血管緊張素II通過抑制原癌基因c-SKI表達促進小鼠高血壓性心肌纖維化*

呂忠英， 李紅建， 張 穎， 王 娟

（新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830001）

心肌纖維化（myocardial fibrosis）是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的必然過程，是其發(fā)病率和病死率的獨立危險因素［1］。高血壓病可以引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system， RAS）激活、內(nèi)皮素以及醛固酮分泌增多，是促進心肌纖維化的主要原因之一。高血壓心肌纖維化的關(guān)鍵原因是促進和抑制纖維化細胞因子的失衡，是一個復雜病理過程，與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiolensin-aldosterone system， RAAS）、氧化應激、炎性反應、多種細胞因子、血管內(nèi)皮功能障礙、微小RNA 等多種因素存在聯(lián)系［2-5］。靶向干預或者逆轉(zhuǎn)高血壓引起心肌纖維化是緩解心肌纖維化病理進程的重要環(huán)節(jié)。

血管緊張素II（angiotensin II， Ang II）是RAS 系統(tǒng)中重要的效應分子之一［6］。Ang II 增加可引起包括心臟成纖維細胞增生在內(nèi)的多種高血壓性病理改變［7］。在培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞及心肌細胞中加入Ang II，誘導轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）表達，從而促進成纖維細胞有絲分裂和心肌細胞的原癌基因表達［6］。原癌基因c-SKI（cellular Sloan-Kettering Institute）屬于Ski 家族成員，是從Sloan-Kettering 逆轉(zhuǎn)錄病毒中分離出的v-Ski原癌基因的細胞同源物，編碼c-SKI核蛋白。在成纖維細胞發(fā)育與分化、腫瘤發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、代謝疾病、臟器纖維化等均具有重要作用［8-11］。Cunnington 等［12］發(fā)現(xiàn)，過表達c-SKI降低心肌成纖維細胞膠原蛋白的合成、分泌和收縮功能，誘導細胞凋亡，降低其生存能力。另外，c-SKI 通過上調(diào)Meox2 表達抑制ZEB2 的功能，減少TGF-β1 誘導的肌成纖維細胞生成，抑制心肌纖維化［13］。有研究表明，c-SKI 可以誘導肌成纖維細胞凋亡［14］。然而c-SKI 表達變化對Ang II 誘導的高血壓性心肌纖維化的影響及作用機制報道較少，有待研究。

本研究通過Ang II 注射小鼠或處理人冠狀動脈內(nèi)皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs），構(gòu)建高血壓性心肌纖維化動物和細胞模型。在觀察內(nèi)源性c-SKI表達變化的基礎上，通過給予外源性慢病毒c-SKI過表達載體，探討外源性過表達c-SKI對高血壓所致心肌纖維化細胞的作用。本研究旨在探尋靶向干預高血壓性心肌纖維化的關(guān)鍵因子，為心肌纖維化的預防和治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，8~10 周齡，18~22 g，共12 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。HCAECs 和DMEMF12培養(yǎng)液購于ATCC。

2 主要實驗試劑

Ang II 購自北京索萊寶科技有限公司；c-SKI、CD31、Twist、Smad2/3、平滑肌蛋白22（smooth muscle protein 22， SM22）、I 型膠原（collagen type I， Col I）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）抗體購自Abcam；Snail 和p-Smad2/3 抗體分別購自arigo Biolaboratoriers 和Cell Signaling Technology；Ecadherin、N-cadherin和vimentin抗體購自Affinity。

3 主要方法

3.1 小鼠高血壓纖維化模型的構(gòu)建 將12 只雄性C57BL/6J 小鼠隨機分成兩組：PBS 組（n=6）和Ang II組（n=6），分別利用滲透壓微泵皮下植入小鼠慢性持續(xù)給予等體積的PBS 和Ang II（1.4 mg·kg-1·d-1），給藥4 周，采用尾袖法檢測小鼠血壓，并評價心肌肥厚［15］。處死小鼠，取心臟組織進行病理檢測。

3.2 HE 染色 取小鼠心臟組織經(jīng)0.9% NaCl 溶液清洗并固定后，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟至水、蘇木精染色液染色、伊紅復染、脫水封片，鏡檢觀察并拍照。

3.3 Masson 染色 取各組小鼠心臟組織經(jīng)0.9%NaCl 溶液清洗并固定后，加入Masson 復合液（蘇木精水溶液-Masson藍化液-麗春紅品紅染色液）進行染色，經(jīng)磷鉬酸溶液漂洗切片、苯胺藍染色液復染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察并拍照［16］。

3.4 免疫組織化學染色 將石蠟包埋的小鼠心臟組織切片，經(jīng)脫蠟/復水、0.01%枸櫞酸鈉緩沖液浸泡、3% H2O2滅活、5%牛血清白蛋白封閉、Ⅰ抗孵育、相應Ⅱ抗孵育、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）或3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbazole， AEC）顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察并拍照。

3.5 細胞培養(yǎng)及分組 將HCAECs 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行后續(xù)實驗。用不同濃度（0、5、10 和15 μmol/L）Ang II處理HCAECs。用10 μmol/L Ang II處理HCAECs，細胞分為PBS 組和Ang II 組。使用Lipofectamine 3000將vector 質(zhì)粒和c-SKI過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCAECs，并聯(lián)合10 μmol/L Ang II 處理，細胞分為vector 組、c-SKI組、Ang II+vector 組和Ang II+c-SKI組。收集細胞用于進一步分析。

3.6 CCK-8 實驗 細胞按實驗分組進行處理后，接種至96 孔板［（1~5）×107cells/L］，分別培養(yǎng)0、24 和48 h，棄去上清液，每孔加入10 μL CCK-8 并繼續(xù)孵育4 h，酶標儀測定450 nm處吸光度。

3.7 免疫熒光染色 將HCAECs接種于內(nèi)置細胞爬片的24 孔板中，按實驗分組處理后，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定30 min、0.1% Triton X-100 室溫通透10 min、PBS 沖洗、5% PBS-牛血清白蛋白室溫封閉30 min、Ⅰ抗4 ℃孵育過夜、熒光標記的Ⅱ抗室溫避光孵育40 min、1 mg/L DAPI染核、90%甘油或抗猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，或4 ℃避光保存。

3.8 Western blot 實驗 提取組織和細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，取適量蛋白樣品進行電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育Ⅰ抗（c-SKI、CD31、Col I、α-SMA、Twist、p-Smad2/3、Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 抗體，1∶1 000；Snail 抗體，1∶500），室溫孵育Ⅱ抗2 h，顯影拍照，使用ImageJ 軟件進行灰度分析并計算相對表達量。

3.9 流式細胞術(shù) 收集細胞沉淀，加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，按1∶1 比例加入annexin V-FITC 和propidium iodide 各5 μL 并輕微混勻，室溫避光反應5~15 min后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Ang II誘導小鼠高血壓性心肌纖維化

與PBS組相比，Ang II組小鼠尾動脈壓力顯著增加（P<0.01），見圖1A；HE 和Masson 染色結(jié)果顯示，Ang II組小鼠心肌細胞肥大，心肌纖維化和心肌細胞周圍藍色膠原纖維顯著增加、心肌內(nèi)小血管周圍可見明顯膠原纖維沉積，見圖1B、C；免疫組織化學染色結(jié)果表明，Ang II 組小鼠心肌組織c-SKI、CD31 和SM22 表達顯著下調(diào)（P<0.01），見圖1D~F；Western blot 結(jié)果顯示，Ang II 組小鼠心肌組織CD31 表達顯著下調(diào)（P<0.01），Col I 和α-SMA 表達顯著上調(diào)（P<0.01），見圖1G。

2 Ang II 對HCAECs 形態(tài)、活力和c-SKI 表達的影響

隨著Ang II 濃度的增加，HCAECs 形態(tài)發(fā)生改變，細胞連接松散，見圖2A；10和15 μmol/L Ang II處理48 h 后，細胞活力顯著下降（P<0.01），見圖2B。選用10 μmol/L作為Ang II的最低有效劑量進行后續(xù)實驗。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與PBS 組相比，Ang II（10 μmol/L）組HCAECs 中c-SKI 表達顯著下調(diào)（P<0.01），見圖2C。

Figure 2.Effects of angiotensin II（Ang II） treatment on the morphological changes， viability and c-SKI expression in human coronary artery endothelial cells （HCAECs）.A： the morphological changes of HCAECs observed by microscopy （scale bar=50μm）； B： the cell viability measured by CCK-8 assay； C： immunofluorescence staining of c-SKI in HCAECs treated with 10 μmol/L Ang II （scale bar=40 μm）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs 0 μmol/L Ang II or PBS group.圖2 Ang II處理對HCAECs形態(tài)、活力和c-SKI表達的影響

3 Ang II 對HCAECs 中CD31、α-SMA 及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）通路蛋白表達的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與PBS 組相比，Ang II組HCAECs 中CD31 表達顯著下調(diào)，α-SMA 顯著上調(diào)（P<0.01），見圖3A、B；Western blot 結(jié)果顯示，Ang II組HCAECs 中CD31 表達顯著下調(diào)，Col I、α-SMA、Twist、Snail 和p-Smad2/3 顯著上調(diào)（P<0.01），Smad2/3無顯著差異（P>0.05），見圖3C、D。

Figure 3.Effects of angiotensin II（Ang II） treatment on the expression of CD31， α-smooth muscle actin（α-SMA） and epithelialmesenchymal transition （EMT） pathway proteins in human coronary artery endothelial cells （HCAECs）.A and B： the expression of CD31 and α-SMA in HCAECs detected by immunofluorescence （scale bar=40 μm）； C and D： the protein levels of CD31， collagen type I （Col I）， α-SMA， Twist， Snail， p-Smad2/3 and Smad2/3 in HCAECs detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs PBS group.圖3 Ang II對HCAECs中CD31、α-SMA及EMT通路蛋白表達的影響

4 c-SKI過表達聯(lián)合Ang II處理對HCAECs的影響

CCK-8 結(jié) 果 顯 示，與vector 組 相 比，c-SKI 組HCAECs 的活力顯著上升（P<0.01），Ang II+vector 組細胞活力顯著下降（P<0.01）；與Ang II+vector 組相比，Ang II+c-SKI 組細胞活力顯著升高（P<0.01），見圖4A。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與vector組相比，c-SKI組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01），Ang II+vector組細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與Ang II+vector 組相比，Ang II+c-SKI 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.01），見圖4B。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與vector 組相比，c-SKI 組α-SMA 表達顯著下調(diào)（P<0.01），Ang II+vector 組α-SMA 表達顯著上調(diào)（P<0.01）；與Ang II+vector 組相比，Ang II+c-SKI 組α-SMA 表達顯著下調(diào)（P<0.01），見圖4C。Western blot 結(jié)果顯示，與vector 組相比，c-SKI 組c-SKI、CD31 和E-cadherin 表達顯著上調(diào)（P<0.01），α-SMA、Col I、Twist、Snail、p-Smad2/3、N-cadherin 和vimentin 顯著下調(diào)（P<0.01），Smad2/3無顯著差異（P>0.05），Ang II+vector 組c-SKI、CD31和E-cadherin 表達顯著下調(diào)（P<0.05），α-SMA、Col I、Twist、Snail、p-Smad2/3、N-cadherin 和vimentin 顯著上調(diào)（P<0.01），Smad2/3 無顯著差異（P>0.05）；與Ang II+vector 組相 比，Ang II+c-SKI 組c-SKI、CD31 和Ecadherin 表達顯著上調(diào)（P<0.01），α-SMA、Col I、Twist、Snail、p-Smad2/3、N-cadherin 和vimentin 顯著下調(diào)（P<0.01），Smad2/3 無顯著差異（P>0.05），見圖4D~F。

討 論

心血管疾病是全球慢性非傳染性疾病致死的主要原因之一，其中約有1750 萬非傳染性疾病的死亡是由心血管疾病引起，嚴重威脅著人類的健康，造成沉重的社會負擔［1，17］。慢性心血管疾病的核心病理改變是以心肌肥厚、心肌細胞丟失及心肌組織纖維化為特征的心臟組織異常重構(gòu)。其中，心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的必然過程，與心律失常、心功能障礙甚至心源性猝死密切相關(guān)，是心血管疾病發(fā)病率和病死率的獨立危險因素［1］。因此，基于對心肌纖維化的干預甚至逆轉(zhuǎn)已成為心臟病防治的新靶標［18］。

高血壓病作為心血管疾病不良預后的首要危險因素，是引起心力衰竭的主要原因之一，可以引起RAS 激活、內(nèi)皮素和醛固酮分泌增多，是促進心肌纖維化的主要原因之一。高血壓心肌纖維化的關(guān)鍵原因是促進和抑制纖維化細胞因子的失衡。研究表明，Ang II在高血壓心臟重構(gòu)和心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［19-21］。c-SKI既抑制成纖維細胞表型轉(zhuǎn)換，也促進成纖維細胞增殖［22］。Cunnington等［12］的研究顯示，c-SKI 主要通過改變成纖維細胞表型參與調(diào)控心肌纖維化。然而c-SKI 表達變化對Ang II誘導的高血壓性心肌纖維化的影響及其作用機制報道較少。

給予Ang II，能直接影響心肌，誘發(fā)高血壓，是一種公認的誘導高血壓心肌纖維化的方法［23-24］。本研究通過注射Ang II 構(gòu)建高血壓性心肌纖維化小鼠模型后，小鼠血壓升高，心肌細胞肥大、周圍出現(xiàn)較多藍色膠原纖維、沉積明顯，結(jié)果與研究報道一致［15-16］。Ang II 組CD31 顯著下調(diào)，Col I 和α-SMA 顯著上調(diào)，進一步提示了高血壓性心肌纖維化小鼠模型構(gòu)建成功。在動物體內(nèi)，Ang Ⅱ?qū)е赂哐獕盒募±w維化的同時引起c-SKI 下調(diào)。通過Ang II 處理HCAEC 構(gòu)建細胞模型，結(jié)果與上述動物實驗一致。進一步研究c-SKI對Ang II 誘導的HCAECs 模型的影響，表明過表達c-SKI能部分消除Ang II誘導的HCAECs活力降低，使細胞凋亡率降低，α-SMA、Col I、Twist、Snail、p-Smad2/3、N-cadherin 和vimentin 顯 著 下 調(diào)，c-SKI、CD31 和E-cadherin 顯著上調(diào)。這揭示c-SKI在高血壓心肌纖維化進展中具有重要作用，為高血壓心肌纖維的治療提供了參考資料。

綜上所述，本研究應用Ang II 持續(xù)性輸注形成高血壓心肌纖維化模型，結(jié)果顯示在小鼠體內(nèi)高水平Ang II 導致高血壓纖維化的同時引起心臟組織中c-SKI顯著下調(diào)，而過表達c-SKI能夠減輕Ang II誘導的心肌纖維化。本研究僅探討c-SKI表達變化對心肌纖維化的影響，未對c-SKI表達與心肌纖維化的潛在機制和靶點進行闡釋說明，這些問題需要進一步的實驗來探索。