NIR 控制的復(fù)合型納米MOF 用于耐藥菌滅活

閆 泳，鄭 碩，毛麗穎，高 霞

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

由病原微生物感染引發(fā)的傳染病一直是世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-3].準(zhǔn)確、快速識(shí)別并殺滅病原微生物對(duì)疾病控制至關(guān)重要。這對(duì)致病性細(xì)菌來(lái)說(shuō)尤其如此。數(shù)據(jù)顯示每年全球約有5.5 億人因致病菌住院，并至少有3 300 萬(wàn)人因此死亡[4]。在已知的病原體中，金黃色葡萄球菌(S.aureus)是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，它們?cè)跇O低的傳染劑量下即可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，除常見(jiàn)的食物中毒外，其繼發(fā)性感染更是會(huì)導(dǎo)致腦膜炎、脊髓炎、敗血癥等，甚至 死亡[5-7]。

1929 年，弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素，開(kāi)啟了抗生素對(duì)抗細(xì)菌感染的輝煌時(shí)代。但是，伴隨抗生素的大規(guī)模使用甚至濫用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，對(duì)人類生命健康造成巨大的威脅[8-9]。某些致病菌對(duì)其常用抗生素的耐藥檢出率已達(dá)50%以上，如耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌的平均檢出率為76%，大腸埃希菌對(duì)頭孢曲松或頭孢噻肟的耐藥率已達(dá)54.2%[10-11]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2050 年，由細(xì)菌耐藥性引發(fā)的全球死亡人數(shù)將達(dá)1 000 萬(wàn)人[12]。我國(guó)在2016 年頒布了《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016—2020年)》，旨在遏制細(xì)菌耐藥性，維護(hù)人民群眾健康。因此，發(fā)展快速有效的耐藥菌滅活方法，及時(shí)遏制細(xì)菌的傳播具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來(lái)，光致細(xì)菌滅活法尤其是光熱療法(photothermal therapy，PTT) 和光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)，因其具有侵入性小、長(zhǎng)期副作用小、成本低且不產(chǎn)生顯著耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[13-16]。PTT 是指利用近紅外光吸收劑將光轉(zhuǎn)化為熱進(jìn)行殺菌的一種方式，而PDT 是利用光敏劑在光激發(fā)下將氧氣(O2)轉(zhuǎn)化為生物毒性活性氧(reactive oxygen species，ROS)進(jìn)行殺菌。與此同時(shí)，納米材料及技術(shù)的日新月異也為耐藥性細(xì)菌的高效滅活提供了契機(jī)[17-19]。金屬有機(jī)骨架(metal-organic frameworks，MOF)材料就是一類可以用來(lái)構(gòu)建光致細(xì)菌滅活平臺(tái)的理想材料[20-22]。MOF 是以金屬離子為連接點(diǎn)，有機(jī)配體為支撐構(gòu)成的空間3D 延伸的多孔性材料，具有多種優(yōu)異性能，如大的比表面積、可調(diào)控的空間結(jié)構(gòu)以及易于修飾的表面。MOF 具有孔隙結(jié)構(gòu)，可以用來(lái)負(fù)載光熱劑和光敏劑；其結(jié)構(gòu)具有靈活性，可通過(guò)對(duì)其表面的功能化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病原菌的特異性識(shí)別。

因此，本研究構(gòu)建了基于復(fù)合型 MOF 材料(UiO/ICG/PFH@aptamer，縮寫為UIP@Apt)的細(xì)菌滅活平臺(tái)。區(qū)別于傳統(tǒng)的抗生素，UIP@Apt 具有制備方法簡(jiǎn)單、成本低、周期短、具有廣譜性殺菌能力且不易產(chǎn)生顯著的細(xì)菌耐藥性的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，其具有良好的生物相容性和細(xì)菌靶向性，長(zhǎng)期副作用小，其主要功能成分吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)已被食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

2-疊氮對(duì)苯二甲酸(BDC-N3)，南京圣賽化工有限公司；八水合氧氯化鋯(ZrOCl2·8H2O)、吲哚菁綠(ICG)、全氟己烷(perfluorohexane，PFH)，Sigma-Aldrich 公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰醋酸、溴化鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、酵母提取物，北京索萊寶科技有限公司；鈣黃綠素、碘化丙啶，北京華威銳科化工有限公司。所用 aptamer(3′-DBCOATATACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATG CTATTTTTT-5′)[23]在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有溶液均用電阻率為18 MΩ·cm 去離子水制備。

Talos 型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，F(xiàn)EI 公司；D/max-2500 型X 射線衍射儀，日本理學(xué)集團(tuán)公司；LUMINA 型熒光光譜儀，賽默飛世爾科技公司；UV-2600 型分光光度計(jì)，日本島津公司；Tensor-27 型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司；倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；JY600C型聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 UIP@Apt的合成

將50 mg BDC-N3和21 mg ZrOCl2·8H2O 溶于1 mL DMF 溶液中。將混合溶液超聲處理10 min 后，與750μL 乙酸一并轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，在90 ℃烘箱中加熱18 h，得到UiO-66-N3。待反應(yīng)液慢慢冷卻至室溫后，用DMF 溶液和純凈水分別洗滌3 次(12 000 r/min 離心10 min)，將其置于 60 ℃真空干燥12 h，得到UiO-66-N3納米晶體的金屬有機(jī)骨架。最后將所得納米顆粒懸浮于純凈水中，放在4 ℃冰箱中保存。

將100μg/mL UiO-66-N3與40μg/mL ICG 水溶液混合后，在機(jī)械搖床上室溫避光振蕩12 h，隨后用純凈水清洗3 次(12 000 r/min 離心10 min)去除游離ICG。所得的UiO@ICG 沉淀與100μL 4% PFH 避光孵育6 h，再洗滌3 次后復(fù)溶于純凈水中，得到UIP復(fù)合材料。隨后將其在60 ℃真空干燥箱中干燥過(guò)夜，可得UIP 粉末樣品。

將100μg/mL UIP 與2μmol/L 二苯并環(huán)辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)修飾的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)核酸適配體(DBCO-aptamer)混合于pH 8.5 碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液中，置于機(jī)械搖床上，在室溫下振蕩過(guò)夜。最后，用純凈水洗去游離aptamer，重新懸浮納米材料獲得UIP@Apt。

UIP@Apt 的合成及其用于MRSA 滅活的原理如圖1 所示。以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為模型菌，在有近紅外光(NIR)照射時(shí)，一方面ICG可作為光熱劑產(chǎn)熱殺菌，另一方面ICG 也是光敏劑，可將O2轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧(1O2)進(jìn)行殺菌。同時(shí)，PFH具有相轉(zhuǎn)變特性，在受熱時(shí)可瞬間釋放O2，促使ICG產(chǎn)生更多1O2，進(jìn)一步增強(qiáng)其殺菌能力。因此，利用構(gòu)建的UIP@Apt 納米平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)耐藥菌的快速精準(zhǔn)識(shí)別與滅活。

圖1 UIP@Apt的合成及其用于MRSA滅活的原理圖Fig.1 Synthesis of UIP@Apt and its application for MRSA inactivation

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

挑取活化好的MRSA 菌落置于LB 液體培養(yǎng)基，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)12 h；3 500 r/min 離心5 min除去培養(yǎng)基，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，最后重新懸浮于PBS 緩沖液中。采用平板涂布法確定細(xì)菌的濃度，利用分光光度計(jì)測(cè)定不同細(xì)菌濃度下600 nm 處的吸光度(A600)，將平板涂布濃度(CFU/mL)與A600建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，后續(xù)致病菌濃度可通過(guò)A600計(jì)算。

1.4 體外殺菌

將MRSA(1×105CFU/mL)與PBS(10 mmol/L，20μL)、UiO、UiO/ICG 及UIP@Atp(終質(zhì)量濃度均為200μg/mL)孵育 10 min 后接種到 96 孔板中，用808 nm 激光以每孔0.5 W/cm2輻射照度照射10 min。將20μL 稀釋100 倍的細(xì)菌懸浮液轉(zhuǎn)移到LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃孵育12 h。根據(jù)LB 固體培養(yǎng)基上的菌落分布計(jì)數(shù)，計(jì)算不同處理?xiàng)l件下的殺菌效率。此外，利用鈣黃綠素和碘化丙啶對(duì)不同條件處理下的細(xì)菌進(jìn)行染色，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal scanning laser microscope，CLSM)觀察細(xì)菌的生存情況。利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)對(duì)對(duì)照組(PBS)和最終處理組(UIP@Apt＋NIR) 的MRSA 細(xì)菌形貌進(jìn)行觀察，評(píng)估其殺菌機(jī)制。

1.5 生物膜抑制

將高濃度MRSA 細(xì)菌(1×107CFU/mL)置于96孔板中，在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)37 ℃培養(yǎng)6 h 后，分別進(jìn)行PBS(10 mmol/L，20μL)和UIP@ Atp＋NIR(UIP@Atp 終質(zhì)量濃度分別為200μg/mL和400μg/mL，激光照射時(shí)間為10 min)處理，隨后繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。如此進(jìn)行3 個(gè)周期，即72 h 后對(duì)孔板中的生物膜進(jìn)行結(jié)晶紫染色，通過(guò)檢測(cè)其在590 nm 處的吸光度，并對(duì)結(jié)晶紫染色的面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以此評(píng)估UIP@Atp＋NIR 處理對(duì)生物膜的抑制效果。同時(shí)，對(duì)生物膜進(jìn)行鈣黃綠素和氧化丙啶染色，通過(guò)3D CLSM 圖像觀察UIP@ Atp＋NIR 對(duì)生物膜中MRSA 細(xì)菌的殺菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 UiO-66-N3 的表征

以2-疊氮對(duì)苯二甲酸為配體，以鋯(氧氯化鋯)為中心金屬，通過(guò)水熱法一步合成了富含疊氮基團(tuán)的UiO-66-N3(圖2)。

圖2 UiO-66-N3 的TEM圖像、元素分析、XRD和傅里葉變換紅外光譜表征Fig.2 TEM image，element mapping，XRD and Fourier transform infrared spectrum spectra of UiO-66-N3

對(duì)合成的UiO-66-N3進(jìn)行了TEM 表征，如圖2(a)所示，合成的UiO-66-N3尺寸在納米級(jí)別，并呈現(xiàn)出典型的八面體結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[23-24]。對(duì)其進(jìn)行了元素分析，如圖2(b)所示，配體中含有的碳元素、氮元素及中心離子鋯元素均出現(xiàn)在了合成的材料中，初步說(shuō)明UiO-66-N3已經(jīng)成功合成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，對(duì)合成材料進(jìn)行了X 射線衍射(XRD)表征〔圖2(c)〕和傅里葉變換紅外光譜表征〔圖2(d)〕。合成的納米粒子在小角度范圍內(nèi)(小于10°)呈現(xiàn)出了其特征的XRD 峰[24]，且在2 116 cm-1處出現(xiàn)了疊氮基團(tuán)的紅外光譜特征吸收峰，這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了UiO-66-N3的成功合成。

2.2 UIP@Apt的表征

以UiO-66-N3為初始材料，通過(guò)包覆ICG 和PFH，并通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)修飾MRSA 靶向適配體，制備了UIP@Apt 復(fù)合納米MOF 材料。為了驗(yàn)證材料的成功合成，對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的表征。利用CLSM考察ICG 是否已經(jīng)被包裹在UiO-66-N3中。由于納米級(jí)別的材料難以被CLSM 觀察到，在此合成了具有完全一致結(jié)構(gòu)的微米尺寸的UiO-66-N3[25]。如圖3所示，微米級(jí)別的UiO-66-N3在明場(chǎng)下同樣呈現(xiàn)出典型的八面體結(jié)構(gòu)，當(dāng)以相同的方法包裹ICG 后，可觀察到明顯的熒光信號(hào)，且其位置與UiO-66-N3完全耦合，說(shuō)明ICG 成功被包覆在UiO-66-N3中。

圖3 微米尺寸UiO-66-N3的CLSM圖Fig.3 CLSM diagram of micron sized UiO-66-N3

對(duì)UIP@Apt 的水溶液進(jìn)行808 nm 激光照射，隨著激光照射時(shí)間的延長(zhǎng)，可在溶液中觀察到明顯的氣泡〔圖4(a)〕。這是由于ICG 吸收了近紅外激光產(chǎn)熱后，觸發(fā)了PFH 的相轉(zhuǎn)變特性釋放出O2，這一結(jié)果間接證明了PFH 也被成功包覆在UiO-66-N3中。

圖4 UIP@Apt的表征Fig.4 Characterization of UIP@Apt

為了驗(yàn)證DBCO 修飾的細(xì)菌適配體已通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)鍵合在UiO-66-N3上，首先對(duì)兩者的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜表征。如圖4(b)所示，在與DBCO 修飾的適配體反應(yīng)完成后，UiO-66-N3在2 116 cm-1處的特征峰強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明其上存在的疊氮基團(tuán)已部分與DBCO 發(fā)生了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。

此外，對(duì)單純的 UiO-66-N3及適配體修飾的UiO-66-N3(UiO@Apt)進(jìn)行了凝膠分析。如圖4(c)所示，單純的MOF 材料沒(méi)有呈現(xiàn)出任何的條帶，而UiO@Apt 可呈現(xiàn)出明顯的DNA 條帶，進(jìn)一步說(shuō)明了aptamer 已鍵合在了UiO-66-N3上。

2.3 UIP殺菌機(jī)理的驗(yàn)證

ICG 是一種近紅外熒光染料，其在NIR 照射下，既可產(chǎn)熱殺菌又可產(chǎn)ROS 殺菌。為了驗(yàn)證其在UIP中仍具備此雙重功能，首先用DCFH-DA 探針對(duì)UIP產(chǎn)ROS 的能力進(jìn)行驗(yàn)證。DCFH-DA 是一種可以用來(lái)檢測(cè)體系中是否存在ROS 的熒光探針。當(dāng)有ROS存在時(shí)，其在525 nm 處會(huì)產(chǎn)生特征的熒光發(fā)射峰。如圖5(a)和圖5(b)所示，只有當(dāng)ICG 存在且有NIR照射時(shí)，材料(UiO/ICG 和UIP)才會(huì)產(chǎn)生ROS〔圖5(a)，紅線和黑線〕，且隨著PFH 的進(jìn)一步引入，材料(UIP)產(chǎn)ROS 的能力大大增強(qiáng)〔圖5(a)，黑線〕。結(jié)果說(shuō)明：一方面，ICG 在NIR 照射下具備產(chǎn)ROS的能力；另一方面，PFH 的引入確實(shí)會(huì)大大增強(qiáng)這一 能力。

圖5 UIP殺菌機(jī)理的驗(yàn)證Fig.5 Validation of UIP sterilization mechanism

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PFH 的存在確實(shí)會(huì)產(chǎn)生O2，考察了[Ru(dpp)3]Cl2(RDPP)探針在不同乏氧體系中的熒光強(qiáng)度變化。RDPP 是一種可以特異性檢測(cè)O2存在的熒光探針，其在615 nm 處的特征熒光發(fā)射峰會(huì)被O2猝滅。如圖5(c)和圖5(d)所示，在乏氧情況下，當(dāng)材料中不存在PFH 時(shí)，無(wú)論是否有激光照射，體系中RDPP 的熒光強(qiáng)度變化范圍均不大；而當(dāng)有PFH 存在且有NIR 照射時(shí)，RDPP 的熒光強(qiáng)度急劇下降〔圖5(c)，黑線〕，說(shuō)明體系中有大量的O2產(chǎn)生。這一結(jié)果間接驗(yàn)證了復(fù)合型UIP 材料在NIR 照射時(shí)，其光熱作用可使PFH 發(fā)生相轉(zhuǎn)變釋放O2，從而增強(qiáng)ICG 的光動(dòng)力效果。這一結(jié)果也說(shuō)明了包覆在MOF 中的ICG 仍然保留了其光熱性能。如圖5(e)所示，單純的MOF 在NIR 照射下溫度基本恒定(黑線)，而包覆了ICG 的UiO/ICG 和UIP 的溫度隨著激光照射時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了ICG在被包覆在MOF 中后仍保留了其光熱性能。這里需要說(shuō)明的是，UIP 的光熱效應(yīng)(藍(lán)線)略微低于UiO/ICG(紅線)，這可能是由于PFH 的加入占據(jù)了MOF 的部分孔隙結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ICG 的包覆量降低引起的。

此外，圖5(f)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示被包覆在MOF 中的ICG 具有更好的抗光漂白能力，相較于單純的ICG，UIP 具有更好的光熱循環(huán)性能。在經(jīng)過(guò)4 次光熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)后，單純ICG 可達(dá)到的最高溫度已從52 ℃降低到35 ℃，而UIP 仍可以達(dá)到近44 ℃。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為UIP 用于后續(xù)的殺菌實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。

2.4 UIP@Apt體外殺菌性能

為了考察UIP@Apt 復(fù)合納米材料對(duì)MRSA 的殺菌性能，設(shè)置了不同的處理組：PBS 對(duì)照組、PBS＋NIR 組、UiO 處理組、UiO＋NIR 組、UiO/ICG處理組、UiO/ICG ＋NIR 組、UIP@Apt 處理組、UIP@Apt＋NIR 組。首先采用了平板培養(yǎng)法考察不同處理組中MRSA 的生長(zhǎng)情況，直觀地了解不同處理方法對(duì)MRSA 的殺菌效果。如圖6(a)所示，在無(wú)NIR 照射時(shí)，4 個(gè)處理組中MRSA 的生長(zhǎng)活性基本沒(méi)有顯著差異，其菌落數(shù)量也很相近〔圖6(b)〕。這一結(jié)果說(shuō)明單純的材料處理沒(méi)有明顯的殺菌作用，而當(dāng)引入NIR 照射時(shí)，各組之間MRSA 的生長(zhǎng)情況發(fā)生變化。由于PBS 和UiO 材料本身都不具備光熱劑或光敏劑的作用，因此其菌落數(shù)與無(wú)NIR 時(shí)的基本一致，細(xì)菌的生長(zhǎng)并不受太大的影響。不同的是，在UiO/ICG＋NIR 組中，MRSA 菌落數(shù)顯著降低，這是ICG 在激光照射下同時(shí)產(chǎn)熱和產(chǎn)ROS 殺菌導(dǎo)致的，其殺菌率在47.9%左右。當(dāng)進(jìn)一步引入PFH 后，ICG在產(chǎn)熱的同時(shí)，還可促使PFH 釋放O2，此后ICG 又進(jìn)一步在NIR 照射下將O2轉(zhuǎn)換為ROS 殺菌。ROS只能在較短距離內(nèi)發(fā)揮作用，而aptamer 的存在大大拉近了UIP 材料與細(xì)菌之間的距離，可使產(chǎn)生的ROS 充分發(fā)揮其殺菌作用?；诖?，在UIP@Apt 的靶向作用以及光熱和自供氧光動(dòng)力協(xié)同作用下，UIP@Apt＋NIR 處理組對(duì)MRSA 的殺菌率達(dá)到了96.5%。

圖6 UIP@Apt體外殺菌性能Fig.6 In vitro bactericidal performance of UIP@Apt

對(duì)不同組別處理后的細(xì)菌進(jìn)行了熒光染色實(shí)驗(yàn)，其中：鈣黃綠素可以特異性染色活細(xì)菌，呈現(xiàn)綠色熒光；碘化丙啶可特異性染色死細(xì)菌，呈現(xiàn)紅色熒光。染色結(jié)果如圖6(c)所示，在沒(méi)有激光照射時(shí)，4 個(gè)處理組都呈現(xiàn)出了大量的綠色熒光，說(shuō)明細(xì)菌活性并沒(méi)有受到太大影響。在有NIR 照射時(shí)，除PBS＋NIR 組和UiO＋NIR 組內(nèi)細(xì)菌仍保持較好活性外，UiO/ICG＋NIR 和UIP＋NIR 處理后的細(xì)菌均呈現(xiàn)出了顯著的紅色熒光，說(shuō)明已有大量的細(xì)菌被滅活。圖6(d)的SEM 圖片也驗(yàn)證了這一結(jié)論，經(jīng)UIP@Apt＋NIR 處理后的MRSA 細(xì)菌已出現(xiàn)了顯著的皺縮和變形。

上述體外數(shù)據(jù)均說(shuō)明UIP@Apt 具有NIR 觸發(fā)的殺菌特性，其殺菌能力一方面來(lái)自其光熱性能，另一方面來(lái)自其自供氧型的光動(dòng)力殺菌能力。這種聯(lián)合殺菌行為可大大提高殺菌效率，使UIP@Apt 在低劑量(微克級(jí)別)時(shí)即可達(dá)到較好的殺菌效果。同時(shí)，這一殺菌機(jī)理具有廣譜適用性，既可以用于殺滅普通細(xì)菌且不產(chǎn)生耐藥性，又可以直接用于多藥耐藥菌的滅活。

2.5 UIP@Apt用于生物膜抑制

生物膜由于其外排泵、分離效應(yīng)和基因突變，對(duì)傳統(tǒng)的抗菌藥物具有更強(qiáng)的耐藥能力。因此，抗生素在用于生物膜治療時(shí)，往往由于耐藥性和穿透效果不佳而使治療效果不理想[26]?；诖?，除殺菌性能外，還研究了UIP@Apt 體外抑制MRSA 生物膜形成的 能力。

將高濃度的MRSA 置于96 孔板中，然后分別添加 PBS、200μg/mL UIP@Apt+NIR 及 400μg/mL UIP@Apt+NIR，考察其生物膜的生長(zhǎng)情況。經(jīng)過(guò)相同時(shí)間培養(yǎng)后，對(duì)各處理組內(nèi)的生物膜進(jìn)行結(jié)晶紫染色，檢測(cè)其在590 nm 處的吸光度并統(tǒng)計(jì)其結(jié)晶紫染色面積，結(jié)果如圖7 所示。PBS 處理組的生物膜形成較為致密完整，A590較大，而UIP@Apt＋NIR 處理的生物膜相對(duì)輕薄甚至透明且呈現(xiàn)出較小的A590，說(shuō)明UIP@Apt＋NIR 可以有效抑制MRSA 生物膜的形成。由A590計(jì)算得出，200μg/mL UIP@Apt 在NIR 照射下對(duì)生物膜形成的抑制率為33.5%，400μg/mL UIP@Apt＋NIR 對(duì)生物膜形成的抑制率為68.5%。此外，生物膜結(jié)晶紫染色的面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果也支持了這一結(jié)論，在NIR 照射下，相較于PBS 對(duì)照組，UIP@Apt處理后的MRSA 生物膜呈現(xiàn)出較小的結(jié)晶紫染色 面積。

圖7 UIP@Apt體外抑制MRSA生物膜形成的能力Fig.7 UIP@Apt ability to inhibit the formation of MRSA biofilm in vitro

對(duì)不同方法處理后的生物膜進(jìn)行鈣黃綠素染色，并利用3D CLSM 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行成像，如圖7(d)所示。不論是從3D 視角還是從俯視視角，均能觀察到UIP@Apt＋NIR 處理后的生物膜中存活的細(xì)菌數(shù)量明顯減少，生物膜變薄且更加透明，進(jìn)一步驗(yàn)證了UIP@Apt＋NIR 對(duì)MRSA 生物膜的生長(zhǎng)有良好的抑制作用。

3 結(jié)論

基于MOF 的易修飾性和多孔特性，結(jié)合光化學(xué)機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了一種復(fù)合型MOF 納米材料，其不但具備對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的靶向性，且在NIR 的觸發(fā)下可進(jìn)行光熱和自供氧光動(dòng)力協(xié)同殺菌，具有侵入性小、長(zhǎng)期副作用小且不產(chǎn)生顯著耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。以MRSA 為模型菌，經(jīng)驗(yàn)證，在NIR 控制下其體外殺菌率可達(dá)96.5%。相較于傳統(tǒng)治療方法，UIP@Apt 能有效抑制生物膜的形成。該方法簡(jiǎn)單有效，可為耐藥性細(xì)菌的早期識(shí)別與滅活提供有益參考。