亞鐵結(jié)合卵黃高磷蛋白肽的制備及活性分析

宋璐杉，宋 麗，朱臨嫻，喬賽鳳，張曉維

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

鐵的吸收調(diào)控是人體維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，鐵攝入不足和吸收障礙往往會(huì)導(dǎo)致人體缺鐵。缺鐵性貧血(iron deficiency anemia，IDA)是最常見的營養(yǎng)缺乏癥之一，研究表明IDA 會(huì)導(dǎo)致兒童生長發(fā)育抑 制[1]、免疫抑制[2]、精神疾病[3]等，此外，還會(huì)增加孕婦分娩風(fēng)險(xiǎn)、導(dǎo)致老年人器官功能下降等[4]。因此，IDA 在全球范圍內(nèi)引起了很多國家的關(guān)注[5]，美國、加拿大等國家采用了鐵強(qiáng)化小麥面粉等方式補(bǔ)鐵[6]，然而這種補(bǔ)鐵方式收效甚微。

人體對鐵的吸收主要來源于動(dòng)物食物的血紅素鐵和植物食物的非血紅素鐵，其中血紅素鐵的吸收受飲食成分的影響較小，而非血紅素鐵的吸收受飲食成分的影響很大[7]。非血紅素鐵通常以亞鐵離子(Fe2+)和鐵離子(Fe3+)兩種形式存在，通常以Fe(OH)3絡(luò)合物的形式存在，然而只有亞鐵離子才能被十二指腸腸上皮細(xì)胞吸收，鐵離子需要被還原成亞鐵離子才能被吸收[8]。血紅素鐵的吸收機(jī)制尚未被完全揭示，可能依賴于血紅素載體蛋白1(HCP1)和血紅素應(yīng)答基因1(HRG-1)轉(zhuǎn)運(yùn)或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[9]。因此，亞鐵離子螯合物可能更有利于小腸細(xì)胞吸收。

肽與金屬離子的螯合物作為新型的礦物質(zhì)補(bǔ)充劑，不僅具有良好的穩(wěn)定性，而且還能提高金屬元素的吸收效果[10]。卵黃高磷蛋白(phosvitin，PV)是生產(chǎn)磷酸肽的良好來源[11]，它由217 個(gè)氨基酸殘基組成，其中124 個(gè)為絲氨酸殘基，由于90%以上的絲氨酸殘基被磷酸化，因此具有較高的抗氧化活性和金屬螯合活性[12]。研究[13]表明，每100 g 雞蛋含有2 mg 鐵，其中有95%的鐵與PV 結(jié)合，鐵與PV 結(jié)合的化學(xué)平衡常數(shù)K＝1018。PV 因其與金屬離子結(jié)合不易解離而不利于人體對金屬離子的吸收[14]，酶解后得到的卵黃高磷蛋白肽(phosvitin peptide，PP)能夠顯著提高Fe2+、Ca2+的生物利用度[15]。與PV 相比，PP 具有更高的抗氧化能力和亞鐵螯合能力[16]。國內(nèi)外關(guān)于PP螯合金屬離子的研究主要集中在PP-鈣螯合物方面，PP-亞鐵螯合物方面的研究相對較少，因此本研究以PV 為原料，優(yōu)化酶解條件，超濾分離篩選活性更高的多肽組分，旨在為進(jìn)一步開發(fā)卵黃高磷蛋白肽亞鐵螯合物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋，天津市濱海新區(qū)第十三大街洞庭路明耀超市。

堿性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、Folin-酚、聚乙二醇(PEG)6000(AR)，北京索萊寶科技有限公司；氯化亞鐵四水合物(GR)、菲啰嗪(AR)、鹽酸羥胺(AR)，上海麥克林生化科技有限公司；FRAP 抗氧化能力檢測試劑盒，ABTS 抗氧化能力檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無水碳酸鈉(AR)、五水合硫酸銅(AR)、氫氧化鈉(AR)等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

H1850 型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BK-FD105 型冷凍干燥機(jī)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；MK3 型酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK公司；DKB-501A 型恒溫振蕩搖床，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DK-98-2 型電熱恒溫水浴鍋，上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)、電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量 30 000、10 000 和 3 000)，德國Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 卵黃高磷蛋白的制備

采用NaCl 結(jié)合聚乙二醇(PEG6000)沉淀法[17]制備PV。收集新鮮雞蛋的蛋黃液，加入等質(zhì)量蒸餾水，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，收集沉淀，加入等質(zhì)量NaCl(0.17 mol/L)溶液，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，再次收集沉淀加入1.74 mol/L NaCl 溶液(體積質(zhì)量比為10)，完全溶解后調(diào)節(jié)pH＝4，添加PEG6000 至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，取上清液透析48 h 后再10 000g 離心10 min，取上清液冷凍干燥即為PV。

1.2.2 卵黃高磷蛋白的酶解工藝優(yōu)化

選擇3 種蛋白酶酶解PV，酶解條件參考表1。PV 溶解后用Lowry 法[18]測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，調(diào)節(jié)PV 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，調(diào)節(jié)pH，加入蛋白酶后轉(zhuǎn)移到恒溫振蕩搖床，反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫。

表1 3種蛋白酶的反應(yīng)條件Tab.1 Reaction conditions of three proteases

單一酶酶解時(shí)間的確定：以PV 水解度、酶解液的 T-AOC 以及鐵螯合活性為指標(biāo)，酶添加量為6 000 U/g，酶解時(shí)間分別控制在1、2、3、4、5、6 h，按照表1 的條件酶解。

單一酶酶添加量的確定：選擇酶的最佳酶解時(shí)間，控制酶添加量分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，按照表1 的條件酶解。

復(fù)合酶酶解：單一酶的酶解條件確定后，將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分步組合確定復(fù)合酶的酶解工藝。

1.2.3 卵黃高磷蛋白肽的分級分離

采用截留相對分子質(zhì)量為 30 000、10 000 和3 000 的離心超濾管，7 500g 離心1 h，分別得到相對分子質(zhì)量范圍為＞30 000、10 000～30 000、3 000～＜10 000 和＜3 000 的PP 組分。

1.2.4 多肽及蛋白質(zhì)含量的測定

采用靈敏度高的Lowry 法[18]測定多肽及蛋白質(zhì)的含量。以250μg/mL 的牛乳血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為 0、25、50、100、150、200、250μg/mL 的蛋白溶液，按Folin-酚試劑使用說明書進(jìn)行操作，在755 nm 處測定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Folin-酚試劑使用說明書的方法測定樣品的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.2.5 水解度的測定

以蛋白質(zhì)在三氯乙酸(TCA)中的溶解度作為PV的水解度(ωDH)。將酶解液與等體積20% TCA 混合，10 min 后10 000g 離心15 min，用Lowry 法測定上清液中多肽的質(zhì)量濃度[19-20]。水解度按照式(1)計(jì)算。

式中：ρ1為上清液中多肽的質(zhì)量濃度，ρ2為樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.2.6 亞鐵螯合活性和亞鐵結(jié)合量的測定

采用菲啰嗪分光光度法[20]測定肽的亞鐵螯合活性。向200μL 酶解液加入800μL 醋酸鈉緩沖液(200 mmol/L，pH 5)，再加入40μL 2 mmol/L FeCl2溶液，振蕩搖勻后靜置30 min，加入40μL 5 mmol/L 菲啰嗪溶液，10 min 后在562 nm 處測定有色絡(luò)合物 吸光度，蒸餾水作空白對照。測定肽結(jié)合的亞鐵的 量[21]。亞鐵螯合活性(d1)和亞鐵結(jié)合量(d2)分別按照式(2)和式(3)計(jì)算。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品的吸光度；m0為反應(yīng)液中添加Fe2+的質(zhì)量，μg；m1為未結(jié)合多肽的Fe2+質(zhì)量，μg；m2為反應(yīng)液中多肽的質(zhì)量，mg。

1.2.7 抗氧化活性分析

T-AOC：用T-AOC 檢測試劑盒測定酶解液的總抗氧化能力。T-AOC 可以反映酶解液還原Fe3+-三吡啶三吖嗪產(chǎn)生藍(lán)色Fe2+-三吡啶三吖嗪的能力。以20μmol/L FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試劑盒說明書操作，以Fe2+濃度為橫坐標(biāo)，593 nm 處吸光度變化值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定酶解液T-AOC 值，單位為U/mL。

ABTS：以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ABTS 抗氧化能力檢測，把10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L，按ABTS 抗氧化能力檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定734 nm 處吸光度變化值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而求得樣品的ABTS抗氧化能力，單位為μmol/mg。

FRAP：采用FeSO4作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行FRAP 抗氧化能力檢測，將適量100 mmol/L FeSO4溶液稀釋為0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L，按FRAP 抗氧化能力檢測試劑盒說明書操作，測定593 nm 處吸光度變化值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而求得樣品的FRAP抗氧化能力，單位為μmol/mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，用SPSS Statistics 21 軟件處理數(shù)據(jù)，采用ANOVA 對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種蛋白酶酶解時(shí)間對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

卵黃高磷蛋白與酪蛋白有相似的結(jié)構(gòu)與組成，酪蛋白水解后能與鐵離子螯合，形成肽-鐵螯合物，且該螯合物能被Caco-2 細(xì)胞良好吸收[22]。本實(shí)驗(yàn)選擇了3 種不同的蛋白酶水解卵黃高磷蛋白，并對PV 的水解度、PP 的亞鐵螯合活性和T-AOC 進(jìn)行評價(jià)。水解度越高，說明酶解后產(chǎn)生的多肽越多；亞鐵螯合活性越高，說明多肽結(jié)合亞鐵離子的活性越高；T-AOC越高，說明多肽還原Fe3+-三吡啶三吖嗪產(chǎn)生藍(lán)色Fe2+-三吡啶三吖嗪的能力越強(qiáng)。

水解度是反映蛋白質(zhì)水解程度的指標(biāo)，受酶解時(shí)間的影響，酶解時(shí)間越長，蛋白質(zhì)水解越徹底，水解度就越高，即多肽含量越多、相對分子質(zhì)量越小[23]。3種蛋白酶酶解時(shí)間對水解度的影響如圖1 所示。隨著酶解時(shí)間的延長，卵黃高磷蛋白的水解度均增大。前4 h 水解度增長迅速，之后增長速度趨于平緩。在蛋白酶添加量相同時(shí)，3 種蛋白酶酶解卵黃高磷蛋白的效果不同，堿性蛋白酶的水解能力最高，胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解能力次之。

圖1 3種蛋白酶酶解時(shí)間對水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time of three proteases on hydrolysis degree

酶的種類和酶解時(shí)間會(huì)影響酶解液中多肽的種類和含量，從而影響酶解液的亞鐵螯合活性[24]。由于PV 與亞鐵離子結(jié)合不易解離而不利于亞鐵的生物利用，本研究關(guān)注的是酶解物的活性，因此研究結(jié)果不以未酶解的PV 作為對照。3 種蛋白酶的酶解時(shí)間對亞鐵螯合活性的影響如圖2 所示。堿性蛋白酶酶解1 h 時(shí)亞鐵螯合活性最高，胰蛋白酶酶解2 h 時(shí)亞鐵螯合活性最高，胃蛋白酶對酶解液的亞鐵螯合活性影響不大。

圖2 3種蛋白酶的酶解時(shí)間對亞鐵螯合活性的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time of three proteases on ferrous chelating activity

蛋白質(zhì)的抗氧化活性與水解度有關(guān)，水解度過大或過小時(shí)，抗氧化活性都有可能下降[25]。3 種蛋白酶的酶解時(shí)間對T-AOC 的影響如圖3 所示。堿性蛋白酶酶解3～4 h，T-AOC 最高；隨著胰蛋白酶酶解時(shí)間的延長，T-AOC 逐漸減小；隨著胃蛋白酶酶解時(shí)間的延長，T-AOC 逐漸增大。

圖3 3種蛋白酶的酶解時(shí)間對T-AOC的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time of three proteases on TAOC

綜上所述，盡管堿性蛋白酶酶解1 h 時(shí)，亞鐵螯合活性最高，但水解度較低且產(chǎn)生的多肽較少，所以堿性蛋白酶酶解時(shí)間取3 h，此時(shí)亞鐵螯合活性和TAOC 均較高。胰蛋白酶酶解2 h 時(shí)，亞鐵螯合活性和T-AOC 均達(dá)到最高，因此胰蛋白酶的酶解時(shí)間取2 h。由圖1—圖3 可知，胃蛋白酶酶解時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC 均緩慢增加，且酶解5 h 和酶解6 h 時(shí)各指標(biāo)差異不大，因此胃蛋白酶酶解時(shí)間取5 h。由于PV 不易被酶解，采用單一酶酶解水解度較低，得到的活性多肽較少，因此有必要采用復(fù)合酶進(jìn)行酶解。

2.2 3 種蛋白酶的添加量對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

在堿性蛋白酶酶解3 h、胰蛋白酶酶解2 h、胃蛋白酶酶解5 h 條件下，探究不同蛋白酶添加量對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC 的影響，結(jié)果如圖4—圖6 所示。

圖4 3種蛋白酶添加量對水解度的影響Fig.4 Effect of addition amount of three proteases on hydrolysis degree

由圖4 可知：水解度隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，當(dāng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量為6 000 U/g 時(shí)，可能由于酶達(dá)到飽和狀態(tài)，水解度增加很小。由圖5 可知：隨著堿性蛋白酶添加量的增加，亞鐵螯合活性逐漸減??；當(dāng)胰蛋白酶添加量為4 000 U/g 時(shí)，亞鐵螯合活性最高；胃蛋白酶添加量對亞鐵螯合活性的影響不大，但在添加量為8 000 U/g時(shí)活性最高。胃蛋白酶添加量為6 000 U 時(shí)，亞鐵螯合活性最弱，這可能與酶解液中PP 的相對分子質(zhì)量有關(guān)。由圖6 可知：堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量在6 000 U/g 時(shí) T-AOC 最高，胃蛋白酶添加量在8 000 U/g 時(shí)T-AOC 活性最高。

圖5 3種蛋白酶添加量對亞鐵螯合活性的影響Fig.5 Effect of addition amount of three proteases on ferrous chelating activity

圖6 3種蛋白酶添加量對T-AOC的影響Fig.6 Effect of addition amount of three proteases on TAOC

綜上所述，堿性蛋白酶添加量選擇6 000 U/g，胃蛋白酶添加量選擇8 000 U/g。盡管胰蛋白酶添加量在6 000 U/g 時(shí)T-AOC 最高，但其亞鐵螯合活性顯著低于添加量為4 000 U/g 時(shí)。這一方面是由于胰蛋白酶成本較高，另一方面后續(xù)還會(huì)進(jìn)行復(fù)合酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，所以胰蛋白酶添加量暫時(shí)選擇4 000 U/g。

2.3 復(fù)合酶酶解對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

采用3 種酶分步酶解，酶解條件為：6 000 U/g 堿性蛋白酶酶解 3 h，4 000 U/g 胰蛋白酶酶解 2 h，8 000 U/g 胃蛋白酶酶解5 h。為探究復(fù)合酶先后酶解順序是否會(huì)對PV 酶解物的活性產(chǎn)生影響，測定了每一步酶解的效果和活性。復(fù)合酶酶解對水解度、亞鐵螯合活性、T-AOC 的影響如圖7—圖9 所示，其中每組酶解順序在圖中表示為由左至右，不同字母表示每步酶解結(jié)果間具有顯著差異(P＜0.05)。

圖7 復(fù)合酶酶解對水解度的影響Fig.7 Effect of compound enzymatic hydrolysis on hydrolysis degree

由圖7 可知：復(fù)合酶酶解與單一酶酶解相比，PV的水解度顯著性提高，即復(fù)合酶水解更徹底。復(fù)合酶酶解的先后順序會(huì)影響水解程度，組1 的水解度最高，其次是組2 和組6。組6 中用復(fù)合酶二步酶解(堿性蛋白酶-胰蛋白酶)和三步繼續(xù)酶解(加入胃蛋白酶)得到的水解度無顯著性差異。由圖8 可知：組1和組6 中前兩種酶的酶解產(chǎn)物亞鐵結(jié)合活性最高且無顯著性差異。由圖9 可知：酶解順序和組合對TAOC 有顯著性的影響；組6 中僅用前兩種酶(堿性蛋白酶-胰蛋白酶)分步酶解的水解物，得到的T-AOC最高；若三步繼續(xù)酶解(胃蛋白酶)其T-AOC 顯著下降，抗氧化活性降低。因此，二步酶解得到酶解物活性最高。

圖8 復(fù)合酶酶解對亞鐵螯合活性的影響Fig.8 Effect of complex enzyme hydrolysis on ferrous chelating activity

圖9 復(fù)合酶酶解對T-AOC的影響Fig.9 Effect of compound enzymatic hydrolysis on T-AOC

由以上結(jié)果可知，PV 的酶解優(yōu)化工藝為先6 000 U/g 堿性蛋白酶酶解3 h，再4 000 U/g 胰蛋白酶酶解2 h，得到的酶解液多肽含量較多且亞鐵螯合活性和T-AOC 均較高。

2.4 卵黃高磷蛋白肽不同相對分子質(zhì)量組分的活性

肽的相對分子質(zhì)量大小、氨基酸組成及排列順序是影響肽結(jié)合活性的重要原因。由2～9 個(gè)氨基酸形成的寡肽比大分子蛋白質(zhì)和多肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化性[26]。含有Ser、Lys、His、Glu、Asp、Cys 等的肽鏈更容易與鐵結(jié)合，且相對分子質(zhì)量越小的多肽越容易通過細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞膜內(nèi)吞作用進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞[5]，小相對分子質(zhì)量肽可能更適合作為鐵螯合活性肽應(yīng)用于鐵補(bǔ)充劑。

不同相對分子質(zhì)量PP 的ABTS 抗氧化活性、FRAP 抗氧化活性以及亞鐵結(jié)合量如圖10—圖12 所示，不同字母表示組間具有顯著差異(P＜0.05)。

圖10 不同相對分子質(zhì)量PP的ABTS抗氧化活性Fig.10 ABTS antioxidant activity of PP with different molecular weights

圖11 不同相對分子質(zhì)量PP的FRAP抗氧化活性Fig.11 FRAP antioxidant activity of PP with different molecular weights

圖12 不同相對分子質(zhì)量PP的亞鐵結(jié)合量Fig.12 Ferrous binding contents of PP with different molecular weights

酶解PV 后產(chǎn)物活性較酶解前均有不同程度的提高，其中＜3 000 的卵黃高磷蛋白肽活性顯著高于其他多肽組分，ABTS 抗氧化能力為955.61μmol/mg，F(xiàn)RAP 抗氧化能力為62.30μmol/mg，亞鐵結(jié)合量為(96.14±2.86)μg/mg。對比文獻(xiàn)[27]的7 種小肽可以看出，小分子的PP 具有良好的抗氧化活性，同時(shí)其亞鐵結(jié)合量顯著高于綠豆肽(61.25±1.02)μg/mg[22]、乳清蛋白肽(36.42μg/mg)[28]，表明PP(相對分子質(zhì) 量＜3 000)是一種潛在的鐵補(bǔ)充劑。

3 結(jié)論

酶解卵黃高磷蛋白的最優(yōu)工藝為：先使用堿性蛋白酶在pH 10、溫度50 ℃、加酶量6 000 U/g 的條件下水解3 h，再使用胰蛋白酶在pH 8、溫度37 ℃、加酶量3 000 U/g 的條件下水解2 h。此工藝條件下水解度可達(dá)(34.69±1.50)%、亞鐵螯合活性為(87.89±0.16)%、T-AOC 為(0.160 0±0.006 2)U/mL。PP 超濾分級后，相對分子質(zhì)量＜3 000 的PP 活性最好，ABTS 抗氧化能力為(955.61±79.74)μmol/mg，F(xiàn)RAP抗氧化能力為(62.30±3.94)μmol/mg，亞鐵結(jié)合量為(96.14±2.86)μg/mg，表明相對分子質(zhì)量＜3 000 的PP 是制備鐵補(bǔ)充劑的良好來源。