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    NNK聯(lián)合LPS孵育對小鼠巨噬細胞增殖及相關(guān)基因表達影響

    2015-05-01 02:33:20陳琛卞晶晶劉曉萍張靜于忠杰楊童茜
    精準醫(yī)學(xué)雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:孵育肺癌小鼠

    陳琛,卞晶晶,劉曉萍,張靜,于忠杰,楊童茜

    (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,山東 青島 266021)

    越來越多的研究結(jié)果表明,炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。4-(甲基亞硝氨基)-3-吡啶-1-丁酮(NNK)是7種煙草煙霧中最強的致癌劑,經(jīng)口腔、注射、氣管支氣管灌注等途徑給予NNK,可成功建立肺癌模型[1]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌外膜的重要組成部分,是研究中廣泛應(yīng)用的致炎因子。近年來,有學(xué)者通過給予NNK和LPS聯(lián)合刺激來制備肺癌動物模型。既往研究結(jié)果顯示,LPS單獨應(yīng)用并不能誘發(fā)小鼠肺癌發(fā)生,當與NNK聯(lián)合刺激時,NNK的致瘤效果明顯增強[1],但其機制尚不清楚。肺內(nèi)的巨噬細胞是重要的免疫細胞,其在LPS和NNK聯(lián)合刺激誘發(fā)肺癌過程中的變化報道甚少?;罨木奘杉毎辽侔∕1、M2兩種類型:M1型巨噬細胞可分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1α以及IL-6等,并可使誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達升高;M2型巨噬細胞是一種抑制型細胞,可分泌IL-10、IL-4等抗炎因子,精氨酸酶(Arginase)高表達為其特征[2-3]。C-myc和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是重要的轉(zhuǎn)錄因子,其基因編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與細胞凋亡、細胞分化、細胞增殖及細胞周期進程密切相關(guān)[4]。C-myc基因在肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、乳癌和胃癌等多種腫瘤組織過度表達[5]。本實驗在體外研究LPS、NNK以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對小鼠巨噬細胞增殖及相關(guān)基因表達的影響,以探討炎癥促發(fā)癌癥的機制。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    Raw264.7細胞購自美國ATCC公司,LPS購自美國Sigma公司,NNK購自美國Toronto Research Chemicals公司,RNA抽提試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自美國Applied biosystems公司,TNF-α與IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒均購自美國eBioscience公司。細胞計數(shù)儀(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)購自美國 Nexcelom Bioscience公司,7900HT快速實時定量PCR反應(yīng)設(shè)備購自美國Applied biosystems公司。

    1.2 引物合成

    根據(jù)NCBI中的基因序列,應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,引物由美國Operon公司合成,引物序列見表1。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 巨噬細胞培養(yǎng)及LPS、NNK濃度選擇 將RAW264.7細胞置于含有體積分數(shù)0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,并添加105U/L青霉素和鏈霉素,置于37℃、含體積分數(shù)0.05CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴增。取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)5h貼壁后,隨機分為對照組、NNK組和LPS組。LPS組和NNK組分別加入10μg/L、250μg/L、1mg/L、4mg/L的LPS和5、10、25、100μmol/L的NNK,對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)液,然后孵育Raw264.7細胞24h,每組設(shè)3個平行孔,實驗重復(fù)2次。應(yīng)用氯仿-異戊醇法抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時定量PCR反應(yīng),結(jié)果以2△△Ct表示。

    表1 PCR所用引物名稱及其序列

    1.3.2 巨噬細胞增殖能力檢測 取指數(shù)生長期的Raw264.7細胞,以32×106/L接種于12孔板,培養(yǎng)5h后,隨機分為對照組(A組)、NNK組(B組)、LPS組(C組)和LPS+NNK組(D組),每組設(shè)3個平行孔。所用NNK濃度為10μmol/L,LPS濃度為1mg/L,對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后用細胞計數(shù)儀計數(shù)單位體積內(nèi)細胞,判定細胞增殖狀態(tài)。

    1.3.3 巨噬細胞相關(guān)基因表達的檢測 取對數(shù)生長期的Raw264.7細胞,培養(yǎng)5h貼壁后隨機分組,分組及用藥方法同1.3.2。孵育24h抽提RNA,進行實時定量 PCR 反應(yīng),檢測 C-myc、NF-κB、Arginase、iNOS、IL-6和IL-1αmRNA 表達。每組設(shè)3個平行孔,實驗重復(fù)2次。

    1.3.4 巨噬細胞IL-6和TNF-α蛋白表達檢測 取8×104個對數(shù)生長期的Raw264.7細胞接種于6孔板,培養(yǎng)5h,分組及用藥同1.3.2。于培養(yǎng)24h收集細胞,提取樣品蛋白,使用TNF-α與IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒定量檢測IL-6和TNF-α蛋白含量。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)均以表示,應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析觀察組間是否存在交互作用,析因結(jié)果存在交互作用時使用One way ANOVA檢驗進一步分析各因素的單獨效應(yīng)。以P<0.05為差異有顯著性。

    2 結(jié) 果

    2.1 LPS和NNK實驗濃度選擇

    以濃度為10μg/L、250μg/L、1mg/L、4mg/L的LPS孵育Raw264.7細胞24h,細胞C-myc mRNA相對表達量分別為22.89±1.71、41.73±2.22、61.35±11.24、41.80±5.71;對照組細胞C-myc mRNA相對表達量為1.00±0.16。LPS可上調(diào) Raw264.7細胞C-myc mRNA的相對表達量,其中濃度為1mg/L的LPS作用最顯著(F=605.6,P<0.01)。5、10、25、100μmol/L的NNK孵育Raw264.7細胞24h,細胞C-myc mRNA的相對表達量分別為0.71±0.23、0.99±0.17、0.83±0.14、0.70±0.16,呈 下 降 趨勢,但與對照組(1.00±0.16)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。故選擇1mg/L的LPS和10μmol/L的NNK用于下一步實驗。

    2.2 各組細胞增殖能力比較

    C組Raw264.7細胞的增殖與A組相比差異有顯著性(F=5.28,q=3.18,P<0.05),而B組與 A組比較、D組與C組相比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

    2.3 各組細胞相關(guān)基因表達比較

    B組Raw264.7細胞各基因表達與A組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組Raw264.7細胞各基因表達均較 A組顯著升高(F=19.4~5 895.0,t=4.04~97.53,P<0.05)。D組 C-myc mRNA 的表達顯著低于C組(t=4.80,P<0.01),而 NF-κB和IL-1αmRNA的表達則均顯著高于C組(t=3.76、2.81,P<0.05)。見表2。

    2.4 各組細胞IL-6和TNF-α蛋白表達比較

    B組細胞IL-6和TNF-α蛋白表達與A組比較差異無顯著意義。C、D組細胞IL-6和TNF-α蛋白表達較 A組顯著升高(F=1 213.0、110.2,t=29.40~44.76,P<0.01);D 組 TNF-α蛋白表達顯著低于 C組(t=3.74,P<0.01)。見表3。

    表2 各組小鼠巨噬細胞增殖及相關(guān)基因mRNA表達比較(n=6,)

    表2 各組小鼠巨噬細胞增殖及相關(guān)基因mRNA表達比較(n=6,)

    組別 細胞增殖(ccell/105·L-1) C-myc NF-κB iNOS Arginase IL-6 IL-1α A 組 7.00±0.63 1.00± 0.31 1.00±0.17 1.00± 0.16 1.00± 0.32 1.00± 0.24 1.00±0.26 B 組 7.17±0.89 1.00± 0.17 0.94±0.08 1.21± 0.38 1.06± 0.43 3.09± 0.50 0.97±0.36 C 組 5.02±0.26 61.35±11.24 4.85±1.40 539.50±113.00 28.45±10.70 67 143.00±16 146.00 3.19±0.25 D 組 5.85±1.04 37.79± 8.54 6.30±1.68 624.60±185.90 19.66±10.97 92 576.00±13 288.00 2.45±0.32

    表3 各組細胞IL-6和TNF-α蛋白表達比較(n=6,ρ/μg·L-1,)

    表3 各組細胞IL-6和TNF-α蛋白表達比較(n=6,ρ/μg·L-1,)

    組別 IL-6 TNF-a A 組 1.512±0.239 3.368±0.142 B 組 1.613±0.364 3.392±0.500 C 組 38.510±2.290 42.770±6.211 D 組 34.920±3.430 33.110±4.670

    3 討 論

    在癌癥發(fā)展過程中炎癥有兩個方面的作用。一方面是殺滅腫瘤,在這種情況下,炎癥誘導(dǎo)各種免疫細胞到達腫瘤位點,誘導(dǎo)腫瘤細胞及正常細胞凋亡。如果腫瘤細胞在此階段被完全消除,炎癥減弱且組織重塑,僅引發(fā)特定區(qū)域的急性炎癥。另一方面可以刺激癌變,炎癥可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定,造成基因突變。已有研究結(jié)果表明,炎癥可以增加至少3個靶基因(Cmyc、Aurka和Pim1)的基因組不穩(wěn)定和突變;腫瘤細胞可以在炎癥環(huán)境下生存,慢性炎癥通??梢蕴峁┯欣谀[瘤發(fā)展的微環(huán)境,促進腫瘤生長或惡變[6]。

    C-myc基因是myc基因家族的成員之一,屬核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,其編碼蛋白介導(dǎo)細胞外傳入細胞內(nèi)的生物信號向細胞核內(nèi)傳遞,參與細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)控[7-8]。C-myc在細胞靜止期不表達,而在有絲分裂原作用下迅速表達,促使細胞增殖、浸潤,最終細胞增殖異常而癌變[9-10]。已有研究證實,C-myc基因在肝細胞癌(HCC)組織中高表達,在癌旁組織中的表達明顯下降,而在正常肝組織中則不表達,提示C-myc基因過度表達可能是誘發(fā)HCC的原因之一[11]。有研究表明,C-myc控制著45%的表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因,參與巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)化,調(diào)控促癌基因的表達和細胞形態(tài)改變[8]。本文結(jié)果顯示,濃度為5~100μmol/L的 NNK 對 Raw264.7細胞 C-myc mRNA表達和增殖無顯著影響;LPS在10μg/L~4mg/L的濃度范圍則可以顯著上調(diào)Raw264.7細胞C-myc mRNA的相對表達量,以濃度為1mg/L的LPS作用最強。當LPS與NNK聯(lián)合刺激時,小鼠Raw264.7細胞C-myc mRNA也呈高表達,但較單獨LPS刺激的作用弱。同時,細胞的形態(tài)發(fā)生改變,胞核變大,細胞變大并伸出偽足狀突起,呈現(xiàn)出活化狀態(tài)。提示LPS與NNK聯(lián)合刺激可能進一步促進了巨噬細胞的活化。

    我們前期研究結(jié)果顯示,應(yīng)用不同濃度的炎性啟動因子LPS體外孵育可以明顯促進人肺腺癌上皮A549細胞的增殖,進一步提示LPS有激活肺癌細胞增殖的作用[12]。為進一步驗證LPS和NNK聯(lián)合孵育對巨噬細胞的作用,本實驗分析了LPS和NNK對巨噬細胞 NF-κB、Arginase、iNOS、IL-1α、IL-6mRNA 和TNF-α、IL-6蛋白表達的影響。研究結(jié)果顯示,單獨NNK孵育對巨噬細胞相關(guān)基因和蛋白的表達無明顯影響,而LPS孵育可顯著刺激巨噬細胞高表達C-myc等相關(guān)基因和蛋白,提示LPS主要激活M1型巨噬細胞。當LPS+NNK聯(lián)合孵育Raw264.7細胞時,NNK 強化了 LPS激活 NF-κB、IL-1α基因的作用;促進了M1型巨噬細胞的激活,進而刺激M1型細胞產(chǎn)生和分泌IL-1α。這些炎性遞質(zhì)進一步刺激巨噬細胞過表達iNOS等,從而導(dǎo)致NO合成大大增加,導(dǎo)致正常細胞DNA的損傷,阻礙DNA修復(fù),誘導(dǎo)基因突變,刺激肺癌形成。如果改變LPS或NNK的反應(yīng)時間,是否還會發(fā)生同樣的變化尚需進一步研究。

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