汗液中葡萄糖的SERS快檢

馮 笛,張凡利,金尚忠

(中國計量大學(xué) 光學(xué)與電子科技學(xué)院,浙江 杭州 310018)

葡萄糖是自然界分布最廣且最重要的一種單糖,也是活細胞的直接能量來源。人體中葡萄糖含量不足會導(dǎo)致低血糖,嚴重時或致記憶力衰退、誘發(fā)癲癇、影響大腦活動致使昏迷等,但可通過改善飲食條件在短期內(nèi)獲得補充。而葡萄糖含量過多則會引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥等。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計,2021年全球糖尿病人數(shù)約為5.37億(20～79歲),其中中國就有約1.4億。糖尿病可引起約100多種并發(fā)癥,如心肌梗死、視網(wǎng)膜病變、糖尿病足等。據(jù)統(tǒng)計,近年來死于糖尿病及其并發(fā)癥的人數(shù)已超過死于艾滋病、結(jié)核病和瘧疾等人數(shù)的總和。而治療糖尿病最重要的也是第一步便是監(jiān)測血糖水平,這將極大地提高患者的生活質(zhì)量,并有助于患者了解自身狀況及預(yù)防并發(fā)癥。

1 葡萄糖檢測方法概述

1.1 酶促方法

目前檢測葡萄糖的臨床方法是血糖檢測,血液樣本被提供在含有氧化酶的條帶或底物上,一般是血糖試紙,然后通過測量酶底物的電學(xué)或光學(xué)變化來監(jiān)測反應(yīng)通量。這種方法是侵入性的,其不僅造成了生理上的損傷和心理負擔,而且血檢可能造成疾病傳播、保存追溯時效短、需要專業(yè)的醫(yī)護人員操作等。尿糖檢測雖然無損,但可能會造成假陽性和假陰性的結(jié)果。目前家用式自測血糖儀的成熟使得血糖監(jiān)測更加方便,但也存在一些缺點,如修飾有氧化酶的試紙壽命一般為兩年,環(huán)境壓力、溫度、氧化等會導(dǎo)致其壽命進一步縮短,且不洗手操作會進一步降低測量準確性。另外,在自行測試規(guī)范且試紙質(zhì)量沒問題的情況下,大量不符合標準的血糖儀被生產(chǎn)出來并投入使用導(dǎo)致檢測結(jié)果的精度很差。

1.2 非酶促方法

基于酶促反應(yīng)的葡萄糖檢測雖然對葡萄糖是特異性的,但是需要定期更換底物和酶等原料。非酶促葡萄糖檢測也是研究的焦點,因為它們增加了檢測的穩(wěn)定性和檢測精度并降低了維護成本[1-3],并有可能無創(chuàng)地檢測葡萄糖[4]。非酶促葡萄糖檢測可分為兩種:基于人工酶的電化學(xué)檢測和物理檢測。人工酶與電化學(xué)檢測相結(jié)合類似于酶促方法,但使用專門的電極表面來代替酶,主要是通過葡萄糖分子和電極之間的電子轉(zhuǎn)移的直流電測量來檢測葡萄糖濃度[4-6]。物理檢測葡萄糖是基于檢測葡萄糖分子的特定性質(zhì),通常是用頻率分辨技術(shù)和光譜學(xué)來完成的。頻率分辨技術(shù)如阻抗和太赫茲光譜等,這些技術(shù)監(jiān)測樣品對調(diào)制電場的響應(yīng)[7]。光譜學(xué)方法包括紅外、熒光和拉曼光譜。光譜學(xué)檢測是由于光與分子的相互作用對其化學(xué)結(jié)構(gòu)非常特定,入射到樣品上的光可能被吸收、透射、反射或散射。

1.3 光譜學(xué)方法

熒光光譜是通過光激發(fā)分子來監(jiān)測可見光的發(fā)射,然而葡萄糖分子不具有熒光特性,因此須和熒光分子結(jié)合來檢測。在和葡萄糖的相互作用下熒光分子的發(fā)射波長會改變,通過信號的變化檢測葡萄糖的濃度[8-10]。紅外光譜研究分子振動對紅外波段范圍內(nèi)輻射的吸收,分子吸收的波長對應(yīng)于分子化學(xué)鍵特定振動和旋轉(zhuǎn)的能量。葡萄糖的紅外光譜檢測具有一些困難和挑戰(zhàn),因為水的吸收峰掩蓋了葡萄糖分子的信號[7,11-12]。拉曼光譜是通過用激光激發(fā)樣品并檢測拉曼散射光來完成的。雖然拉曼信號比紅外弱,但水在拉曼光譜中沒有突出的特征,紅外是在透射中進行的,需要在紅外波長范圍內(nèi)透明的基底,而拉曼光譜測量散射光,因此可以在任何表面上進行,這就使得可以使用增強拉曼信號的專用基底,也就是表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術(shù)。SERS在此所用到的增強機理主要是表面等離激元共振(SPR)[13],它的解釋是處于貴金屬納米粒子之間的局域光電場中(即“熱點”)的物質(zhì),其拉曼信號會被增強約105～106倍。

1.4 SERS檢測葡萄糖的方案

SERS由于其高靈敏和指紋識別的特點,在克服了拉曼光譜缺陷的基礎(chǔ)上已被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)[14-15]、食品安全[16-17]、環(huán)境監(jiān)測[18-19]等領(lǐng)域?；赟ERS檢測葡萄糖總體來說有四種方案,已有眾多科研工作者做出了努力。第一,制備增強因子很高的基底,使得葡萄糖分子的振動信息可直接被極大增強,所測信號也是葡萄糖分子本身的SERS信號[20]。第二,增加葡萄糖分子與基底結(jié)合的親和力[21]。這兩種方案都是針對葡萄糖分子拉曼散射截面小而做出的應(yīng)對方法,雖然也取得了一定的成果,但在實際應(yīng)用中依然存在局限性。第三,應(yīng)用基于硼酸的識別分子功能化表面,葡萄糖可逆地形成硼酸酯,并被捕獲在表面上。這樣,硼酸分子既可以用作葡萄糖識別結(jié)構(gòu),也可以用作拉曼活性分子[22]。第四,基于信號分子的酶促反應(yīng)[23-25],葡萄糖與葡萄糖氧化酶(GOx)反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2會刻蝕修飾有信號分子的銀納米粒子,進而導(dǎo)致信號分子的SERS信號降低,葡萄糖的摩爾濃度與信號分子的SERS信號呈現(xiàn)反比。這種方案也是目前基于SERS檢測葡萄糖的主流方案,本文也基于此開發(fā)了一種銀立方體(Ag cube)基底和酶促反應(yīng)相結(jié)合的汗液中葡萄糖快檢的方法,檢測時間約為7 min,檢測限為0.5 mmol/L。

2 材料與方法

2.1 材料

人工汗液購自上海源葉生物科技有限公司;GOx購自北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、PVP(55 000)、1,5-戊二醇、CuCl2、AgNO3購自中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司;去離子水(18.25 MΩ·cm)。

2.2 Ag cube的合成

溶液a:CuCl2溶液,稱取18 mg的CuCl2溶于50 mL的1,5-戊二醇;溶液b:AgNO3溶液,稱取0.4 g的AgNO3溶于含1 mL溶液a和9 mL的1,5-戊二醇中;溶液c:PVP溶液,稱取0.2 g的PVP(Mw=55 000)溶于10 mL的戊二醇中。溶液b和溶液c需要在冰浴中超聲溶解4 h以上,直至完全溶解,超聲過程中保持冰浴,每隔15 min取出攪拌一下。其中溶液a可配于離心管中,溶液b和c用25 mL錐形瓶配制。

Ag cube制備:首先取干凈烘干的圓底燒瓶加入20 mL的1,5-戊二醇,在193 ℃中恒溫10 min;然后取兩只10 mL注射器,吸入適量的溶液b和溶液c,套上200 μL槍頭和聚四氟管,放在雙通道注射泵上;以500 μL/min的速率開始向恒溫好的戊二醇中滴加溶液b和c;觀察到溶液顏色由無色→淡黃→深黃→暗紅→紅色上面出現(xiàn)灰綠色,根據(jù)灰綠色占液面總面積來判斷粒徑大小(本文平均粒徑為98 nm左右),到所需粒徑大小后,取出反應(yīng)瓶,冰浴使反應(yīng)迅速停止,整個滴加過程需要計時。

2.3 Ag cube上修飾信號分子4-MBA

取200 μL Ag cube膠體并加入800 μL無水乙醇,超聲使其分散均勻,然后6 000 r/min離心8 min;吸取上層清液,并加入1 000 μL無水乙醇如此離心清洗2次,然后用無水乙醇重新定容至1 000 μL;加入100 μL濃度為1 mmol/L的4-MBA(4-MBA配制在無水乙醇中),放置在金屬輪盤上旋轉(zhuǎn)孵育12 h;孵育結(jié)束后,6 000 r/min離心8 min,吸取上層清液,然后用1 000 μL去離子水清洗一次,并再次用水定容至1 000 μL,放置到4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 儀器

使用了日立電子掃描顯微鏡(SEM, HITACHI S-4800, Japan)和便攜式拉曼光譜儀(NTR 785 RP2)。

2.5 葡萄糖檢測原理

基于SERS結(jié)合酶促反應(yīng)檢測葡萄糖的原理見圖1,圖中立方體代表Ag cube,其上修飾有信號分子4-MBA(4-巰基苯甲酸,C7H6O2S)。Ag cube的棱角較多,粒子之間產(chǎn)生的熱點多,當Ag cube膠體與含有葡萄糖的溶液混合并有GOx加入時,會有式(1)所示的反應(yīng)發(fā)生,葡萄糖在GOx的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2,隨后會發(fā)生式(2)所示的反應(yīng),H2O2刻蝕Ag cube產(chǎn)生Ag+。使得棱角分明的Ag cube會在H2O2的刻蝕下變得相對圓滑甚至H2O2足夠多的情況下,Ag cube會完全消失。這意味著Ag cube上修飾的4-MBA的SERS信號也會因為熱點變少而減弱。也即當GOx足量時,葡萄糖越多,4-MBA的SERS信號越低,二者呈反比,可通過4-MBA的信號間接反映葡萄糖的含量。4-MBA的SERS特征峰為1 077 cm-1(與芳香環(huán)呼吸、對稱C—H面內(nèi)彎曲和C—S拉伸有關(guān))和1 587 cm-1(由環(huán)C—C拉伸和不對稱C—H面內(nèi)彎曲引起)[26]。

圖1 基于SERS快速檢測葡萄糖的示意圖Figure 1 Schematic diagram of rapid glucose detection based on SERS

(1)

(2)

2.6 葡萄糖溶液的配制

首先配制100 mmol/L的葡萄糖水溶液,然后繼續(xù)用水逐級稀釋至10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 mmol/L備用。用人工汗液稀釋100 mmol/L的葡萄糖水溶液得到10 mmol/L的葡萄糖溶液,然后繼續(xù)用人工汗液逐級稀釋至5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 mmol/L備用。

3 結(jié)果和討論

3.1 預(yù)實驗

基于檢測葡萄糖的原理,需證明上述等式的成立,即4-MBA的SERS信號的降低是由葡萄糖和GOx之間反應(yīng)而產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube所引起的。設(shè)計了對照實驗:空白1是200 μL水加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的1 mg/mL的GOx,空白2是200 μL的10 mmol/L的葡萄糖溶液加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的水。而對照實驗是200 μL的10 mmol/L的葡萄糖溶液加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的1 mg/mL的GOx。分別在40 min內(nèi)每隔10 min觀察4-MBA的1 587 cm-1處峰面積的變化,如圖2(所有峰面積均通過積分獲得)?？瞻?和2在40 min內(nèi)沒有發(fā)生較大變化,而對照實驗其SERS信號在不斷降低。說明4-MBA的SERS信號的降低是由葡萄糖和GOx的同時存在并發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube引起的。另外,對被刻蝕前后的Ag cube的形貌進行了SEM表征,如圖3,反應(yīng)后的Ag cube確實有被明顯刻蝕的現(xiàn)象。

圖2 葡萄糖和GOx是否發(fā)生反應(yīng)的驗證實驗Figure 2 Validation experiment for glucose and GOx reaction

圖3 Ag cube被刻蝕前后的SEM圖Figure 3 SEM diagram of the Ag cube before and after it is etched

3.2 檢測條件優(yōu)化

在預(yù)實驗中,葡萄糖和GOx之間反應(yīng)的持續(xù)時間較長,因為這是一種需要酶參與的酶促反應(yīng),所以考慮加快此反應(yīng),使其在短時間內(nèi)反應(yīng)完全。加快式(1)所示的反應(yīng)可從GOx的作用條件出發(fā),因為GOx的氧化能力是通過活性單位U來定義的,1 U代表在37 ℃,pH=5.7的條件下,1 min形成1 μmol H2O2所需的酶量。首先考慮高濃度GOx是否可加快反應(yīng)。其次,從GOx的作用條件出發(fā),如溫度,pH等。最后,Ag cube膠體的體積也很重要,體積太大,式(1)產(chǎn)生的H2O2不足以引起4-MBA信號的明顯變化,體積太小,采集光譜時又需增加過多的積分時間。

首先,探究了GOx濃度增加時體系反應(yīng)至穩(wěn)定所需的時間,因為減少其濃度時必定需要更多的時間。在預(yù)實驗中,所用GOx的濃度為1 mg/mL,反應(yīng)至40 min時4-MBA的SERS信號基本穩(wěn)定不變。而GOx的濃度增加至5 mg/mL時,反應(yīng)穩(wěn)定的時間減少至10 min,如圖4(a)(所有與圖4對應(yīng)的光譜圖如圖5),表明增加濃度可以加快反應(yīng),但在考慮成本的情況下并沒有繼續(xù)探究更高濃度GOx的情況。

圖4 優(yōu)化檢測條件Figure 4 Optimize detection conditions

圖5 與圖4相對應(yīng)的SERS光譜圖Figure 5 SERS spectrum corresponding to Figure 4

其次,驗證了將溫度加熱至37 ℃時和不加熱時的區(qū)別。雖然GOx在37～50 ℃時都具有熱穩(wěn)定性,但最佳溫度是37 ℃,且此溫度與人體的體溫最接近,所以沒有探究其他溫度。如圖4(b),設(shè)計了空白和10 mmol/L葡萄糖溶液分別在室溫和37 ℃加熱3 min下的實驗?？梢钥闯?37 ℃加熱情況下,4-MBA的SERS信號在3 min后明顯下降了很多,而不加熱的情況下僅有相對較弱的下降,所以后續(xù)實驗都將采取37 ℃加熱。然后探究了體系pH的影響,通過添加緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)調(diào)節(jié)pH,發(fā)現(xiàn)添加緩沖液會造成Ag cube團聚,以致4-MBA的SERS信號不穩(wěn)定。因為緩沖液中存在很多鹽離子,使Ag cube的團聚不可控,引起了4-MBA的SERS信號忽高忽低,毫無規(guī)律,如圖4(c)。經(jīng)調(diào)研,GOx在pH為4.5～6.5時均可保持相對穩(wěn)定,所以后續(xù)實驗不再加入緩沖液調(diào)節(jié)pH,因為水的pH在6.5左右,也可維持GOx的穩(wěn)定。

最后探究了Ag cube的體積。根據(jù)以上條件優(yōu)化中的經(jīng)驗,探索了Ag cube的體積分別為12.5、25、50、100 μL的情況。如圖4(d),隨著Ag cube的體積的增加,4-MBA的信號無論是空白還是濃度為10 mmol/L的葡萄糖溶液都是增加的,這是符合規(guī)律的,計算空白光譜和10 mmol/L葡萄糖溶液的特征峰面積的比值,比值越大,說明葡萄糖和GOx產(chǎn)生的H2O2取得了最佳的刻蝕效果(因為產(chǎn)生的H2O2量是固定的)。所以,最佳的Ag cube體積為25 μL。

3.3 葡糖糖水溶液的檢測限

上述優(yōu)化過程中均采用溶膠法,即直接采集整個反應(yīng)溶液的SERS光譜,但檢測限(LOD)卻并不理想。后嘗試芯片法進行測試,吸取3 μL溶膠反應(yīng)液滴到渡有金膜的硅片(簡稱芯片)上,但直接采集液滴的SERS光譜與溶膠法一樣效果不佳。所以,考慮將3 μL的液滴烘干,以此規(guī)避掉液體的影響。實驗證明LOD大大降低,同時也對優(yōu)化條件進行了微調(diào),微調(diào)后的條件及順序如下:200 μL不同濃度的葡糖糖水溶液、20 μL的Ag cube、30 μL的GOx(5 mg/mL),充分混勻后在金屬加熱平臺中38 ℃加熱3 min,然后吸取3 μL反應(yīng)溶液滴加到芯片上,將芯片放置到50 ℃加熱臺上烘干,需要6 min。最后,積分2 s采集已烘干芯片的SERS光譜。加上操作步驟需9～10 min,為節(jié)省時間,嘗試不用金屬加熱平臺加熱3 min,直接混勻便吸取3 μL滴加到50 ℃加熱臺上烘干,取得了相同的實驗效果,7 min即可完成檢測。如圖6,誤差棒由3次平行實驗獲得,光譜圖右側(cè)為與之相對應(yīng)的葡萄糖的摩爾濃度,葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L。對葡萄糖的對數(shù)濃度和1 077 cm-1的峰面積做了線性擬合,如圖7(小圖為葡萄糖原始濃度與1 077 cm-1峰面積的濃度曲線),R2為0.95,線性效果良好。

圖6 葡萄糖水溶液的檢測限Figure 6 LOD for aqueous glucose solutions

圖7 葡萄糖水溶液的對數(shù)濃度與4-MBA 1 077 cm-1處SERS峰面積的擬合曲線Figure 7 Fitting curve of the logarithmic concentration of glucose aqueous solution to the SERS peak area at 1 077 cm-1 of 4-MBA

3.4 葡萄糖在人工汗液中的檢測限

在關(guān)于pH優(yōu)化中便提到,鹽類物質(zhì)會引起Ag cube的團聚不可控,汗液中同樣存在大量鹽類物質(zhì),若不對汗液進行前處理,則無法得到理想的結(jié)果。在加熱烘干后,金膜上會出現(xiàn)白色析出物,這正是汗液中存在的大量鹽類物質(zhì)。從快速檢測的目標出發(fā),汗液的前處理不能是復(fù)雜且耗時的,首先想到也是最簡單的方法是稀釋汗液。

在此,把加標后葡萄糖濃度為10 mmol/L的汗液和水分別按照1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例進行稀釋,按照優(yōu)化的條件和步驟進行測試,結(jié)果如圖8,當汗液和水的比例為1∶3和1∶4時獲得了良好效果,不僅誤差較小,而且空白光譜和10 mmol/L葡萄糖的汗液有較好的區(qū)分。但汗液與水的比例為1∶3時是最優(yōu)的,因為稀釋倍數(shù)越多,原始汗液中的葡萄糖也被稀釋越多,產(chǎn)生的H2O2就越少,空白光譜和汗液光譜就越難區(qū)分。

圖8 人工汗液的稀釋倍數(shù)探究Figure 8 Exploration of dilution factor of artificial sweat

在此基礎(chǔ)上,葡萄糖濃度則相應(yīng)被稀釋了4倍,但只關(guān)注葡萄糖原始濃度。如圖9,汗液中葡萄糖的LOD為0.5 mmol/L,而葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L,因為汗液中的葡萄糖被稀釋至原來的4倍。人體正常的血糖濃度空腹時為3.9～6.1 mmol/L,餐后2 h為4.4～7.8 mmol/L,而糖尿病患者的這一數(shù)值要高得多,一般空腹時大于7.1 mmol/L,餐后2 h大于11.1 mmol/L。而人體汗液中的葡萄糖含量很低,約為血糖濃度的1%～2%(對于糖尿病患者,空腹時則大于0.071 mmol/L,餐后2 h大于0.11 mmol/L),或為0.06～0.2 mmol/L,兩者的差距不大[27]。本文的方法僅能檢測到0.5 mmol/L,相差約2.5～8.3倍,距離汗液中葡萄糖的濃度范圍相差不到1個數(shù)量級,原因是還有很多條件未優(yōu)化,如信號分子4-MBA與Ag cube的孵育時間、Ag cube的粒徑大小、汗液稀釋倍數(shù)的詳細優(yōu)化等。

圖9 葡萄糖在人工汗液中的檢測限Figure 9 LOD of glucose detection in artificial sweat

4 結(jié) 語

本文基于SERS并利用葡萄糖和GOx之間的反應(yīng)產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube引起4-MBA SERS信號的變化來間接檢測汗液中的葡萄糖。首先驗證了葡萄糖和GOx之間反應(yīng)的可靠性。其次優(yōu)化了GOx的濃度、環(huán)境溫度、體系pH以及Ag cube膠體的體積對測試靈敏度的影響。得到了葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L,檢測時間為7 min。最后,對汗液進行了稀釋操作,汗液中葡萄糖的LOD為0.5 mmol/L,距離汗液中葡萄糖濃度還相差不到1個數(shù)量級,但糖尿病患者往往汗液中葡萄糖濃度較高,所以此方法是初步成功的。這為糖尿病患者提供了一種快速無損的葡萄糖檢測方式。