• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組人CC16蛋白改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺功能及其機制*

    2023-11-02 10:14:18楊曉雪栗馨洋王海龍
    中國病理生理雜志 2023年10期
    關鍵詞:氣道小鼠功能

    郭 民, 李 婷, 楊曉雪, 高 睿, 栗馨洋, 王海龍△, 龐 敏△

    (1山西醫(yī)科大學實驗動物中心,山西 太原 030001;2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,呼吸疾病防治與基礎研究山西省重點實驗室,山西 太原 030001;3山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究中心,山西 晉中030600)

    慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,且隨著發(fā)病率的升高其死亡率亦有所增加[1]。COPD 的特征是呼吸道持續(xù)性損傷,引起氣道重塑,并伴有肺實質的破壞,進而導致呼氣困難、氣體潴留、肺通氣過度和運動時呼吸短促,隨著時間的推移,引起肺功能加速下降[2]。香煙煙霧(cigarette smoke, CS)誘發(fā)肺泡上皮細胞和內皮細胞衰老而參與COPD 的發(fā)生發(fā)展[3-4],因此,降低COPD 患者肺部上皮細胞或內皮細胞衰老,將是改善COPD 患者肺功能的一種有益嘗試。

    CC16 (club cell secretory protein 16)是棒狀細胞(club cells)分泌的具有肺組織特異性的蛋白質,具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等生物學作用[5-6]。CC16基因缺失的小鼠更易罹患COPD[7];與健康人相比,COPD 患者支氣管肺泡灌洗液及血清中CC16也呈下降狀態(tài)[8-9],提示CC16 在COPD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本課題組前期應用重組CC16 蛋白滴鼻COPD 模型小鼠,可顯著降低小鼠氣道炎癥,減輕COPD 小鼠肺組織病理損傷[10],然而重組CC16 蛋白對COPD 模型小鼠肺功能改善和肺組織細胞衰老的干預作用及機制還未闡明。因此,本研究擬應用重組人CC16 蛋白(recombinant human CC16, rhCC16)滴鼻干預COPD 模型小鼠,觀察小鼠肺功能、肺組織病理損傷及肺組織細胞衰老狀況,并對其機制進行初步研究。

    材 料 和 方 法

    1 實驗動物

    清潔級健康BALB/c 雄性小鼠(4~6 周齡)40 只,體重為20~22 g,購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心[生產(chǎn)許可號:SCXK(晉)2019-0004,使用許可證號:SYXK(晉)2019-0007]。適應性飼養(yǎng)1 周后進行實驗,相關實驗動物操作獲得山西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

    2 試劑和儀器

    rhCC16 由本實驗室自主純化[10],用PBS 稀釋至使用濃度進行實驗。紅塔山牌香煙(煙氣煙堿量0.9 mg,焦油量10 mg,煙氣CO 量11 mg)購自云南玉溪卷煙廠;逆轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;總RNA 提取試劑盒購自北京賽文創(chuàng)新生物科技有限公司;兔抗P16多克隆抗體和兔抗P21 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;兔抗p-P38多克隆抗體和兔抗磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, p-ERK1/2)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology;免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

    D30 微量核酸檢測儀(Eppendorf);Quant Studio 3 實時熒光定量PCR 儀(Thermo Fisher Scientific);PFT 肺功能檢測系統(tǒng)(上海塔旺智能科技);JXFSTPRP 高通量快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

    3 實驗方法

    3.1 實驗分組 將40 只經(jīng)過適應性飼養(yǎng)的小鼠隨機均分為對照組、COPD 模型組、COPD+rhCC16 組、COPD+PBS 組,每組10 只。對照組作為空白對照不加任何干預,使其自由進食飲水;其余各組小鼠均采用被動吸煙法制備COPD 穩(wěn)定期小鼠模型[11],每日吸入煙霧1次,每次使用10支香煙,每周6 d,持續(xù)24周。COPD+rhCC16 組于熏煙16 周開始,在熏煙前2 h 給予小鼠雙側滴鼻rhCC16(2.5 μg/g),COPD+PBS組則使用等體積(20 μL)的PBS雙側滴鼻,每日1次,持續(xù)干預8周。

    3.2 小鼠外觀行為學觀察及肺功能檢測 實驗期間每日觀察各組小鼠被毛、精神狀態(tài)及飲食情況等;小鼠肺功能檢測:小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)進行深度麻醉,將小鼠固定于小鼠解剖臺,暴露氣管,使用配套軟管從口腔插入氣管,細線扎緊固定后,待小鼠無呼吸抵抗后上機檢測,記錄相應肺功能參數(shù)數(shù)值[0.3 秒內用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 s, FEV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity, FVC)、肺順應性(dynamic compliance, Cdyn)及氣道阻力(airway resistance, Raw)]。

    3.3 小鼠肺組織形態(tài)學觀察 肺功能檢測完畢后,打開胸腔,暴露雙肺,觀察小鼠肺組織外觀情況,將左肺置于4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水,透明,石蠟包埋,切片,行常規(guī)HE 染色,高倍鏡下隨機選取5 個視野觀察細胞,拍照并分析各組小鼠肺組織病理改變。

    3.4 RNA 提取和RT-qPCR 將小鼠右肺取出,稱取30 mg肺組織用高通量快速研磨儀進行研磨,得到肺組織勻漿后,吸取上清液,按照試劑說明書提取各組小鼠肺組織總RNA。按試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA;qPCR 反應體系為10 ng cDNA、2× M5PCR預混液10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 補足至20 μL。qPCR 反應程序為:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40 個循環(huán);95℃ 15 s,60℃1 min,95℃ 15 s,60℃ 15 s。采用2-ΔΔCt計算各基因mRNA 的相對表達水平,并對結果進行統(tǒng)計學分析。引物由北京中美泰和科技有限公司合成。P16 上游引物序列為5'-GCTGGGTGGTCTTTGTGTA-3',下游引 物 序列為5'-TGCCATTCCTTTCCTGTC-3';P21 上游引物序列為5'-AGTGTGCCGTTGTCTCTTC-3',下游引物序列為5'-AGTCAAAGTTCCACCGTTCT-3';GAPDH 上游引物序列為5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3',下游引物序列為5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。

    3.5 免疫組織化學 肺組織切片脫蠟至水,梯度酒精進行水化(酒精濃度從低到高),3% H2O2孵育30 min,微波爐內抗原修復,待液體冷卻至室溫后PBS洗3 次,滴加5% BSA 封閉后,分別與P16 抗體(1∶100)、P21 抗體(1∶100)、p-P38 抗體(1∶100)和p-ERK1/2 抗體(1∶100)于4℃孵育過夜,次日PBS 洗滌3次,滴加二抗,PBS洗滌3次,DAB工作液顯色,于顯微鏡下觀察顯色情況,流水沖洗,蘇木素復染,流水沖洗,1%鹽酸酒精分化10 s,流水沖洗反藍,脫水,樹脂封片,顯微鏡下觀察染色情況并采集圖像,使用ImageJ 軟件分析免疫組化陽性染色面積占總細胞面積百分率。

    4 統(tǒng)計學分析

    采用GraphPad Prism 8.00 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組之間采用獨立樣本t檢驗進行比較,三組及三組以上的組間比較采用單因素方差分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 rhCC16改善COPD小鼠被毛及行為

    對照組小鼠被毛有光澤,活潑好動,精神狀態(tài)良好,呼吸平緩均勻,無打斗現(xiàn)象;模型組小鼠毛發(fā)稀疏暗黃且無光澤,部分小鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象,熏煙時喜扎堆蜷縮于角落,精神狀態(tài)不佳,煩躁不安,易出汗,呼吸急促,伴有張口呼吸,飼養(yǎng)過程中常有打斗現(xiàn)象發(fā)生。rhCC16 干預組小鼠被毛未顯著改善,打斗減少,亦喜歡扎推,但呼吸趨于平緩均勻;PBS 組小鼠被毛及行為與模型組相同。

    2 rhCC16有效改善COPD小鼠肺功能

    與對照組相比,COPD 小鼠FEV0.3/FVC 比值降低(P<0.05),氣道阻力增加(P<0.05),肺順應性降低(P<0.05);與COPD 模型組相比,rhCC16干預組小鼠FEV0.3/FVC 比值和肺順應性均升高(P<0.05),而氣道阻力降低(P<0.05),而PBS 組小鼠各項指標與COPD組相比均無顯著差異(P>0.05),見圖1。

    Figure 1.Detection of the lung function in different groups.A: forced expiratory volume in 0.3 s (FEV0.3)/forced vital capacity(FVC); B: airway resistance (Raw); C: lung dynamic compliance (Cdyn).Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;#P<0.05, ##P<0.01 vs COPD group.圖1 各組小鼠肺功能檢測

    3 rhCC16可減輕COPD小鼠肺部損傷

    對照組小鼠肺組織呈正常的淡粉紅色,表面光滑;COPD 組小鼠肺組織因長時間吸入香煙煙霧而呈暗紅色,并且肺表面可見充血灶,有深紅色瘀斑(白色箭頭所示);與COPD 組相比,rhCC16 組小鼠肺組織顏色有所恢復,充血灶、紅色瘀斑減少;但PBS 組小鼠肺組織與COPD 組形態(tài)和顏色相似(圖2A)。HE 染色顯示,對照組小鼠肺泡大小均勻,結構清晰,氣道粘膜上皮結構完整;COPD 組小鼠氣道壁破裂塌陷,肺泡大小不均勻,多呈不規(guī)則擴大,形成肺大泡,管腔狹窄,管壁增厚,炎癥細胞浸潤;rhCC16 組小鼠肺泡結構有所恢復,肺大泡減少,炎癥細胞減少;PBS組小鼠肺組織與COPD組形態(tài)相似(圖2B)。

    Figure 2.Morphological and pathological changes of the lung tissues in various groups of mice.A: morphological changes of the lungs in mice (congestive lesions and ecchymosis were observed on the surface of lung tissues in COPD mice, while rhCC16 treatment alleviated the aforementioned pathological injuries); B: HE staining of mice lung tissues (scale bar=200μm; the airway wall of COPD mice ruptured and collapsed, accompanied by the formation large alveoli and infiltration of inflammatory cells, while rhCC16 treatment mitigated the aforementioned pathological injuries; white arrow indicates red ecchymosis, red arrow indicates inflammatory cells, and green arrow indicates rupture and collapse of the airway wall).圖2 各組小鼠肺組織形態(tài)及病理學改變

    4 rhCC16可抑制COPD小鼠肺組織細胞衰老

    RT-qPCR 結果顯示,與對照組相比,COPD 小鼠肺組織P16 和P21 的mRNA 表達水平均有顯著升高(P<0.05),rhCC16 干 預 可 顯 著 降 低P16 和P21 mRNA 表達(P<0.05),而二者在PBS組與COPD組小鼠間無顯著差異(P>0.05),見圖3。

    Figure 3.The mRNA expression of P16 (A) and P21 (B) in mouse lung tissues of various groups detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs COPD model group.圖3 RT-qPCR檢測各組小鼠肺組織P16和P21的mRNA水平

    免疫組織化學染色結果顯示,與對照組相比,COPD 小鼠肺組織P16、P21 和衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)表達顯著升高(P<0.05),rhCC16 干預可顯著降低P16、P21 和SA-β-Gal 表達(P<0.05),而三者在PBS組與COPD組小鼠間無顯著差異(P>0.05),見圖4。

    Figure 4.Immunohistochemical staining of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal), P16 and P21 in mouse lung tissues of various groups(scale bar=200 μm).Senescence markers such as SA-β-Gal, P16 and P21 in lung tissues of COPD mice were increased, while rhCC16 treatment significantly reduced their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs COPD group.圖4 各組小鼠肺組織P16、P21及SA-β-Gal表達的免疫組化檢測

    5 rhCC16 抑制COPD 小鼠肺組織細胞中的P38 MAPK/ERK1/2信號通路

    免疫組織化學染色顯示,與對照組相比,COPD小鼠肺組織細胞p-P38 和p-ERK1/2 染色陽性率顯著增加(P<0.05),rhCC16 干預可顯著降低p-P38 和p-ERK1/2 表達(P<0.05),而二者在PBS 組與COPD 組小鼠間無顯著差異(P>0.05),見圖5。

    Figure 5.The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in mouse lung tissues of various groups detected by immunohistochemical staining (scale bar=200 μm).The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in lung tissues of COPD mice were elevated, while rhCC16 treatment significantly decreased their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs COPD group.圖5 免疫組織化學染色檢測各組小鼠肺組織細胞p-P38和p-ERK1/2水平

    討 論

    COPD 以炎癥和肺組織結構變化導致的氣流持續(xù)受限為主要特征,是一種無法治愈的慢性肺病,包括慢性支氣管炎、肺氣腫和小氣道阻塞,在某些個體中還伴有肺心病和呼吸衰竭,給患者和社會都帶來了巨大負擔,而吸煙被認為是引發(fā)COPD 的主要環(huán)境因素。炎癥、氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細胞衰老被認為是COPD 的發(fā)生發(fā)展的主要機制[12,13]。截至目前,COPD 仍然沒有特異性治療方法,改善氣流受限的治療方案仍然是主要途徑。在COPD 急性發(fā)作期,抗生素、吸入性皮質類固醇、支氣管擴張劑在臨床上被廣泛應用,但此類藥物的副作用亦不容忽視。

    CC16 是一種分子量約為10 kD 的同型二聚體蛋白質,由非纖毛細支氣管上皮細胞在遠端氣道中分泌,具有肺組織特異性[14]。體內外研究表明,CC16具有抗炎、免疫調節(jié)和抗氧化作用[15]。臨床研究報告指出,COPD 患者及肺功能缺陷患者的血液和氣道中CC16 水平降低[16]。此外,低血清CC16 水平加重肺上皮細胞損傷,減弱1 秒內用力呼氣量(FEV1)[17-18]。課題組前期研究顯示,重組大鼠CC16蛋白質通過抑制核因子κB 降低炎癥因子表達進而改善COPD 模型小鼠肺部炎癥及病理損傷[11],且可以降低脂多糖誘導的大鼠氣道上皮細胞炎癥因子表達[19]。而其對延緩細胞衰老,改善COPD 小鼠肺功能方面的研究還未見報道。

    目前,構建COPD 模型小鼠的經(jīng)典方法是通過香煙煙霧誘導,此方法可以誘導出許多COPD 典型病理特征,例如氣道阻力增加、肺順應性降低、肺活量下降、肺通氣受限等[20]。在COPD 模型小鼠研究中,F(xiàn)EV0.3、FVC 及FEV0.3/FVC 是常用的評價小鼠肺功能的指標[21]。本研究中,COPD 模型小鼠經(jīng)6 月被動吸煙被成功制備,與正常對照組小鼠相比,F(xiàn)EV0.3/FVC 比值降低,氣道阻力升高并且肺順應性降低,而rhCC16 干預組小鼠的各項指標均得到改善,表明rhCC16能夠有效緩解香煙煙霧刺激引起的肺功能下降。Laucho-Contreras 等[22]的研究顯示,CC16基因缺失小鼠的肺組織在發(fā)育中自發(fā)地向肺老化表型轉化,并伴有COPD樣肺部病變,表明CC16對小鼠肺組織結構和功能的影響可能通過衰老途徑。而我們的研究顯示給予rhCC16干預可以降低COPD 小鼠肺組織衰老標志物β-半乳糖苷酶、P16 和P21 的表達,提示rhCC16 可通過抑制細胞衰老進而發(fā)揮改善COPD小鼠肺功能的作用,進一步明確了CC16-細胞衰老在COPD 發(fā)生發(fā)展中的作用,為認識COPD 的發(fā)生機制提供實驗證據(jù)。

    COPD 主要由香煙煙霧、空氣過敏原、空氣污染物和細菌感染誘發(fā),而在呼吸道內,這些環(huán)境因子都能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族[23]。MAPKs 包含三種主要信號分子即ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶和P38 MAPK。MAPKs 通過磷酸化調節(jié)與衰老相關蛋白質的活性來控制細胞反應程序。P38 MAPK 和ERK1/2的激活(磷酸化)可以促進多種因素誘導的細胞衰老[24-25],且二者的激活 也 參與了COPD 的發(fā)生發(fā)展[20,26-27]。鑒此,我們檢測了各組小鼠肺組織p-P38 MAPK 和p-ERK1/2 的表達,結果顯示rhCC16 可以有效降低COPD小鼠肺組織p-P38和p-ERK1/2的含量,提示rhCC16 可能通過抑制P38 MAPK 和ERK1/2 信號級聯(lián)通路延緩香煙煙霧誘導的細胞衰老。我們前期研究顯示CC16 可以抑制核因子κB 活性,降低炎癥因子表達,減輕小鼠COPD 癥狀[11]。本項工作則從MAPK-細胞衰老通路觀察了CC16 在COPD 模型小鼠肺組織的表達,顯示出CC16 在COPD 模型小鼠中通過多條信號通路發(fā)揮多種生物學效應。

    綜上所述,rhCC16 可能通過抑制P38 MAPK 和ERK1/2信號級聯(lián)通路延緩香煙煙霧誘導的COPD 小鼠肺組織細胞衰老,改善COPD小鼠肺功能。

    猜你喜歡
    氣道小鼠功能
    也談詩的“功能”
    中華詩詞(2022年6期)2022-12-31 06:41:24
    小鼠大腦中的“冬眠開關”
    《急診氣道管理》已出版
    《急診氣道管理》已出版
    《急診氣道管理》已出版
    《急診氣道管理》已出版
    米小鼠和它的伙伴們
    關于非首都功能疏解的幾點思考
    Avp-iCre轉基因小鼠的鑒定
    加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細胞凋亡的保護作用
    日本三级黄在线观看| 国产99久久九九免费精品| 天天添夜夜摸| 啦啦啦免费观看视频1| 久久精品91蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 免费观看精品视频网站| 狂野欧美激情性xxxx| 香蕉国产在线看| 久久久久九九精品影院| 亚洲精华国产精华精| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 丁香欧美五月| 日韩免费av在线播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| 满18在线观看网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲成人国产一区在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美成人午夜精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一区福利在线观看| 91在线观看av| 国产免费男女视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 成人欧美大片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜老司机福利片| 国产色视频综合| 十八禁人妻一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美午夜高清在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美+亚洲+日韩+国产| 岛国在线观看网站| 999精品在线视频| 午夜免费成人在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产成人欧美| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产高清激情床上av| 亚洲精品在线美女| 91九色精品人成在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品影院6| 久久亚洲精品不卡| 最好的美女福利视频网| 亚洲美女黄片视频| 乱人伦中国视频| 色哟哟哟哟哟哟| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av五月六月丁香网| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品欧美一区二区三区在线| 99久久精品国产亚洲精品| 一级作爱视频免费观看| 两性夫妻黄色片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日韩精品中文字幕看吧| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人三级做爰电影| 成年女人毛片免费观看观看9| 国内精品久久久久久久电影| 久99久视频精品免费| x7x7x7水蜜桃| 无人区码免费观看不卡| 一区二区三区精品91| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩av在线大香蕉| 69av精品久久久久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产三级黄色录像| 一进一出好大好爽视频| 久久亚洲精品不卡| 精品国产一区二区三区四区第35| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99国产精品一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 啦啦啦韩国在线观看视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲avbb在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 怎么达到女性高潮| 可以在线观看毛片的网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日本在线视频免费播放| 午夜福利在线观看吧| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中国美女看黄片| 丁香欧美五月| 久久香蕉精品热| 黄片播放在线免费| 一进一出抽搐动态| 大陆偷拍与自拍| 亚洲美女黄片视频| 热re99久久国产66热| 性欧美人与动物交配| 黄频高清免费视频| 国产av一区二区精品久久| 一本综合久久免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费看十八禁软件| www.999成人在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品,欧美在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产精品999在线| 99re在线观看精品视频| 亚洲美女黄片视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲美女黄片视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美一区二区精品小视频在线| 91精品国产国语对白视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久伊人香网站| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品野战在线观看| 亚洲专区字幕在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产精品二区激情视频| 久久中文字幕人妻熟女| 国产高清有码在线观看视频 | 午夜福利成人在线免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一级毛片精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美成人午夜精品| 国产三级在线视频| 搡老岳熟女国产| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲电影在线观看av| 日本五十路高清| 国产主播在线观看一区二区| 国产成人精品在线电影| 男女下面插进去视频免费观看| 一级片免费观看大全| 国产熟女午夜一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 99香蕉大伊视频| 中出人妻视频一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 香蕉久久夜色| 岛国在线观看网站| 亚洲熟女毛片儿| 乱人伦中国视频| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品久久久人人做人人爽| videosex国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品欧美一区二区三区在线| 看免费av毛片| 曰老女人黄片| 少妇粗大呻吟视频| 国产男靠女视频免费网站| 黄片小视频在线播放| 亚洲无线在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 无人区码免费观看不卡| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美日本视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲自拍偷在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 欧美大码av| 精品高清国产在线一区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品影院久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品影院久久| 午夜福利欧美成人| av视频免费观看在线观看| 久久久久久国产a免费观看| а√天堂www在线а√下载| 99精品久久久久人妻精品| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 成人免费观看视频高清| 一级,二级,三级黄色视频| aaaaa片日本免费| 久久热在线av| 久久久久久久久中文| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产成人av教育| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费观看精品视频网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 不卡一级毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲熟妇熟女久久| a级毛片在线看网站| 久久这里只有精品19| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产成人系列免费观看| 日本欧美视频一区| 国产精品九九99| av网站免费在线观看视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 人人澡人人妻人| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 在线免费观看的www视频| 中亚洲国语对白在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人免费观看视频高清| 久久精品成人免费网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美一级a爱片免费观看看 | 美国免费a级毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 最新在线观看一区二区三区| 男人操女人黄网站| 亚洲人成电影观看| a级毛片在线看网站| 亚洲中文av在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久久久午夜电影| 亚洲无线在线观看| 亚洲无线在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 两个人免费观看高清视频| 亚洲九九香蕉| 国产麻豆69| 久久热在线av| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产主播在线观看一区二区| 黄频高清免费视频| 免费不卡黄色视频| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品在线美女| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲精华国产精华精| svipshipincom国产片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波多野结衣高清无吗| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产片内射在线| 在线观看66精品国产| 欧美午夜高清在线| 麻豆av在线久日| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人精品在线电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 看免费av毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 老鸭窝网址在线观看| 久久伊人香网站| 色老头精品视频在线观看| 国产三级在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 黄色片一级片一级黄色片| 男男h啪啪无遮挡| 午夜免费成人在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 免费在线观看亚洲国产| 国产亚洲精品av在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲久久久国产精品| 黄片大片在线免费观看| 性少妇av在线| 国产精品 欧美亚洲| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品卡一卡二卡四卡免费| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 老汉色∧v一级毛片| 老司机靠b影院| 人人妻人人澡欧美一区二区 | av网站免费在线观看视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 一级a爱视频在线免费观看| 欧美性长视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 91老司机精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲视频免费观看视频| 国产精华一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 国产麻豆69| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 高清在线国产一区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲av美国av| 69精品国产乱码久久久| netflix在线观看网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产成人精品在线电影| 欧美一级毛片孕妇| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩有码中文字幕| 丝袜美足系列| 久久久国产欧美日韩av| 一夜夜www| 老司机福利观看| 黄色成人免费大全| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 人人妻人人澡人人看| 不卡av一区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 一本久久中文字幕| 一级毛片精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本a在线网址| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 青草久久国产| 黄色毛片三级朝国网站| 精品人妻1区二区| 51午夜福利影视在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 在线观看66精品国产| 国产黄a三级三级三级人| 美女 人体艺术 gogo| 天天一区二区日本电影三级 | 国产麻豆成人av免费视频| 国产免费男女视频| 一进一出好大好爽视频| bbb黄色大片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲成人国产一区在线观看| 无人区码免费观看不卡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费av毛片视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| av欧美777| 69精品国产乱码久久久| 一本综合久久免费| 国产一卡二卡三卡精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久精品国产综合久久久| 午夜福利一区二区在线看| 一进一出抽搐动态| 手机成人av网站| 一进一出好大好爽视频| 久久久久九九精品影院| 美女 人体艺术 gogo| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本五十路高清| 91精品三级在线观看| a在线观看视频网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 搞女人的毛片| 国产一区二区三区视频了| 日韩精品免费视频一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 成年人黄色毛片网站| 亚洲avbb在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 老司机靠b影院| 国产精品,欧美在线| 99riav亚洲国产免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产午夜精品久久久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 一个人免费在线观看的高清视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜福利高清视频| 日本 欧美在线| 咕卡用的链子| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区激情短视频| 欧美一级毛片孕妇| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 色播在线永久视频| 两个人免费观看高清视频| 日韩有码中文字幕| 午夜激情av网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| √禁漫天堂资源中文www| 看黄色毛片网站| 国产一卡二卡三卡精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲电影在线观看av| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 后天国语完整版免费观看| 国产乱人伦免费视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人系列免费观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 一级a爱视频在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 夜夜爽天天搞| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 级片在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | av片东京热男人的天堂| 黄色成人免费大全| 午夜福利免费观看在线| 九色国产91popny在线| 无遮挡黄片免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲av电影在线进入| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩精品免费视频一区二区三区| x7x7x7水蜜桃| 成人av一区二区三区在线看| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜福利免费观看在线| 91老司机精品| 欧美午夜高清在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜久久久久精精品| 国产成人系列免费观看| 久久久国产成人免费| 在线观看www视频免费| 又大又爽又粗| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久人妻熟女aⅴ| 91九色精品人成在线观看| 久久香蕉国产精品| 国产精品一区二区免费欧美| 他把我摸到了高潮在线观看| 色av中文字幕| 精品久久久久久,| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av免费在线观看网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美在线一区亚洲| 一本大道久久a久久精品| or卡值多少钱| 国产1区2区3区精品| 久久精品影院6| 午夜免费鲁丝| 久久中文看片网| 国产精品永久免费网站| 午夜a级毛片| 欧美一级毛片孕妇| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费在线观看亚洲国产| 午夜精品国产一区二区电影| 制服诱惑二区| 欧美日韩黄片免| a在线观看视频网站| 少妇 在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | ponron亚洲| 69精品国产乱码久久久| 国产成人欧美| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产亚洲av高清不卡| 在线观看午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩av在线大香蕉| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久中文字幕人妻熟女| 国产熟女xx| 黑丝袜美女国产一区| 丁香六月欧美| 久久香蕉国产精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久性视频一级片| 国产精品免费视频内射| 中国美女看黄片| 欧美日本视频| 久久精品国产清高在天天线| www.熟女人妻精品国产| 国产精品久久久av美女十八| 欧美乱妇无乱码| av免费在线观看网站| 亚洲精华国产精华精| 老司机在亚洲福利影院| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| a级毛片在线看网站| 黄色成人免费大全| 亚洲精华国产精华精| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 一级黄色大片毛片| 免费看十八禁软件| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一区二区三区精品91| 麻豆久久精品国产亚洲av| 好男人在线观看高清免费视频 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久香蕉激情| 精品电影一区二区在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 久99久视频精品免费| 亚洲 国产 在线| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品在线观看二区| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲第一av免费看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| avwww免费| 国产人伦9x9x在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 丁香六月欧美| 亚洲中文av在线| 香蕉久久夜色| 亚洲av熟女| 欧美不卡视频在线免费观看 | 少妇 在线观看| 久久久久国内视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 操出白浆在线播放| 此物有八面人人有两片| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲自拍偷在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜福利一区二区在线看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 嫩草影视91久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 岛国在线观看网站| 大型av网站在线播放| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩大码丰满熟妇| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲少妇的诱惑av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 97碰自拍视频| 亚洲成国产人片在线观看| 一a级毛片在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 一区二区三区精品91| 国产亚洲av高清不卡| 99在线视频只有这里精品首页|