循環(huán)腫瘤DNA作為實體腫瘤微小殘留病標志物的研究進展

陳穎 綜述 文飛球 審校

（1.汕頭大學醫(yī)學院深圳兒科臨床學院，廣東深圳 518034；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東深圳 518034）

惡性腫瘤是目前導致死亡的第二大常見原因，無論是在成人或者是兒童，其5年總體生存率不足70%［1］。其中大部分實體腫瘤患者可通過手術(shù)治療，并在術(shù)后接受輔助治療得到緩解。但部分患者在接受手術(shù)之后，體內(nèi)仍存在少量殘留的腫瘤細胞，稱為微小殘留?。╩inimal residual disease,MRD），可影響患者的預(yù)后，并導致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤監(jiān)測的傳統(tǒng)方法包括經(jīng)典的生物標志物檢測、影像學檢查和組織活檢。經(jīng)典的生物標志物檢測具有高靈敏度的特點，但其特異度低，而且一些生物標志物的濃度太低，無法通過適當?shù)姆椒z測到。影像學技術(shù)能協(xié)助腫瘤的診斷，但其有假陽性率高、效率較低、有放射性等缺點。組織活檢是診斷腫瘤的金標準，但相對創(chuàng)傷較大，并且無法檢測整個腫瘤樣本。循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA,ctDNA）克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足，在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛。現(xiàn)對ctDNA檢測在實體腫瘤中的臨床研究進展綜述如下。

1 ctDNA的概述

ctDNA是由腫瘤細胞脫落并釋放進入循環(huán)系統(tǒng)的一種具有特征性的腫瘤生物標志物，已經(jīng)成為一種有前途的實體腫瘤縱向評估的無創(chuàng)生物標志物，其檢測的量化提供了比其他血清學指標更準確的腫瘤負荷評估［2］。ctDNA 是游離DNA（cellfree DNA）的組成部分，它來源于癌變組織中，因此它可以反映腫瘤內(nèi)部及其異質(zhì)性，并能準確反映任何現(xiàn)有腫瘤中含有癌癥特異性DNA 突變的遺傳譜。通過從血液中提取ctDNA，我們可以更好地識別和持續(xù)監(jiān)測腫瘤突變，無創(chuàng)地追蹤腫瘤負荷的動態(tài)變化，并實時評估MRD 和疾病狀態(tài)。與組織活檢相比，連續(xù)監(jiān)測血漿ctDNA 可以識別腫瘤核心部位的遺傳變異，動態(tài)反映整個腫瘤的異質(zhì)性，并且具有高靈敏度和特異度、創(chuàng)傷小且無放射性等優(yōu)點［3］。

2 檢測ctDNA 評估MDR 在臨床的應(yīng)用及展望

2.1 腫瘤負荷及治療反應(yīng)評估

Marsavela 等［4］回顧性分析了108 例黑色素瘤患者的血漿樣本，將有臟器轉(zhuǎn)移與僅有淋巴結(jié)、皮下或肺部病變的患者相比，有臟器轉(zhuǎn)移者ctDNA水平和檢出率更高。其中在19 例皮膚、皮下組織或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，47%的患者在進展時可檢測到ctDNA，而在5例肺轉(zhuǎn)移病例中有40%的患者可檢測到ctDNA；而且對治療有反應(yīng)的患者的檢出率（52%）明顯低于對治療無反應(yīng)且腫瘤大小未縮小的患者（檢出率為78%），表明中晚期腫瘤患者ctDNA 的檢出率顯著高于早期腫瘤患者，這可能與晚期實體腫瘤體積較大、腫瘤細胞較多有關(guān)［5］。盡管血液循環(huán)中含有的ctDNA 濃度很低，但ctDNA 濃度與腫瘤體積呈正相關(guān)，其檢測的濃度水平也反映了腫瘤負荷的變化［6］。Ruhen 等［7］應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）分析對12 只橫紋肌肉瘤小鼠模型和28 例橫紋肌肉瘤患兒進行研究也證實了這一點。另外，在同一種腫瘤中，T分期較高或有淋巴結(jié)受累的患者更有可能檢測到ctDNA［8］。應(yīng)用靶向治療6周后的轉(zhuǎn)移性胃癌患者ctDNA 水平的變化可以預(yù)測其腫瘤是否緩解，ctDNA 水平降低與預(yù)后改善相關(guān)［9］。有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者術(shù)前化療后的ctDNA水平顯著降低，提示這些患者有更好的腫瘤緩解，說明動態(tài)ctDNA 監(jiān)測有助于調(diào)整術(shù)前治療強度和制定合適的手術(shù)方案，且可有助于預(yù)測輔助化療有效的患者［10-11］。然而，目前對于ctDNA檢測的水平分類和量化標準尚無共識。未來需要制定ctDNA 水平的量化標準，協(xié)助腫瘤的診斷及分期，以便于實現(xiàn)實體腫瘤患者的分級管理。

2.2 術(shù)后縱向評估和復(fù)發(fā)風險預(yù)測

ctDNA 作為生物標志物在協(xié)助腫瘤早期診斷、監(jiān)測治療反應(yīng)和預(yù)測預(yù)后等方面有潛在的價值［12］。Chen 等［13］報道了1 例Ⅰ期胰腺癌患者，利用二代測序（next generation sequencing, NGS）方法對該患者血漿中提取到的DNA 進行測序，血漿樣本中未檢測到的KRAS G12D和TP53 P152這兩種致病性突變，術(shù)后1.5年疾病進展到晚期時，兩種致病突變均呈陽性；而另一例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者術(shù)前檢測到腫瘤的BRAF、NRAS和PIK3CA原發(fā)突變，術(shù)后連續(xù)監(jiān)測沒有發(fā)現(xiàn)新的突變，盡管病情進展到Ⅳ期，患者手術(shù)后3年仍然存活，表明ctDNA陽性不僅可以預(yù)測預(yù)后，同時也可以預(yù)測臨床進展情況［14］。Seidel等［2］隨訪了6例尤文氏肉瘤患兒，結(jié)果ctDNA 濃度持續(xù)上升的患兒腫瘤也在進展，腫瘤得到緩解的患兒ctDNA 濃度下降甚至檢測呈陰性。術(shù)后ctDNA 檢測突變基因陽性與疾病進展相關(guān)，這種ctDNA 陽性檢測結(jié)果明顯早于臨床表現(xiàn)和影像學檢查進展［15］?？v向ctDNA 監(jiān)測結(jié)合克隆信息可以對高危患者進行分層，有助于識別易復(fù)發(fā)的高風險患者，并推斷 ctDNA突變的變異起源。最早在術(shù)后1周左右檢測到血液中ctDNA陽性就可確定為復(fù)發(fā)的高?；颊撸?6］。與ctDNA 陰性的患者相比，在術(shù)后檢測到ctDNA 保持陽性或由陰性轉(zhuǎn)為陽性的患者，幾乎都會進展或者復(fù)發(fā)［17］。ctDNA陽性患者的疾病復(fù)發(fā)可能性比ctDNA陰性患者高40倍以上［18］。另一方面，治療后檢測到突變基因表明腫瘤惡性程度較高，這也是復(fù)發(fā)的一個強大而獨立的危險因素。Yue 等［19］對22 例接受新輔助治療的非小細胞肺癌患者進行術(shù)后連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3個月檢測ctDNA預(yù)測復(fù)發(fā)的靈敏度已超過80%，特異度可達90%，故縱向檢測ctDNA已成為了解術(shù)后患者轉(zhuǎn)歸的重要手段，它也是目前唯一能夠在影像學檢查或臨床癥狀出現(xiàn)之前評估患者腫瘤復(fù)發(fā)情況的重要方法。但是術(shù)后1～2 周ctDNA陰性并不意味著患者未來不會復(fù)發(fā)［20］。

2.3 指導臨床輔助化療應(yīng)用

多種實體腫瘤類型的各項研究表明，經(jīng)明確的局部治療后，可檢測到MRD 的患者的復(fù)發(fā)風險極高，而輔助化療可以降低ctDNA 水平［21］。通過ctDNA 檢測可以識別根治切除后的MRD，從而識別出復(fù)發(fā)風險較高的患者，并預(yù)測輔助治療的療效。Tie 等［22］在96 個術(shù)后樣本中發(fā)現(xiàn)，21%可檢測到ctDNA，這些患者無病生存率低；化療后仍可檢測到ctDNA 時，其3 年無病生存率為30%，而ctDNA 檢測陰性者無病生存率可達77%。Madanat-Harjuoja 等［23］在50 例腎母細胞瘤患兒中也發(fā)現(xiàn)能檢測到ctDNA 的患兒長期無病生存率低于未檢測到ctDNA的患兒，這表明術(shù)后ctDNA的檢測有助于指導輔助治療決策和減少過度治療以提高無病生存率。在復(fù)發(fā)早期階段無法通過影像學檢查發(fā)現(xiàn)時，ctDNA 檢測陽性可以幫助解決不明確的結(jié)果，為啟動化療提供證據(jù)。術(shù)后多時間點檢測ctDNA陽性的患者可以考慮進行輔助化療，以獲得良好的預(yù)后；相反，ctDNA結(jié)果陰性的患者可減少或放棄不必要的化療，避免相關(guān)的不良反應(yīng)和并發(fā)癥［24］。ctDNA 狀態(tài)可以識別真正受益于輔助化療治療的患者，以避免無效輔助化療的不良反應(yīng)，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量［25］。因此，早期行ctDNA 檢測評估MRD 狀態(tài)對在輔助治療開始的標準時間窗內(nèi)做出治療決策至關(guān)重要。

對于大多數(shù)實體腫瘤的治療，部分患者手術(shù)切除腫瘤后繼續(xù)進行輔助化療來徹底消滅可能存在的腫瘤細胞或防止復(fù)發(fā)，手術(shù)治療后，部分患者實際上已經(jīng)達到完全緩解狀態(tài)，是否需要再行輔助化療，仍然是臨床上需要解決的重要問題。應(yīng)用可靠的生物標志物評估篩選出適合輔助化療的患者，可以避免過度治療導致的藥物毒性。ctDNA MRD 分析通過提供腫瘤基因組數(shù)據(jù)方式，幫助指導系統(tǒng)性治療的時間、強度、治療方案和類型，制定無轉(zhuǎn)移性腫瘤更個性化的臨床決策。另外，ctDNA也可以作為影像學技術(shù)的補充，判斷輔助化療的效果，幫助選擇非手術(shù)治療的患者，指導有不同復(fù)發(fā)風險的患者選擇不同的治療策略。通過利用MRD 檢測結(jié)果，可實現(xiàn)對臨床腫瘤患者的個體化輔助治療。

2.4 發(fā)展方向及臨床應(yīng)用前景

盡管早期ctDNA 動態(tài)檢測與預(yù)后和復(fù)發(fā)關(guān)系密切，且在臨床進展前或影像學復(fù)發(fā)前可以發(fā)現(xiàn)耐藥突變或MRD，但根據(jù)這些結(jié)果采取相應(yīng)的措施是否可以改善預(yù)后，還需進行隨機干預(yù)的臨床試驗來評估ctDNA 監(jiān)測的效果。在目前已發(fā)表的相關(guān)研究中，大多數(shù)樣本量相對較小，且多為回顧性研究，未來需開展更多的、樣本量更大的前瞻性隊列研究，并在建立一個統(tǒng)一的臨床標準下，才能將ctDNA 技術(shù)作為常規(guī)化臨床檢測。同時可基于從游離DNA 中提取的腫瘤基因組特征來指導個性化治療［26］。此外，在NGS 和PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，國內(nèi)外學者也在開發(fā)更多新的檢測方法應(yīng)用到臨床實踐，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測工作流程將會進一步被簡化，檢測成本也將進一步降低，檢測的特異度和靈敏度將會得到提高。

3 ctDNA的檢測方法

3.1 NGS

目前有幾種方法用于ctDNA 檢測，最普遍的是從血漿中提取所有ctDNA 片段的綜合分析，稱之為“液體活檢”，也被稱為基因組測序。NGS 技術(shù)具有高通量和能夠檢測幾乎所有類型的突變類型，如SNV、indel、融合和拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）的優(yōu)點，可用于同時對多個基因和變異進行測序，也可用于鑒定新的基因修飾和分析克隆進化［27］。另外，采用“液體活檢”的方法，也避免了傳統(tǒng)影像學檢查帶來的電離輻射，其靈敏度達0.01%［28］。但該方法需測定所有遺傳序列，且需要非常高的測序深度和復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，因此其工作量較大，花費也相對較高，故而在重復(fù)應(yīng)用時效率和成本效益較低［29］?；贜GS 并進行改良的另一種基因組測序方法，稱為全基因組重測序（whole genome sequencing, WGS），該方法可減少常規(guī)NGS 存在的不足，實現(xiàn)更高的測序覆蓋率［30］。

3.2 PCR

現(xiàn)常用的另一種方法，是基于定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）或數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（digital polymerase chain reaction, dPCR）的標準突變檢測方法，是一種在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DNA 突變，隨后利用已知突變的信息，在血漿ctDNA 中進行分析的方法。qPCR和dPCR都是以等位基因特異性的形式進行，每種檢測方法都設(shè)計用于檢測特定序列位點上的特定突變。液滴式dPCR 具有較高的靈敏度和絕對定量。Link-Lenczowska 等［31］應(yīng)用qPCR 和液滴式dPCR方法在63例骨髓增生性腫瘤患者中進行監(jiān)測和比較，結(jié)果顯示這兩種PCR 方法均能檢測到JAK2基因V617F 突變，且具有較高的靈敏度，分別為0.12%和0.01%。PCR 可以檢測特異性基因變化，具有較高的檢測靈敏度，且實驗設(shè)置簡單，不需要復(fù)雜的信息學支持，相對成本較低，很適用于MRD的重復(fù)檢測［32］。但該方法特異性相對不足，且在實際應(yīng)用中，一份血漿樣本只能檢測到2～3 個已知突變［29］。且檢測需要已知的“腫瘤信息”，也不太適用于腫瘤的初始診斷。

3.3 其他新興技術(shù)

為提高ctDNA 檢測的特異度及靈敏度，一些新興技術(shù)也在研發(fā)之中，如片段長度分析、變性毛細管電泳檢測法、基因組和表觀基因組癌癥特征的血漿ctDNA 檢測、癌癥個性化分析等也已被用于檢測ctDNA。Vessies 等［33］對36例患者的血漿中檢測到的21 705 個片段進行長度分析，并結(jié)合變異檢測對ctDNA 長短進行比對和分析發(fā)現(xiàn)，來源于腫瘤的DNA 片段相對較短。這種方法提高了檢測MRD 的靈敏度，同時也排除了細胞的正常凋亡、炎癥刺激等向血液釋放細胞DNA帶來的影響。在腫瘤特異性突變檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上進行分析，既增加了ctDNA 檢測的靈敏度，又排除了非腫瘤源性改變帶來的假陽性?；蚪M和表觀基因組癌癥特征分析是在腫瘤基因未知的情況下通過血漿ctDNA 進行MRD 檢測，該方法有以下幾個優(yōu)勢：（1）周轉(zhuǎn)時間更快；（2）成本相對較低；（3）可降低檢測的復(fù)雜性，但其特異度和靈敏度有待更多的臨床研究進行系統(tǒng)評估［34］。

目前用于檢測MRD 的方法幾乎都依賴于腫瘤組織的初始基因組圖譜，以識別特定于每個患者的腫瘤衍生突變，ctDNA 檢測可以精確評估這些改變。

4 總結(jié)

ctDNA 檢測與傳統(tǒng)檢測方法相比具有無創(chuàng)性、低成本、無輻射等優(yōu)點，并可用于疾病進展和預(yù)后評估。通過監(jiān)測患者ctDNA 水平的變化，對患者血漿中腫瘤特異性DNA 突變的檢測和量化，提供更明智或適當?shù)闹委煕Q策，指導臨床輔助化療應(yīng)用，這與傳統(tǒng)的組織活檢和放射掃描相比更有優(yōu)勢，將成為監(jiān)測和管理實體腫瘤患者的重要方法。但現(xiàn)有的檢測技術(shù)尚未成熟，其特異度及靈敏度仍不能滿足臨床應(yīng)用要求，有待進一步提高。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。