爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白2 靶蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

張衛(wèi)彬，董佳，索立達(dá)，梁向南，武云飛，邱春瑜，李博，鄭彬

1錦州市中心醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121000

2錦州市婦嬰醫(yī)院放射線科，遼寧 錦州 121000

3大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，遼寧 大連 112000

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種全球性發(fā)病的惡性腫瘤，其發(fā)病例數(shù)占原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）的75%～85%，且多數(shù)患者5 年生存率較低[1]。由于中國(guó)慢性乙型肝炎的發(fā)病率較高，以致HCC 的發(fā)病率較歐美發(fā)達(dá)國(guó)家高[2]，發(fā)病例數(shù)超全球HCC 患者的1/2。雖然手術(shù)治療和放化療有利于提高HCC 患者的5 年生存率，但易導(dǎo)致多種并發(fā)癥，影響患者生活質(zhì)量[3]。目前，雖然全世界的研究者對(duì)HCC 的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛且深入的研究，但仍未完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為HCC 的發(fā)病與癌基因的表達(dá)密切相關(guān)[4]。因此，探討癌基因的表達(dá)與HCC 發(fā)病之間的關(guān)系具有重要的臨床意義。爪蟾驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白2 靶蛋白（targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾蜍卵中，具有促進(jìn)染色質(zhì)微管成核、調(diào)控紡錘體形成的功能，是一種與細(xì)胞核增殖微管密切相關(guān)的蛋白[5]。而且，TPX2 可調(diào)控極光激酶A（aurora kinase A，AURKA），將AURKA 錨定于有絲分裂紡錘體微管[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，TPX2 在多種疾病（包括色素性視網(wǎng)膜炎、宮頸癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌以及胃癌等）中高表達(dá)且影響患者預(yù)后[7-11]。然而，目前尚沒有學(xué)者對(duì)TPX2 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法分析TPX2 在HCC 中的表達(dá)情況及其對(duì)患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于各網(wǎng)絡(luò)在線共享可用數(shù)據(jù)庫(kù)，均是以癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分別為GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）、K-M Plot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）、UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）、HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/）、ACLBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.aclbi.com/static/index.html）。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析方法

通過UALCAN 與K-M Plot 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPX2蛋白和mRNA 在HCC 組織中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系。利用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPX2 蛋白在HCC 組織中的表達(dá)水平。

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HCC 組織中TPX2 與腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）的相關(guān)性進(jìn)行分析；再利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPX2 在HCC組織中的表達(dá)水平與TP53突變之間的相關(guān)性。

利用ACLBI 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPX2 在HCC 組織中的表達(dá)水平及其對(duì)患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線中的曲線下面積（area under the curve，AUC）判斷TPX2 對(duì)HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法；繪制ROC曲線，分析TPX2 對(duì)HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPX2 在HCC 中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，不同分期和分級(jí)HCC 組織中TPX2mRNA 表達(dá)水平均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、表2）

表1 正常組織和不同分期HCC 組織中TPX2 mRNA 表達(dá)水平的比較[M（P25，P75）]

表2 正常組織和不同分級(jí)HCC 組織中TPX2 mRNA 表達(dá)水平的比較[M（P25，P75）]

K-M Plot 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，TPX2 低表達(dá)HCC 患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）、總生存期（overall survival，OS）、無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）及疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）均優(yōu)于TPX2 高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=2.03、2.88、1.62、1.58，P＜0.05）。（圖1）

圖1 不同TPX2表達(dá)情況HCC患者的生存曲線

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化分析結(jié)果顯示，HCC組織中TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常肝組織。（圖2）

圖2 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化分析TPX2在正常肝組織和HCC組織中的表達(dá)（免疫組化染色，×200）

2.2 TPX2 與TP53 的相關(guān)性分析

UALCAN 與GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，HCC 組織中TPX2 與TP53 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.34，P＜0.05），且TP53突變組TPX2mRNA 表達(dá)水平為12.25（7.08，16.77），高于TP53未突變組的4.29（2.15，6.64），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=180.183，P＜0.05）。

2.3 TPX2 對(duì)HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ACLBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，隨著TPX2表達(dá)的增高，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加（圖3A）；TPX2低表達(dá)HCC患者的OS明顯優(yōu)于TPX2高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=2.057，P＜0.01）（圖3B）；TPX2表達(dá)預(yù)測(cè)HCC 患者1、3、5 年OS 的ROC 曲線的AUC 分別為0.731（95%CI：0.659～0.803）、0.664（95%CI：0.588～0.739）和0.644（95%CI：0.551～0.738）（圖3C）。

圖3 TPX2表達(dá)對(duì)HCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

HCC 雖然是由多種致病因素和遺傳因素協(xié)同作用導(dǎo)致的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[12-13]，但致病癌基因在其發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮重要作用。目前對(duì)HCC 相關(guān)癌基因的研究還不夠深入，又缺乏相應(yīng)的靶向治療藥物，從而難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后[14]。因此，迫切需要尋找預(yù)測(cè)患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

TPX2位于染色體20q11.21，可通過其羧基末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)細(xì)胞著絲粒處微管組裝，并受Ran-GFP 調(diào)控，在有絲分裂早期被釋放，進(jìn)而與AURKA 協(xié)同促進(jìn)紡錘體裝配的起始[15]；而且，TPX2 通過促進(jìn)AURKA“Thr-288”自磷酸化從而激活A(yù)URKA，并保護(hù)該殘基免于去磷酸化[16]。TPX2 與細(xì)胞周期密切相關(guān)，其表達(dá)可見于細(xì)胞G1期向S 期過渡時(shí)期，而消失于細(xì)胞質(zhì)分裂期[17]。研究報(bào)道，TPX2 在惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，且由于TPX2中心體異常擴(kuò)增，常導(dǎo)致DNA 異倍體以及多倍體形成，造成腫瘤細(xì)胞大量增殖與惡化，并影響細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡[18]。因此，TPX2 的異常表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移具有重要價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 在大部分腫瘤組織中高表達(dá)，不利于患者的OS。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，TPX2及其共表達(dá)基因在HCC 組織中均高表達(dá)，是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，不利于患者的OS。此外，TPX2與其共表達(dá)基因的基因本位（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集情況較一致。有學(xué)者通過對(duì)43 例神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 可正向調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，并通過增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力促進(jìn)細(xì)胞存活，從而不利于神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的OS；而且，研究認(rèn)為，TPX2 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中起致癌作用，可作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物[19]。此外，另有研究通過實(shí)驗(yàn)分析3952 例乳腺癌患者的TPX2 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，TPX2在乳腺癌中顯著高表達(dá)，且不利于患者的OS，并認(rèn)為其可用作乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[20]。Wang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中TPX2mRNA 和蛋白均高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良有關(guān)，是子宮內(nèi)膜癌的易感基因。Sui 等[22]分析250 例食管癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，TPX2 在食管癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且不利于患者的5 年OS，可作為評(píng)估食管癌患者預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。Zhu 等[23]通過分析HCC 組織中TPX2 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平顯著上調(diào)，并與患者種族、年齡、體重、臨床分期和腫瘤分級(jí)相關(guān)，且不利于患者的OS、PFS、DFS及DSS。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，乙肝病毒可導(dǎo)致染色體著絲粒處變異，從而影響紡錘體與著絲粒的附著，最終造成染色體分離困難[24]。因此，眾多學(xué)者在不同領(lǐng)域獲得的研究結(jié)果均一致認(rèn)為TPX2在腫瘤組織中高表達(dá)，不利于患者預(yù)后，與本研究結(jié)果一致。

TPX2 的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和TP53突變具有相關(guān)性。Wang 等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 可通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路調(diào)節(jié)CXC 趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor 5，CXCR5），維持HCC 中CD8+T 細(xì)胞中的抗腫瘤作用。此外，有研究者認(rèn)為TPX2 可與人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-A+021結(jié)合，從而更易被樹突狀細(xì)胞識(shí)別，增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞的能力[26]。國(guó)外學(xué)者對(duì)253 例侵襲性乳腺癌組織進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 過表達(dá)與侵襲性乳腺癌之間存在明顯相關(guān)性，并認(rèn)為TPX2 過表達(dá)常發(fā)生在TP53突變和倍體升高的情況下[27]。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 在HCC 中高表達(dá)，且TPX2 高表達(dá)更加不利于患者預(yù)后；同時(shí)，HCC 組織中TPX2 與TP53 表達(dá)呈正相關(guān)，且TP53突變組TPX2mRNA 表達(dá)水平高于TP53未突變組。本研究結(jié)果與國(guó)外學(xué)者在侵襲性乳腺癌研究中得到的結(jié)果一致。有研究者認(rèn)為，TPX2 在HCC 中的致病機(jī)制主要是其高表達(dá)改變了細(xì)胞核中染色體分離的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂和染色體不穩(wěn)定[28]。TPX2可能是一種癌基因，在HCC 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和TP53突變有關(guān)。

通路分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 在HCC 中與磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路顯著相關(guān)，而PI3K/AKT/MTOR 信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，且AKT 的活化與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲密切相關(guān)[29]。因此，TPX2 可能與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲有關(guān)。Huang等[30]通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)HCC 組織、鄰近正常肝組織以及HCC 細(xì)胞系中TPX2mRNA 和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TPX2 可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制HCC 的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，認(rèn)為TPX2 可能是治療HCC 的潛在靶標(biāo)。而Zou 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，敲低TPX2表達(dá)，可誘導(dǎo)G2、M 期停滯，從而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。此外，TPX2 與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）通路基因基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、Slug 以及扭轉(zhuǎn)家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（twist family bHLH transcription factor 1，TWIST1）密切相關(guān)，而且其在DNA 損傷反應(yīng)中發(fā)揮放大作用[32]。有研究表明，在結(jié)腸癌中，TPX2和AURKA的擴(kuò)增與MYC存在相關(guān)性，且其與MYC 下游靶基因的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖以及惡化過程中發(fā)揮協(xié)同作用[33]。因此，MYC被認(rèn)為是AURKA/TPX2 通路下游的重要基因。同時(shí)，TPX2 在細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、腫瘤增殖特征及膠原蛋白形成等通路中也發(fā)揮重要作用。

總之，本研究通過生物信息學(xué)方法分析TPX2在HCC 中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果表明TPX2 可能是HCC 的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。但是，這種分析結(jié)果還需要相應(yīng)的基礎(chǔ)研究和臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證，以便進(jìn)一步明確TPX2基因在HCC 患者預(yù)后中的分子機(jī)制及臨床意義。