮、扎堆，大便不成形、臭穢，黏膩夾帶少許膿血，尿黃，肛溫升高，符合濕熱內(nèi)蘊(yùn)證相關(guān)表現(xiàn)。結(jié)腸組織肉眼可見纖維化程度較為明顯，同時促炎因子IL-6表達(dá)升高，抗炎因子IL-10表達(dá)降低，EMT標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)明顯升高，E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯降低，提示復(fù)合病因（高糖高脂飲食+濕熱環(huán)境+免疫干預(yù)+TNBS）造模引起濕熱蘊(yùn)結(jié)，致氣血不暢，郁結(jié)成塊，促進(jìn)UC大鼠腸纖維化進(jìn)展。與模型組比較，各給藥組大鼠濕熱內(nèi)蘊(yùn)證表現(xiàn)減少甚至消失，結(jié)腸組織肉眼可見纖維化程度明顯減輕，IL-6、α-SMA表達(dá)降低，IL-10、E-鈣黏蛋白表達(dá)升高，提示芍藥湯可減輕腸道炎癥，抑制EMT，從而抑制腸纖維化進(jìn)展。

實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β/Smads通路在促進(jìn)腸纖維化中起著至關(guān)重要的作用[24]。TGF-β被視為EMT的最佳表征啟動子，Smad3 缺失或Smad7 過表達(dá)能破壞TGF-β/Smads信號通路，抑制組織纖維化[25]。PPARγ是核受體，被認(rèn)為是參與組織纖維化的新分子，PPARγ過表達(dá)可抑制組織纖維化[26]。此外，PPARγ激動劑可減弱包括腸道在內(nèi)的多個器官的纖維化，而這些抗纖維化作用被PPARγ選擇性拮抗劑消除[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸組織PPARγ蛋白表達(dá)較正常組明顯降低，TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)明顯升高；各給藥組結(jié)腸組織PPARγ蛋白表達(dá)較模型組明顯升高，TGF-β1、p-Smad蛋白表達(dá)明顯降低，提示芍藥湯可能通過上調(diào)PPARγ 表達(dá)，下調(diào)TGF-β、p-Smad 蛋白表達(dá)，抑制EMT，從而抑制UC濕熱內(nèi)蘊(yùn)證大鼠腸纖維化進(jìn)展。

綜上所述，芍藥湯可減輕UC濕熱內(nèi)蘊(yùn)證大鼠腸纖維化，并呈一定劑量依賴性，其可能通過促進(jìn)PPARγ表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads信號通路，抑制EMT，進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化作用。