骨髓增生異常綜合征基因突變特征的臨床分析△

安萬花，郭淑利，肖蓬莉，王萬里，田煥煥，彭靚，楊璞，毛慧云，王慧睿#

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院，河南 新鄉(xiāng) 453003

2鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 洛陽 471009

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年1 月至2020 年12 月于鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)的MDS 患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合MDS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不完整。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入43 例MDS 患者，其中，男26 例，女17 例；年齡55～71 歲，中位年齡65歲；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（0.53～19.78）×109/L，中位白細(xì)胞計(jì)數(shù)2.80×109/L；血紅蛋白（31～114）g/L，中位血紅蛋白68 g/L；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（0.15～39.60）×109/L，中位中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)1.30×109/L；血小板計(jì)數(shù)（6～216）×109/L，中位血小板計(jì)數(shù)43×109/L；MDS 的診斷與分型[4]：MDS 伴單系病態(tài)造血（MDS-SLD）4例，MDS 伴多系病態(tài)造血（MDS-MLD）10 例，MDS伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞伴單系病態(tài)造血（MDS-RSSLD）2 例，MDS 伴孤立5q（MDS-5q-）1 例，MDS 伴原始細(xì)胞增多Ⅰ型（MDS-EB-1）20 例，MDS 伴原始細(xì)胞增多Ⅱ型（MDS-EB-2）5 例，MDS 不能分類型（MDS-U）1 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 染色體核型分析

收集骨髓細(xì)胞，經(jīng)過24 h 培養(yǎng)后制片，采用常規(guī)R 顯帶技術(shù)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行染色體核型描述。

1.3 二代測(cè)序靶向檢測(cè)基因突變

提取骨髓液（2～5 ml）中的gDNA，通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)，一次性抓取待檢測(cè)的所有基因（髓系血液疾病34 種高頻突變基因），并將構(gòu)建好的文庫用illumina 平臺(tái)NextSeq550 測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。本檢測(cè)涵蓋了所檢測(cè)基因編碼區(qū)及附近內(nèi)含子區(qū)的點(diǎn)突變、小片段插入和缺失型突變，依據(jù)突變基因在血液病中的突變類型和功能，并參照指南和文獻(xiàn)報(bào)道判定檢測(cè)結(jié)果。測(cè)序由康圣環(huán)球（北京海思特醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室）完成。

1.4 治療方案

結(jié)合IPSS-R 預(yù)后分層、年齡、依從性等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，選擇治療方案。21 例較低危組患者以支持治療為主，包括成分輸血、造血生長(zhǎng)因子及免疫調(diào)節(jié)劑等；20 例較高危組患者多采用去甲基化藥物、預(yù)激方案等化療及異基因造血干細(xì)胞移植；2例患者定期門診復(fù)查，未行相關(guān)治療。

1.5 隨訪

通過門診、住院及電話進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020 年12 月31 日，隨訪內(nèi)容主要為生存狀態(tài)、死亡時(shí)間及原因?？偵嫫冢╫verall survival，OS）：從疾病確診日期到死亡或末次隨訪日期。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并采用Graphpad Prism9.0 及Circos V0.69 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因突變特征分析

本研究共檢測(cè)到33 種基因突變，每例患者的突變基因個(gè)數(shù)為0～8 個(gè)，中位突變基因個(gè)數(shù)為2個(gè)。40 例（93.02%）患者攜帶至少1 個(gè)基因突變，其中11 例（25.58%）患者攜帶1 個(gè)基因突變，29 例（67.44%）患者攜帶≥2 個(gè)基因突變；在攜帶1 個(gè)基因突變的患者中，腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）突變率最高，占18.18%。

檢出的異常基因中，檢出頻率＞5%的基因共16 個(gè)，其中突變例數(shù)較多的基因有U2 小核RNA 輔助因子1（U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1，U2AF1）、ASXL 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（ASXL transcriptional regulator 1，ASXL1）、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3α（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）、甲基胞嘧啶雙加氧酶2（tet methylcytosine dioxygenase 2，TET2）、RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子1（RUNX family transcription factor 1，RUNX1）（圖1A）；突變負(fù)荷（即變異豐度）中位數(shù)較高的基因有E1A 結(jié)合蛋白p300（E1A binding protein p300，EP300）（49.1%）、CREB 結(jié)合蛋白（CREB binding protein，CREBBP）（47.6%）、ASXL1（47.1%）、TP53（45.0%）、U2AF1（42.7%）、剪接因子3b 亞基1（splicing factor 3b subunit 1，SF3B1）（41.0%）（圖1B）。

圖1 MDS患者檢出基因的突變例數(shù)及突變負(fù)荷

依據(jù)MDS 患者檢出突變基因的功能進(jìn)行分類，突變頻率從高到低依次為表觀遺傳相關(guān)基因[占62.79%（27/43），包括ASXL1、DNMT3A、DNMT3B、TET2、SET結(jié)合蛋白1（SET binding protein 1，SETBP1）、BCL6 輔抑制物（BCL6 corepressor，BCOR）、異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2D（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）、zeste 2 多梳抑制復(fù)合體2 亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和WT1]、剪接子相關(guān)基因[占46.51%（20/43），包括U2AF1、SF3B1、富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2（serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2）和鋅指CCCH 型RNA 結(jié)合基序和富含絲氨酸/精氨酸（zinc finger CCCH-type,RNA binding motif and serine/arginine rich 2，ZRSR2）]、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因[占37.21%（16/43），包括RUNX1、PHD手指蛋白6（PHD finger protein 6，PHF6）、CREBBP、cut 樣同源盒1（cut like homeobox 1，CUX1）、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPA）、GATA 結(jié)合蛋白2（GATA binding protein 2，GATA2）、親嗜性病毒整合位點(diǎn)1（ecotropic viral integrationsite 1，EVI1）和ETV6]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因[占30.23%（13/43），包括蛋白酪氨酸磷酸酶非受體11 型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）、Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、NRAS、Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、KIT、CBL]、細(xì)胞增殖或凋亡相關(guān)基因[占18.60%（8/43），包括TP53和核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）]和其他功能[占11.63%（5/43），包括STAG2和EP300]（表1）。其中，表觀遺傳基因組（n=27）患者基因突變個(gè)數(shù)為3.00（2.00，5.00）個(gè)，明顯多于非表觀遺傳基因組（n=16）的1.00（1.00，2.80）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.922，P=0.003）；剪接子相關(guān)基因U2AF1為本研究檢出率最高的突變基因，U2AF1突變組（n=10）患者基因突變個(gè)數(shù)為4.00（2.00，5.00）個(gè)，多于非突變組（n=33）的2.00（1.00，3.00）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.288，P=0.022）。

根據(jù)坑槽大小，結(jié)合實(shí)際情況選用人工夯實(shí)或小型機(jī)具壓實(shí)。坑槽壓實(shí)后應(yīng)在表面均勻撒布一層細(xì)砂，使細(xì)砂填充表面孔隙，減少路表水的下滲，最后將修補(bǔ)完成的坑槽清潔干凈?？硬坌扪a(bǔ)完成后，修補(bǔ)表面應(yīng)呈中間略高于四周的弧形，以避免修補(bǔ)表面在行車荷載的二次碾壓下形成凹槽。

表1 43 例MDS 患者檢出33 種基因的突變情況

2.2 突變基因關(guān)聯(lián)性分析

67.44%（29/43）攜帶≥2 個(gè)突變基因的患者，基因伴隨突變發(fā)生在單一功能組內(nèi)的比例（55.20%）高于發(fā)生在不同功能組內(nèi)（44.80%）。本研究突變頻率較高的基因中，U2AF1、ASXL1與DNMT3A往往與其他突變伴隨出現(xiàn)。

表觀遺傳相關(guān)基因突變分析：表觀遺傳相關(guān)基因突變數(shù)占總突變數(shù)的37.07%（43/116）（表1），該類基因間伴隨突變包括：ASXL1-BCOR、ASXL1-SETBP1、ASXL1-DNMT3A、ASXL1-EZH2、ASXL1-TET2、ASXL1-IDH1、BCOR-EZH2、IDH1-WT1、IDH2-TET2、DNMT3A-TET2、DNMT3A-IDH1、SETBP1-DNMT3A、SETBP1-TET2、SETBP1-IDH1。

非表觀遺傳相關(guān)基因突變分析：U2AF1與NRAS、CREBBP伴隨突變的比例較高。剪接子相關(guān)基因突變常與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因突變常伴隨出現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因突變與本功能組內(nèi)基因間伴隨突變較常見。

2.3 基因突變個(gè)數(shù)與MDS 亞型的關(guān)系

不同亞型MDS 中，基因突變個(gè)數(shù)最多的是MDS-U，共8 個(gè)（圖2A）。MDS-MLD、MDS-SLD、MDS-EB-1、MDS-EB-2 和MDS-U 中，攜帶3 個(gè)以上突變比例逐漸升高（圖2B）。在各亞型中，伴有0個(gè)基因突變的比例分別為MDS-MLD 10%，MDSSLD 25%，MDS-EB-2 20%；伴有1 個(gè)基因突變的比例分別為MDS-MLD 30%，MDS-EB-1 30%，MDSEB-2 20%，MDS-RS-SLD 50%；伴有2 個(gè)基因突變的比例分別為MDS-MLD 40%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 15%，MDS-RS-SLD 50%；伴有3 個(gè)基因突變的比例分別為MDS-MLD 10%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 25%，MDS-EB-2 20%，MDS-5q-100%；伴有3 個(gè)以上基因突變的比例分別為MDSMLD 10%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 30%，MDSEB-2 40%，MDS-U 100%（圖2B）。

圖2 基因突變個(gè)數(shù)和構(gòu)成比與MDS亞型的關(guān)系

2.4 基因突變與IPSS-R 預(yù)后分層的關(guān)系

高危+極高危組MDS 患者基因突變個(gè)數(shù)和染色體異常數(shù)目均多于低危+中危組患者，NRAS突變率高于低危+中危組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。高危+極高危組6 例NRAS突變患者截至末次隨訪時(shí)，死亡5 例（83.33%）。

表2 低危+中危組與高危+極高危組MDS患者基因突變情況的比較

2.5 基因突變與染色體核型的關(guān)系

本研究中，異常核型患者基因突變比例為93.75%（15/16），與正常核型患者基因突變比例的92.59%（25/27）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中5 例SETBP1突變均發(fā)生在異常核型患者中，截至末次隨訪，死亡4 例（80.00%）。

2.6 基因突變與年齡的關(guān)系

根據(jù)患者年齡分組，年齡≥70 歲MDS 患者SF3B1突變率為26.67%（4/15），高于＜70 歲患者的0%（0/28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）。SF3B1突變患者中有1 例患者OS 最長(zhǎng)達(dá)98 個(gè)月，截至隨訪結(jié)束之日仍生存。

3 討論

MDS 的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、復(fù)雜的病理過程，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。當(dāng)前，二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展迅速，本研究旨在探討MDS 基因突變特征與臨床特征的關(guān)系。本研究對(duì)43 例MDS 患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，U2AF1突變頻率最高，與李冰等[9]報(bào)道最高突變基因一致，并發(fā)現(xiàn)U2AF1突變組基因突變個(gè)數(shù)多于非突變組。Hosono[10]報(bào)道MDS 患者突變頻率最高的基因?yàn)镾F3B1。Tefferi等[11]通過對(duì)179 例MDS 患者的二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，ASXL1的突變頻率最高。以上國(guó)內(nèi)外研究的差異可能是由地理位置、生活習(xí)慣和環(huán)境等因素引起。

本研究共檢測(cè)出MDS 突變基因33 種，根據(jù)功能不同，主要涉及表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、剪接因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡增殖等相關(guān)基因[9-10,12]，其中最常見的突變基因?yàn)楸碛^遺傳相關(guān)基因，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。除表觀遺傳相關(guān)基因外，剪接子相關(guān)基因突變常與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因突變伴隨出現(xiàn)，提示剪接子相關(guān)基因突變與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因突變之間可能有協(xié)同促進(jìn)MDS 發(fā)生的作用。本研究突變頻率較高的基因中，ASXL1往往與其他突變伴隨出現(xiàn)，與既往報(bào)道一致[13]。本研究中1例老年男性患者存在ASXL1、SETBP1、NRAS、KRAS、IDH1、PTPN11、DNMT3A、CBL伴隨突變，確診14 個(gè)月后死亡。與文獻(xiàn)報(bào)道的ASXL1和SETBP1共同突變可驅(qū)動(dòng)MDS 轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病相符[14]，提示聯(lián)合基因突變患者的預(yù)后可能較差。

本研究中，93.02%的患者攜帶至少1 個(gè)基因突變，符合既往研究報(bào)道[1-3]。不同亞型MDS 中，基因突變個(gè)數(shù)最多的是MDS-U，共8 個(gè)。MDS-MLD、MDS-SLD、MDS-EB-1、MDS-EB-2 和MDS-U 中，攜帶3 個(gè)以上基因突變比例逐漸升高，與以往研究結(jié)果相近[15]。高危+極高危組有6 例NRAS突變患者，截至末次隨訪，死亡5 例（83.33%）。有文獻(xiàn)報(bào)道，NRAS突變與較短的OS 相關(guān)，且向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)較高[16]。結(jié)合本研究與既往文獻(xiàn)分析，提示NRAS突變的不良預(yù)后可能由于其更多的骨髓原始細(xì)胞所致。

基因突變與染色體核型的相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，SETBP1突變均發(fā)生在異常核型患者中，截至末次隨訪時(shí)間，死亡4 例（80.00%）。既往多項(xiàng)研究表明，表觀遺傳相關(guān)基因SETBP1在髓系腫瘤中發(fā)揮促癌基因的作用，提示SETBP1突變?yōu)镸DS 患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可促進(jìn)MDS 向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化[11,17-19]。本研究與以上國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致，均表明伴有該基因突變的患者預(yù)后不良。

本研究4 例SF3B1突變患者均為老年人，有研究報(bào)道，SF3B1突變的MDS 患者發(fā)病年齡明顯大于SF3B1未突變的患者[20-21]。本研究中，截至末次隨訪，1 例SF3B1突變患者OS 最長(zhǎng)達(dá)98 個(gè)月，仍生存，符合Nazha 等[22]分析了508 例MDS 患者的臨床數(shù)據(jù)顯示SF3B1突變可能延長(zhǎng)患者的OS。相關(guān)研究亦顯示，SF3B1突變是一個(gè)有利預(yù)后的因素，可作為一種獨(dú)特的疾病亞型，向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)降低[23]。

綜上所述，MDS 患者的基因突變可以通過二代測(cè)序在大多數(shù)（＞90%）患者中檢測(cè)到，67.44%的患者存在基因之間的伴隨突變。MDS 相關(guān)基因突變特征可能與疾病亞型、IPSS-R 預(yù)后分層、染色體核型和患者年齡等臨床特征有關(guān)。二代測(cè)序?yàn)镸DS 患者預(yù)后評(píng)估和療效預(yù)測(cè)提供依據(jù)，可考慮納入MDS IPSS-R。