抑制TRAF6的E3泛素連接酶活性減輕野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)*

許正秋， 邱莉華， 陳 睿， 馬 倩， 李冰冰

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科，江蘇 南京 210008）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）是一類嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的心血管疾病，表現(xiàn)為肺血管重塑和肺血管后負(fù)荷進(jìn)行性升高，嚴(yán)重時(shí)引起患者右心功能衰竭甚至死亡［1］。肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和凋亡抵抗導(dǎo)致肺小動脈中膜增厚甚至閉塞是PH 的主要病理機(jī)制之一［2-3］。盡管目前臨床上使用的血管擴(kuò)張藥物主要包括前列環(huán)素類似物和前列環(huán)素受體激動劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5 抑制劑和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑等藥物在一定程度上對PH 患者的癥狀有緩解作用［4］，但對于改善患者的遠(yuǎn)期生存率效果不佳，仍需要進(jìn)一步探討PH 的血管重塑機(jī)制，為靶向治療提供新的策略。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6， TRAF6）是一種能夠介導(dǎo)蛋白間相互作用的適配蛋白以及免疫調(diào)節(jié)受體家族的下游因子［5］，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)其N 端的RING 結(jié)構(gòu)域具有E3 泛素連接酶的活性，能夠介導(dǎo)其自身在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的多聚泛素化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）是一類細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明磷酸化的STAT3能促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡抵抗，導(dǎo)致PH 的發(fā)生［7］；研究發(fā)現(xiàn)在荷瘤小鼠模型中，來源于腫瘤組織的髓源性抑制細(xì) 胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs）中TRAF6 的表達(dá)顯著上調(diào)，且TRAF6 能夠與STAT3 結(jié)合，介導(dǎo)STAT3 的K63 連接的多聚泛素化及STAT3的磷酸化激活來調(diào)節(jié)MDSCs 的免疫抑制活性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［8］。但在PH 中TRAF6 的E3 泛素連接酶活性是否對STAT3的磷酸化激活至關(guān)重要目前還不清楚。因此，本研究探討了PH中TRAF6的泛素連接酶活性對STAT3激活和肺血管重構(gòu)的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

雄性SD大鼠42只，6~8周齡，質(zhì)量為180~220 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0007］。維持環(huán)境溫度20~21 ℃，濕度50%~60%，動物采用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食。本研究所有的動物相關(guān)操作均按照動物實(shí)驗(yàn)倫理的規(guī)定進(jìn)行。野百合堿（monocrotaline， MCT）為Sigma 產(chǎn)品；C25-140（TRAF6 特異性E3 泛素連接酶活性抑制劑）購自MedChemExpress；抗TRAF6 抗體（ab33915）為Abcam 產(chǎn)品；抗STAT3 抗體（4904T）及抗p-STAT3 抗體（9145T）為Cell Signaling Technology產(chǎn)品；抗細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體及抗β-actin 抗體為Proteintech 產(chǎn)品；抗K63 ubiquitin 抗體為Cell Signaling Technology 產(chǎn)品。免疫共沉淀試劑盒（2179S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 動物分組及處理

在飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1 周后，將42 只SD 大鼠隨機(jī)分為4 組：對照（control， CON）組，C25-140 組，MCT 組及MCT+C25-140 組。MCT 組及MCT+C25-140 組的大鼠均先在頸后皮下單次注射野百合堿，濃度為2%，劑量為60 mg/kg，建立PH 模型。C25-140 組及MCT+C25-140組大鼠于造模后第14天、21天和28天腹腔注射劑量為9.8 mg/kg的C25-140化合物。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 超聲心動圖檢測 大鼠吸入異氟烷麻醉，體動反應(yīng)消失后仰臥固定于鼠板，固定呼吸面罩，以500 mL/min流量的異氟烷維持，去除胸前毛發(fā)，將耦合劑涂抹于超聲探頭，準(zhǔn)備超聲檢測。脈沖多普勒模式測量肺動脈血流加速時(shí)間（pulmonary arterial acceleration time， PAAT），在心尖四腔切面使用M 超測量三尖瓣環(huán)平面收縮期位移（tricuspid annular plane systolic excursion， TAPSE）。

3.2 肺組織取材 大鼠安樂死后，暴露出雙肺和心臟，剪開左心耳，經(jīng)左心室用肝素生理鹽水對肺循環(huán)持續(xù)進(jìn)行灌注，直至雙肺顏色轉(zhuǎn)白停止灌注。取右肺部分置于-80 ℃保存，左肺用4%多聚甲醛固定24 h，用于之后的病理學(xué)染色。

3.3 大鼠原代肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）分離培養(yǎng) 大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸泡于75%乙醇5 min，于無菌手術(shù)臺上開胸取出肺組織，無菌PBS 沖洗3 次。顯微鏡下分離出肺動脈，剔除血管周圍肺組織、神經(jīng)及筋膜等，分離干凈的血管轉(zhuǎn)移至新10 cm 培養(yǎng)皿中?？v行剪開肺血管，用鑷子輕輕刮拭內(nèi)層，去除內(nèi)皮細(xì)胞層。用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，接種到含1 mL DMEM 培養(yǎng)基（含20%血清、100 U/mL 雙抗）的平皿中，輕搖培養(yǎng)基，使每塊組織塊間間距約為0.8~1.0 cm。靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2 h，待組織貼牢后，緩慢添加DMEM 培養(yǎng)基（含20%血清、100 U/mL 雙抗）完全覆蓋組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞從組織塊周圍爬出。

3.4 HE 染色 將固定好的大鼠肺組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片，用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色，在400倍鏡下觀察各組管徑20~150 μm的肺中小動脈形態(tài)，使用Image-Pro Plus 6.0 測量肺小動脈中膜厚度（media thickness， MT）和血管外徑（external diameter， ED），計(jì)算肺小動脈中膜厚度百分比（中膜厚度百分比=2MT/ED×100%）。

3.5 Western blot 稱取50~100 mg 的新鮮肺組織，用預(yù)冷的PBS 清洗，去除多余水分后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液，剪碎組織后勻漿，冰上靜置30 min，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。使用相應(yīng)濃度的SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加Ⅰ抗（TRAF6和cyclin D1抗體，1∶5 000；STAT3和p-STAT3 抗體，1∶2 000；β-actin 抗體，1∶10 000），置于4 ℃搖床上孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應(yīng)的HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫下孵育1.5 h，TBST 再次洗滌后進(jìn)行曝光，留取圖片，使用ImageJ 分析條帶的灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值之比反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。

3.6 免疫共沉淀 取CON 組及PH 組大鼠PASMCs各一皿，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。取適量CON 組和PH 組細(xì)胞蛋白上清液，加入STAT3抗體工作液（稀釋度1∶200）和IgG 工作液，置于側(cè)擺搖床，4 ℃孵育過夜。采用免疫共沉淀法測定STAT3 的K63 泛素化水平。將免疫沉淀后的上清使用相應(yīng)濃度的SDS-PAGE 進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加Ⅰ抗K63 ubiquitin 抗體（稀釋度1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應(yīng)的HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫下孵育1.5 h，TBST 再次洗滌后進(jìn)行曝光，留取圖片。

3.7 免疫熒光染色 新鮮取材的肺組織用OCT進(jìn)行包埋，切成7 μm 的厚度。用0.5% Triton X-100 溶液進(jìn)行通透，PBS 洗滌3 次。5% BSA 溶液室溫封閉35 min。甩去封閉液，加入適量TRAF6（稀釋度1∶50）和STAT3（稀釋度1∶1 000）的Ⅰ抗混合液，4 ℃過夜。孵育相應(yīng)的Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后，加DAPI（含抗熒光淬滅劑）封片。熒光顯微鏡下觀察肺中小動脈中目標(biāo)蛋白的定位和表達(dá)，拍照并存圖。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行分析處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，配對樣本采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本比較時(shí)采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腹腔注射C25-140對PH大鼠肺血管重構(gòu)的影響

與CON 組比較，MCT 組大鼠PAAT 和TAPSE 明顯縮短（P<0.05），中小肺動脈中膜明顯增厚（P<0.05），α-SMA 熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P<0.05）；MCT+C25-140組大鼠PAAT 和TAPSE 相對MCT 組增加，肺中小動脈中膜增厚程度減?。≒<0.05），α-SMA 熒光強(qiáng)度降低（P<0.05），見圖1和2。

Figure1.Comparison of PAAT， TAPSE and related indexes of vascular remodeling in rats before and after modeling.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs CON group； &&P<0.01 vs MCT group.圖1 造模前后大鼠PAAT、TAPSE及血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的比較

Figture 2.HE staining and α-SMA immunofluorescence of small pulmonary vessels in rats （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs CON group； &P<0.05 vs MCT group.圖2 大鼠肺組織HE染色和α-SMA免疫熒光結(jié)果

2 PH大鼠PASMCs中STAT3的K63泛素化情況

與CON 組PASMCs 比 較，PH 大 鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化水平明顯升高，見圖3。

Figure 3.K63 ubiquitin level of STAT3 in pulmonary artery smooth muscle cells.圖3 肺動脈平滑肌細(xì)胞中STAT3的K63泛素化情況

3 腹腔注射C25-140 對PH 大鼠肺組織TRAF6 表達(dá)、STAT3磷酸化及cyclin D1表達(dá)的影響

與CON 組比較，MCT 組大鼠肺組織TRAF6 蛋白水平、p-STAT3/STAT3 比值及cyclin D1 蛋白水平明顯升高（P<0.05），而MCT+C25-140 組大鼠肺組織中TRAF6 蛋白水平、p-STAT3/STAT3 比值及cyclin D1蛋白水平相對于MCT 組有所降低（P<0.05），見圖4。

Figure 4.The protein expression of TRAF6， STAT3， p-STAT3 and cyclin D1 in each group.Mean±SD.n=6.*P<0.05， **P<0.01 vs CON group； &P<0.05， &&P<0.01 vs MCT group.圖4 肺組織TRAF6、STAT3、p-STAT3及cyclin D1的表達(dá)

4 腹腔注射C25-140 對PH 大鼠肺組織TRAF6 與STAT3共定位影響

與CON 組相比，MCT 組大鼠肺血管中膜TRAF6和STAT3 存在共定位，經(jīng)C25-140 處理以后，兩者的共定位明顯減弱，見圖5。

Figure 5.Immunofluorescence of TRAF6 and STAT3 in lung tissue of rats in each group （scale bar=50 μm）.圖5 肺血管TRAF6與STAT3的共定位情況

討 論

PH 是一種嚴(yán)重的心血管疾病，被稱為心血管系統(tǒng)中的癌癥，其主要病理特征是肺動脈中膜平滑肌細(xì)胞的異常增殖，內(nèi)膜和外膜的纖維化，原位血栓形成、叢狀病變以及周圍血管炎癥浸潤，引起肺動脈持續(xù)性異常收縮，肺血管阻力和肺動脈壓升高，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡［9］。在本研究中，采用單次皮下注射野百合堿的方式構(gòu)建大鼠PH 模型，造模后PH 大鼠PAAT 和TAPSE 明顯縮短，中小肺動脈中膜厚度明顯增加，α-SMA 熒光強(qiáng)度明顯增加，提示造模成功。

TRAF6 是一種具有E3 泛素連接酶活性和免疫調(diào)節(jié)雙重作用的蛋白，已有研究表明TRAF6 在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌以及胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程［10-13］。本研究發(fā)現(xiàn)MCT 誘導(dǎo)的PH 大鼠肺組織中TRAF6 也存在明顯升高，通過使用化合物C25-140 抑制TRAF6 的泛素連接酶活性后，TRAF6的蛋白水平有所下降，可能是由于TRAF6 泛素連接酶活性受到抑制時(shí)，功能失活的TRAF6 自身穩(wěn)定性有所降低，繼而被降解，但具體的降解機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。STAT3 是一種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄因子，參與正常細(xì)胞的分化、增殖和血管生成等多種生命活動［14］。STAT3 靜息狀態(tài)下通常以非活性狀態(tài)定位于細(xì)胞的胞質(zhì)當(dāng)中，磷酸化是STAT3激活的重要步驟，STAT3 一旦被激活即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核當(dāng)中，充當(dāng)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄激活劑［15-16］。早在2012年，Wei等［17］就通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明在哺乳動物細(xì)胞中E3 泛素連接酶TRAF6 能夠與STAT3 結(jié)合，負(fù)調(diào)控TAK2-STAT3 信號通路的激活，下調(diào)STAT3 下游的靶基因CRP 和ACT 的表達(dá)；另外，Ruan 等［18］的研究證實(shí)了鼠沙門氏桿菌感染宿主細(xì)胞時(shí)可以特異性誘導(dǎo)TRAF6 發(fā)生泛素化，隨后TRAF6 在STAT3 的SH2 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)K63 連接的泛素化，促使STAT3 被招募到細(xì)胞膜，發(fā)生磷酸化激活，以利于沙門氏桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。在本研究當(dāng)中，在TRAF6的E3泛素連接酶活性受到抑制時(shí)，STAT3 的磷酸化水平明顯降低，且免疫熒光共定位的結(jié)果也顯示抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時(shí)肺動脈上STAT3 與TRAF6 的共定位情況明顯減弱。由此可見，通過抑制TRAF6 的E3 泛素連接酶活性，可能影響TRAF6與STAT3 的相互結(jié)合，從而影響STAT3 的磷酸化激活過程。

cyclin D1 是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在有絲分裂的G1期向S 期轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵靶點(diǎn)［19］。多項(xiàng)研究表明cyclin D1是STAT3 下游靶點(diǎn)，能夠被 STAT3 直接調(diào)控。Deng等［20］發(fā)現(xiàn)在腸上皮細(xì)胞中STAT3 能夠調(diào)節(jié)下游cyclin D1 的表達(dá)，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖。另外Zhou等［21］發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞當(dāng)中STAT3 也能夠直接靶向下游的cyclin D1，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。cyclin D1 的過表達(dá)與PH 發(fā)病密切相關(guān)，Zhu等［22］發(fā)現(xiàn)在PH 發(fā)病過程中，血小板衍生生長因子能夠誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞中cyclin D1 的過表達(dá)，引起PASMCs增殖。類似地，Xiao等［23］發(fā)現(xiàn)在缺氧誘導(dǎo)的PH 大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)中cyclin D1 明顯過表達(dá)。在本研究中，當(dāng)抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時(shí)，STAT3 的磷酸化水平下降，下游的cyclin D1 水平也隨之改變，故PH 疾病當(dāng)中TRAF6-STAT3-cyclin D1信號通路激活并調(diào)控肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，TRAF6 分子上調(diào)介導(dǎo)STAT3 泛素化后磷酸化激活，磷酸化的STAT3隨后激活下游cyclin D1 等細(xì)胞周期因子的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡抵抗，肺動脈中膜增厚，肺血管重構(gòu)。當(dāng)抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時(shí)，STAT3 的磷酸化水平降低，抑制STAT3與TRAF6相互作用，最終可降低大鼠肺動脈壓力、增強(qiáng)右心的收縮力和緩解肺血管中膜增厚，故TRAF6作為一種E3泛素連接酶直接介導(dǎo)STAT3 泛素化后磷酸化激活的機(jī)制可能在PH的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。