幼兒園兒童年齡與肺炎鏈球菌疫苗覆蓋率間的劑量-反應關(guān)系

李亭 鄧文君 張景鋒 李平原 周俊立 姚振江 葉小華

（廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，廣東廣州 510310）

肺炎鏈球菌疾病是兒童發(fā)病和死亡的最主要原因，特別是侵襲性肺炎鏈球菌疾病（invasive pneumococcal disease, IPD）給全球兒童造成了嚴重的疾病負擔。肺炎鏈球菌疾病在5歲以下兒童、65歲以上老年人及具有免疫缺陷病、基礎(chǔ)合并癥人群中發(fā)病率很高［1］。肺炎鏈球菌主要通過呼吸道飛沫定植于鼻咽部并侵入機體正常無菌部位（如血液、腦脊液等），從而導致IPD 并引起全身性的嚴重感染（例如菌血癥和腦膜炎）［2］。疫苗接種是預防和控制肺炎鏈球菌感染的最經(jīng)濟、最有效策略。肺炎球菌結(jié)合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine, PCV）的引入已使全世界IPD 發(fā)病率顯著降低［3-4］，但疫苗的廣泛使用改變了肺炎鏈球菌血清型的自然流行規(guī)律，致使疫苗覆蓋血清型流行率呈下降趨勢，而非疫苗覆蓋血清型流行率呈上升趨勢，這已成為全球日益關(guān)注的公共衛(wèi)生問題［5］。世界衛(wèi)生組織推薦5 歲及以下兒童接種10價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗（10-valent pneumococcal conjugate vaccine, PCV10）與13 價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗（13-valent pneumococcal conjugate vaccine,PCV13）［6］；《肺炎球菌性疾病免疫預防專家共識》（2020版）［2］指出，PCV13在較大年齡兒童中（2～6歲）具有較好的免疫原性，因此幼兒園兒童是PCV 接種的主要人群，需要持續(xù)監(jiān)測肺炎鏈球菌的血清型流行狀況，以更好地評估結(jié)合疫苗的有效性。由于結(jié)合疫苗僅局限于特定血清型且生產(chǎn)成本較高，因此新型的、高度保守的蛋白疫苗成為了新一代肺炎疫苗的研究熱點。迄今為止，候選蛋白疫苗中具有較大潛力的毒力蛋白主要是自溶素（autolysin A, lytA）、肺炎鏈球菌溶血素（pneumolysin, ply） 和肺炎鏈球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A, pspA），以及基于菌毛基因rlrA與sipA的蛋白。多項研究表明，上述蛋白質(zhì)具有多種生物學活性，在肺炎鏈球菌疾病的發(fā)病機制中起重要作用［3，7-9］，這可為研發(fā)新型肺炎鏈球菌蛋白疫苗提供新思路。本研究對廣東省佛山市順德區(qū)幼兒園兒童進行流行病學研究，旨在掌握該地區(qū)幼兒園兒童攜帶肺炎鏈球菌的血清型流行狀況，并探究兒童年齡與肺炎鏈球菌血清型、基因型覆蓋率間潛在劑量-反應關(guān)系，為指導兒童疫苗接種與研發(fā)新型蛋白疫苗提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年10—12 月佛山市順德區(qū)幼兒園的健康兒童為研究對象，采用分層整群隨機抽樣的方法：第一階段，按經(jīng)濟發(fā)展水平和地理分布位置將順德區(qū)分為2 層（城鎮(zhèn)、農(nóng)村）；第二階段，每層按比例采用直接抽選法抽取部分幼兒園，共抽取6所幼兒園，其中城鎮(zhèn)和農(nóng)村各3所，抽中幼兒園中所有符合納入標準的兒童均參與本次調(diào)查。納入標準：年齡≤7 歲的健康幼兒園兒童，且監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標準：調(diào)查前7 d內(nèi)患有支氣管炎、肺炎等急性感染性疾??；患有血友病等易出血疾病。共調(diào)查1 830名兒童。本研究獲得廣東藥科大學倫理委員會批準（批件號：倫理審［2019］第19 號），所有兒童監(jiān)護人在調(diào)查前均已簽署知情同意書，并于采樣前完成問卷調(diào)查。

1.2 菌株采集與分離鑒定

由經(jīng)過統(tǒng)一培訓的調(diào)查員對兒童進行鼻咽拭子采樣，首先用生理鹽水濕潤無菌拭子，然后通過鼻腔慢慢插入鼻咽，遇到阻力后輕輕旋轉(zhuǎn)3～5圈，取出拭子并放置無菌試管中。肺炎鏈球菌的分離鑒定：將鼻咽拭子樣品接種于哥倫比亞血平板，置于35℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20 h，對可疑菌落依次進行溶血試驗、Optochin敏感試驗與膽汁溶菌試驗，以上試驗均陽性則可判定為肺炎鏈球菌陽性。

1.3 肺炎鏈球菌的全基因組測序

將所有肺炎鏈球菌均進行全基因組測序分析。將經(jīng)復蘇和擴增培養(yǎng)的肺炎鏈球菌制成菌液，按照Magen 細菌基因組DNA 提取試劑盒的操作說明書提取肺炎鏈球菌DNA，并通過NanoDrop 微量紫外分光光度檢測計檢測所提取DNA的濃度和純度。將質(zhì)量合格的肺炎鏈球菌基因組DNA 行進一步質(zhì)量檢測和全基因組測序，并進行序列質(zhì)控、序列拼接及序列物種鑒定。

1.4 血清型分型與基因檢測

將拼接好的肺炎鏈球菌菌株序列上傳到PathogenWatch 全球基因組監(jiān)測平臺（https://pathogen.watch/），該網(wǎng)站使用SeroBA 軟件對菌株序列進行血清型預測。SeroBA 軟件是一種能可靠地識別出肺炎鏈球菌血清型的生物信息學工具，其通過識別cps位點，基于k-mers方法直接從全基因組測序數(shù)據(jù)中進行肺炎鏈球菌血清型預測。若菌株缺乏莢膜操縱子，則該菌株被歸類為不可分型。使用ABRicate軟件對菌株序列菌毛基因（rlrA和sipA） 與毒力基因（lytA、ply、pspA） 進行檢測。

1.5 相關(guān)定義

（1）PCV10：包含血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。（2）PCV13：在PCV10的基礎(chǔ)上增加血清型3、6A、19A。（3）菌毛基因島1（pilus islet 1, PI-1）：由rlrA基因決定的致病島。（4）菌毛基因島2（pilus islet 2, PI-2）：由sipA基因決定的致病島。

1.6 統(tǒng)計學分析

使用EpiData 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，調(diào)查問卷結(jié)果采用雙人錄入并進行一致性檢驗。使用STATA 17.0 軟件和R 4.2.1 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示；采用基于限制性立方樣條（restricted cubic spline, RCS）的logistic回歸模型分析年齡與肺炎鏈球菌疫苗血清型/基因型覆蓋率間的劑量-反應關(guān)系。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人口學特征和肺炎鏈球菌攜帶率

本研究共調(diào)查了1 830 名健康兒童，年齡最大為7 歲，最小為1 歲，平均年齡為（4.5±1.0）歲；其中男童1 001 名（54.70%）， 女童829 名（45.30%）。1 830 名幼兒園兒童中，鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶率為22.46%（411/1 830）。

2.2 肺炎鏈球菌血清型分布和疫苗血清型/基因型覆蓋率

411 株肺炎鏈球菌菌株中，共檢出22 種血清型，11株未能確定血清型。最常見血清型為6B型（133株，32.4%），其次為19F型（55株，13.4%）、15A 型（46 株，11.2%）、23A 型（31 株，7.5%）、34 型（24 株，5.8%）、23F 型（18 株，4.4%）；主要流行的疫苗血清型是6B、19F、23F 型，主要流行的非疫苗血清型為15A、23A、34 型。PCV10 和PCV13 血清型覆蓋率分別為53.0% （218/411）、57.9%（238/411）。PI-1、PI-2、lytA、ply、pspA基因型覆蓋率分別為37.7%（155/411）、16.1%（66/411）、99.5%（409/411）、99.0%（407/411）、5.4%（22/411）。

2.3 兒童年齡與疫苗血清型/基因型覆蓋率的關(guān)系

兒童年齡與PCV10 血清型覆蓋率間呈“S”形的劑量-反應關(guān)系（P=0.021），其中2 歲組兒童PCV10 血清型覆蓋率最高（88.0%）；兒童年齡與PCV13 血清型覆蓋率間呈“S”形的劑量-反應關(guān)系（P=0.004），其中2歲組兒童PCV13血清型覆蓋率最高（91.1%）。兒童年齡與PI-1覆蓋率間呈“S”形的劑量-反應關(guān)系（P=0.004），各年齡組兒童PI-1覆蓋率均較低（13.0%～58.5%）；兒童年齡與PI-2覆蓋率間呈“S”形的劑量-反應關(guān)系（P＜0.001），各年齡組兒童PI-2覆蓋率均較低（6.0%～29.4%）。見表1、圖1。對于蛋白疫苗相關(guān)的pspA基因覆蓋率，兒童年齡與其覆蓋率間存在線性劑量-反應關(guān)系（P=0.005），隨著年齡的增長，覆蓋率逐漸升高，但各年齡組pspA基因覆蓋率均維持在較低水平（1.1%～12.9%）（表1）。對于蛋白疫苗相關(guān)的lytA、ply基因覆蓋率，兒童年齡與其覆蓋率之間的線性（分別為P=0.201、P=0.957）與非線性（分別為P=0.699、P=0.739）劑量-反應關(guān)系均無統(tǒng)計學意義，但在各年齡組中均維持在較高水平 （lytA： 96.6%～100%；ply： 99.0%～99.1%）。

圖1 基于RCS模型分析年齡與肺炎鏈球菌疫苗血清型/基因型覆蓋率的關(guān)系 A：兒童年齡與PCV10覆蓋率間存在非線性劑量-反應關(guān)系；B：兒童年齡與PCV13覆蓋率間存在非線性劑量-反應關(guān)系；C：兒童年齡與PI-1覆蓋率間存在非線性劑量-反應關(guān)系；D：兒童年齡與PI-2覆蓋率間存在非線性劑量-反應關(guān)系。圖中線條為不同年齡組兒童的疫苗血清型/基因型覆蓋率的預測值，陰影部分為預測值的95%置信區(qū)間。

表1 不同年齡兒童肺炎鏈球菌疫苗血清型/基因型覆蓋率的預測結(jié)果 ［%（95%CI）］

3 討論

肺炎鏈球菌是幼兒園兒童最主要的條件致病菌，主要定植在鼻咽部。莢膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）是肺炎鏈球菌致病的主要毒力因子，根據(jù)不同菌株CPS抗原的差異性，可將肺炎鏈球菌分為100 多種血清型［10］。本研究結(jié)果顯示：幼兒園7歲及以下健康兒童鼻咽部中肺炎鏈球菌主要血清型為6B、19F、15A、23A 和34 型，沒有檢測出PCV10 所包含的額外血清型（1、5 和7F型）。我國一項兒童調(diào)查研究表明，成都市5 歲及以下兒童鼻咽部肺炎鏈球菌主要血清型為19F、6B、19A、6A、23F型［11］；重慶市5歲及以下兒童鼻咽部肺炎鏈球菌的主要血清型為23F、11B、9A、7C 型［12］，本研究中血清型分布與上述研究存在差異。國外一項研究顯示，泰國5歲及以下IPD兒童臨床菌株的主要血清型為6B、23F、14、9A、19F型［13］；加拿大18 歲及以下IPD 兒童臨床菌株主要血清型為7F、33F、19A型［5］；美國18歲及以下肺炎兒童臨床菌株主要血清型為19A、35B、3、34型［14］；俄羅斯聯(lián)邦的日托中心6 歲及以下健康兒童鼻咽部菌株主要血清型為4、19F、6 型［15］，本研究中血清型分布與上述研究也存在差異。不同研究中血清型分布的差異性可能與地理位置、菌株來源（定植與感染菌株）或采樣部位、年齡段不同等因素有關(guān)。

本課題組前期研究提示，幼兒園兒童間存在肺炎鏈球菌的班級內(nèi)、班級間的交叉?zhèn)鞑ワL險［16］。幼兒園兒童具有黏膜免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、群體生活且肺炎鏈球菌攜帶率高的特點，是肺炎鏈球菌感染的高危人群。除了加強幼兒園的衛(wèi)生管理外，接種疫苗也是預防疾病最經(jīng)濟、最有效的手段，PCV 是目前為止預防兒童感染肺炎鏈球菌的最有效疫苗。值得注意的是，雖然結(jié)合疫苗所覆蓋血清型是基于免疫群體肺炎鏈球菌的優(yōu)勢血清型分布，但是結(jié)合疫苗的使用會致使人群肺炎鏈球菌的疫苗血清型流行率下降而非疫苗血清型流行率上升［5］；且不同地理位置、不同菌株來源、不同年齡段兒童肺炎鏈球菌疫苗血清型覆蓋率也存在較大波動［2，4，11-15］。因此結(jié)合疫苗的接種規(guī)劃仍依賴于肺炎鏈球菌血清型分布的準確監(jiān)測數(shù)據(jù)，以更好地評估結(jié)合疫苗的有效性。本研究中最常見的血清型為PCV10 血清型6B、19F、23F 與PCV13 血清型19A、6A，超過50%的分離株屬于血清型6B、19F、23F，這與以往我國醫(yī)院兒童臨床分離株研究結(jié)果相似［17-19］，提示PCV 目前仍能覆蓋大部分健康兒童的血清型，但仍需繼續(xù)監(jiān)測PCV13中未涵蓋的血清型15A、23A與34的高流行率狀態(tài)。PCV10 自2008 年在我國上市，并于2017年被PCV13 取代。值得關(guān)注的是，由于肺炎鏈球菌疾病發(fā)生率高、致殘率高、病死率高，所以世界衛(wèi)生組織將肺炎鏈球菌疾病列為需“極高度優(yōu)先”使用疫苗預防的疾病［2］；但是，PCV 至今仍未納入我國兒童免疫規(guī)劃且價格較貴，因此現(xiàn)階段兒童的接種率仍然較低，導致PCV 對預防我國兒童肺炎鏈球菌相關(guān)疾病方面的作用仍較為有限［20］。本研究中的幼兒園兒童肺炎鏈球菌研究結(jié)果顯示，PCV10 與PCV13 血清型覆蓋率分別為53.0%和57.9%，這與一項我國的系統(tǒng)評價研究結(jié)果一致（PCV10 和PCV13 血清型覆蓋率分別為29.7%～62.3%、43.2%～61.4%）［20］。以上研究結(jié)果表明，PCV10 與PCV13 可以有效減少疫苗覆蓋的血清型菌株導致的肺炎鏈球菌感染，降低肺炎鏈球菌疾病負擔，但是疫苗的覆蓋率仍有待進一步提高。

值得重視的是，疫苗血清型覆蓋率隨年齡的動態(tài)變化趨勢至今仍未明確。本研究的創(chuàng)新之處是：采用基于RCS 的logistic 回歸模型探究兒童年齡與肺炎鏈球菌疫苗血清型覆蓋率間的劑量-反應關(guān)系。既往研究主要將年齡劃分為若干組段，從而探討不同年齡段兒童PCV 血清型覆蓋率的差異性，以及運用趨勢χ2檢驗揭示是否存在線性趨勢［20-23］；但是傳統(tǒng)趨勢χ2檢驗無法揭示年齡與疫苗血清型覆蓋率之間是否存在非線性劑量-反應關(guān)系，更重要的是無法探究是否存在閾值效應或拐點，因此無法最大效度地指導疫苗接種。本研究中RCS 模型的分析結(jié)果表明：兒童年齡與肺炎鏈球菌疫苗（PCV10、PCV13）血清型覆蓋率呈現(xiàn)明顯的非線性劑量-反應關(guān)系，表現(xiàn)為先下降后上升再持續(xù)下降的“S”型曲線。同時，本研究通過RCS 模型預測不同年齡段PCV 覆蓋情況，結(jié)果表明：2 歲組兒童的PCV10、PCV13 血清型覆蓋率較高（分別高達88.0%、91.1%），而6 歲組兒童的PCV10、PCV13 血清型覆蓋率較低（分別為39.1%和42.2%），表明低年齡段兒童的PCV 血清型覆蓋率明顯高于高齡段兒童，這一現(xiàn)象可能與低齡兒童肺炎鏈球菌高發(fā)病率、疫苗免疫對象（即5歲以下兒童）感染菌株的血清型分布有關(guān)。值得重視的是，以往研究揭示幼兒園低年齡段兒童肺炎鏈球菌交叉?zhèn)鞑ワL險明顯高于高年齡段［16］。因此，考慮低齡幼兒園兒童肺炎鏈球菌的“高PCV 覆蓋率”和“高傳播風險”兩大特征，今后應重視PCV對幼兒園兒童（特別是2歲組兒童）的重要預防作用，可通過主動免疫預防來降低兒童肺炎鏈球菌感染的發(fā)生率。

結(jié)合疫苗極大地降低了兒童IPD的發(fā)病率，然而由于結(jié)合疫苗的選擇性壓力，全球非疫苗血清型導致的肺炎鏈球菌疾病顯著增加，已成為重要的公共衛(wèi)生問題［5］。而且結(jié)合疫苗僅局限于特定血清型，組分復雜導致生產(chǎn)成本較高。與PCV 相比，重組蛋白疫苗具有更低的成本和更強的免疫原性，并且不受血清型的限制，因此基于肺炎鏈球菌毒力因子和表面蛋白的新型蛋白疫苗已成為重要的候選疫苗［24-25］。既往文獻報道，候選疫苗相關(guān)蛋白，例如菌毛結(jié)構(gòu)（PI-1、PI-2）與毒力因子（lytA、ply 與pspA）是開發(fā)新一代蛋白質(zhì)疫苗的關(guān)鍵候選靶標［2-3，7-9］。因此，本研究分析了菌毛基因（PI-1、PI-2） 與毒力基因（lytA、ply與pspA）在菌株中的流行率，結(jié)果表明：年齡與菌毛基因覆蓋率呈現(xiàn)明顯的非線性劑量-反應關(guān)系，但其在兒童中的總體覆蓋率較低（PI-1為37.7%，PI-2為16.1%）且各年齡階段的覆蓋率也均較低（PI-1為13.0%～58.5%，PI-2為6.0%～29.4%），這與柳州市的醫(yī)院5歲以下兒童菌株的研究結(jié)果有一定差異［7］，提示PI-1與PI-2在人群中的覆蓋率具有地區(qū)差異性，這可能與研究對象特征、樣本類型等差異有關(guān)［7］；年齡與pspA覆蓋率存在線性劑量-反應關(guān)系，但在各年齡段幼兒園兒童中pspA覆蓋率均較低（1.1%～12.9%）；年齡與lytA、ply覆蓋率不存在劑量-反應關(guān)系，但其在幼兒園兒童攜帶菌株中的流行率分別高達99.5%與99.0%，這表明毒力基因lytA、ply在佛山市順德區(qū)幼兒園兒童的肺炎鏈球菌分離株中高度流行，這與以往發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌毒力基因lytA、ply在我國西南部地區(qū)具有極高流行率一致［11，18，26］，提示毒力基因lytA、ply在重組蛋白疫苗的開發(fā)中具有很高的應用潛力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，兒童年齡與PCV10、PCV13血清型覆蓋率呈現(xiàn)明顯的非線性劑量-反應關(guān)系，且低年齡段兒童的血清型預測覆蓋率明顯高于高齡段兒童，2 歲組幼兒園兒童PCV10、PCV13血清型覆蓋率均較高，提示應該重視PCV對幼兒園兒童（特別是2歲兒童）的重要預防作用。同時，所有年齡組的兒童保持蛋白疫苗候選基因lytA與ply的高覆蓋率，為設(shè)計新型肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗提供了新的思路。但是，本研究也存在一定局限性：（1）采用橫斷面研究，只調(diào)查了某一區(qū)域集中時間兒童疫苗的覆蓋情況，無法對疫苗覆蓋的長期動態(tài)變化規(guī)律進行全面評估。因此在后續(xù)研究中可以開展連續(xù)多次、更大范圍的監(jiān)測，評估更大范圍幼兒園兒童疫苗血清型、基因型的覆蓋規(guī)律。（2）本研究是基于幼兒園兒童進行的集中時間、集體采樣研究，同時課題組既往研究表明幼兒園兒童菌株間存在一定交叉?zhèn)鞑ワL險［16］，此類基于幼兒園兒童的研究設(shè)計可能會影響菌株血清型分布，因此今后可進一步開展社區(qū)兒童的肺炎鏈球菌研究來驗證本研究結(jié)果。