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    Rab25 沉默對轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的前列腺癌LNCaP 細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響△

    2023-11-01 12:20:34胡春暉于磊趙先誠郁全勝劉豪
    癌癥進展 2023年16期
    關(guān)鍵詞:前列腺癌研究

    胡春暉,于磊,趙先誠,郁全勝,劉豪

    宿遷市第一人民醫(yī)院泌尿外科,江蘇 宿遷 223800

    前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在全球男性惡性腫瘤發(fā)病和死亡譜中,前列腺癌分別居第2 位和第5 位[1]。近年來,隨著中國人口老齡化的加劇,前列腺癌的發(fā)病率和病死率均呈明顯上升趨勢[2]。2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,中國前列腺癌發(fā)病例數(shù)占全球8.2%,死亡例數(shù)占全球13.6%[3]。前列腺癌的確切病因尚未闡明,因此,積極篩選前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子,對于尋求前列腺癌治療新策略具有非常重要的意義。Rab 蛋白家族是Ras 超家族中最大的亞家族,由小分子鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合蛋白組成,參與細胞內(nèi)吞作用和細胞囊泡轉(zhuǎn)運中的許多關(guān)鍵過程,主要調(diào)節(jié)細胞中囊泡轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)交換,Rab 表達失調(diào)被證實與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病關(guān)系密切[4]。Rab25 是Rab蛋白家族成員,在細胞內(nèi)作為轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用,能夠與GTP 結(jié)合后將GTP 水解,對細胞囊泡轉(zhuǎn)運的各個階段進行調(diào)控[5]。Rab25 表達水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其在頭頸部腫瘤、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和腎癌中高表達并發(fā)揮致癌作用,但在食管鱗狀細胞癌、三陰性乳腺癌和結(jié)直腸癌中低表達并發(fā)揮抑癌作用[6]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認為是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制[7],也是致癌的關(guān)鍵標(biāo)志[8]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路是激活腫瘤EMT 的一條關(guān)鍵通路[9]。研究表明,TGF-β通過誘導(dǎo)EMT 加速腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。已有研究表明,Rab25 在乳腺癌EMT 過程中具有至關(guān)重要的作用[11],然而Rab25 在前列腺癌中的功能和作用機制尚不清楚。本研究探討Rab25沉默對TGF-β誘導(dǎo)的前列腺癌LNCaP 細胞EMT 的影響,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 細胞及主要試劑

    LNCaP 細胞株購自上海吉凱基因科技有限公司,293T 細胞購自南京科佰生物科技有限公司,DNA 內(nèi)切酶和DNA marker 均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司,DNA 連接酶購自日本Takara公司,DNA 凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Axygen 公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Mix 均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,TRIzol 購自美國Invitrogen 公司,RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Corning 公司,結(jié)晶紫購自生工生物工程(上海)股份有限公司,聚凝胺(Polybrene)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,Rab25 一抗購自美國CST 公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 PLKO.1-puro-Rab25-短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)重組干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    1.2.1 shRNA 干擾序列的設(shè)計和合成本研究共設(shè)計3條靶向Rab25基因的干擾序列,干擾靶點見表1,過表達質(zhì)粒是PLKO.1 質(zhì)粒。載體PLKO.1 帶有EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點。應(yīng)用EcoRⅠ和AgeⅠ對載體PLKO.1 進行酶切后,使用T4 連接酶將經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒和干擾靶點連接到一起,構(gòu)建PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3 重組質(zhì)粒,分別作為shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3 組,并設(shè)置空白對照NC 組。

    表1 針對Rab25基因的3個干擾靶點

    1.2.2 細胞培養(yǎng)、慢病毒包裝及病毒感染細胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的RPMI1640 培養(yǎng)基(含1.5 mg/L 谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)LNCaP 細胞,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。慢病毒包裝:培養(yǎng)293T 細胞,培養(yǎng)至80%~90%融合時,傾去培養(yǎng)液,采用3 ml 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細胞2 次,加入1 ml 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)溶液,再加入1 ml DMEM 培養(yǎng)液,平均鋪到2 個10 cm2皿中。待細胞培養(yǎng)至60%~70%融合時進行轉(zhuǎn)染:2 個1.5 ml 管中分別加入5 μg shRab25和5 μg NC 質(zhì)粒,再加入包裝質(zhì)粒5 μg psPAX2 和2.5 μg pMD2.G,用1 ml 無血清RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒,再加入20 μl Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑,混勻。室溫靜置20 min 后加入細胞。轉(zhuǎn)染8 h后換新鮮的DMEM 培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后收集培養(yǎng)基上清,分裝,感染LNCaP 細胞。

    1.2.3 穩(wěn)篩株構(gòu)建將LNCaP 細胞按1×105/孔的濃度接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h,待細胞30%~40%融合時加入慢病毒2 ml,并加入終濃度為5 μg/ml的聚凝胺。待細胞80%~90%融合時加入嘌呤霉素,終濃度為2 μg/ml,同時設(shè)立空白對照組。維持嘌呤霉素濃度,隔天換液,連續(xù)觀察4 天,至空白對照組細胞全部死亡后,可認為已經(jīng)獲得穩(wěn)篩株。穩(wěn)篩株細胞擴增收樣。

    1.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitation reverse transcription- polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測Rab25 mRNA 相對表達量

    收集各組細胞,TRIzol法提取總RNA,瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(complementary DNA,cDNA)。Rab25上游引物5'-GGGAATGGAACTGAGGAAGATTA-3',下游引物5'-CGTGAATCGGGAGAGTAGATTG-3';甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3',下游引物5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μl,其中2×SYBR Green Mix 10 μl,總RNA 1 μg,加焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水至20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃15 min,85 ℃5 s。PCR 反應(yīng)體系為20 μl,其中2×PCR Master Mix 10 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,cDNA 模板0.5 μl,加ddH2O 至20 μl。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃30 s,共40 個循環(huán)。60~95 ℃緩慢升溫,產(chǎn)生Rab25和GAPDH的溶解曲線。

    1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細胞中Rab25 蛋白表達水平

    十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(350 mA 恒流1.5 h);用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h;加入一抗(1∶2000),室溫孵育1.5 h;用TBST緩沖液沖洗3 次,每次5~10 min;加入相應(yīng)的二抗,室溫孵育30 min;用TBST 緩沖液沖洗3 次,每次5~10 min;用TBST 緩沖液潤洗2 次;加入適量的電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)液,借助凝膠成像系統(tǒng)顯影。

    1.5 Rab25 沉默對TGF-β介導(dǎo)的前列腺癌LNCaP細胞EMT 影響的實驗研究

    培養(yǎng)NC 組和shRab25-1 組細胞,加入TGF-β(5 ng/ml)或不加入TGF-β,分別作為NC 組、NC+TGF-β組、shRab25-1 組、shRab25-1+TGF-β組,使用相差顯微鏡觀察各組LNCaP 細胞的形態(tài)學(xué)變化,采用Western Blot 檢測EMT 生物標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達情況。具體實驗步驟同1.4。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 21.0、Graphpad Prism9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 重組shRNA 表達質(zhì)粒的DNA 測序結(jié)果

    本研究設(shè)計了針對Rab25基因的3 個干擾靶點,并成功地將目的基因片段克隆到載體PLKO.1中。測序結(jié)果顯示,插入的堿基序列與設(shè)計的干擾靶點完全一致。PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3 插入序列部分測序圖見圖1~圖3。

    圖1 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1插入序列部分測序圖

    圖2 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2插入序列部分測序圖

    圖3 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3插入序列部分測序圖

    2.2 Rab25 mRNA 相對表達量的比較

    RNA 電泳28S rRNA、18S rRNA 條帶清晰可見,說明RNA 未降解(圖4);Rab25和GAPDH擴增曲線呈現(xiàn)平滑S形狀,熔解曲線主峰清晰,無雜峰出現(xiàn),提示本次PCR 擴增產(chǎn)物較純,并無非特異性擴增(圖5)。shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3組細胞中Rab25mRNA 相對表達量均低于NC 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中shRab25-1 細胞中Rab25mRNA 相對表達量最低(表2)。

    圖4 RNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果

    圖5 Rab25和內(nèi)參GAPDH擴增曲線及熔解曲線

    表2 各組細胞中Rab25 mRNA 相對表達量的比較(±s)

    表2 各組細胞中Rab25 mRNA 相對表達量的比較(±s)

    注:*與NC組比較,P<0.05

    組別NC組shRab25-1組shRab25-2組shRab25-3組Rab25 mRNA相對表達量0.985±0.014 0.322±0.021*0.586±0.024*0.576±0.025*

    2.3 Rab25 蛋白表達水平的比較

    shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3 組中Rab25 蛋白相對表達量均低于NC 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中shRab25-1 組Rab25 蛋白表達水平最低(圖6、表3),故選取shRab25-1 作為后續(xù)實驗用的干擾載體。

    圖6 Western blot檢測各組細胞中Rab25蛋白表達情況

    表3 各組細胞中Rab25 蛋白相對表達量的比較(±s)

    表3 各組細胞中Rab25 蛋白相對表達量的比較(±s)

    注:*與NC組比較,P<0.05

    組別NC組shRab25-1組shRab25-2組shRab25-3組Rab25蛋白相對表達量0.475±0.068 0.167±0.018*0.335±0.012*0.326±0.036*

    2.4 Rab25 沉默對TGF-β介導(dǎo)的前列腺癌細胞EMT 的影響

    Rab25沉默后會降低細胞密度,加入TGF-β會部分逆轉(zhuǎn)這種抑制作用,同時各組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯破壞(圖7)。shRab25-1 組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量高于NC 組,N-cadherin 蛋白相對表達量低于NC 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);NC+TGF-β組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量低于NC 組,N-cadherin 蛋白相對表達量高于NC 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);shRab25-1+TGF-β組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量低于shRab25-1 組,N-cadherin 蛋白相對表達量低于NC+TGF-β組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(圖8、表4)

    圖7 相差顯微鏡觀察LNCaP細胞經(jīng)相應(yīng)處理后的細胞形態(tài)學(xué)變化(×200)

    圖8 Western blot檢測各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達情況

    表4 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量的比較(±s)

    表4 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量的比較(±s)

    注:a與NC組比較,P<0.05;b與shRab25-1組比較,P<0.05;c與NC+TGF-β組比較,P<0.05

    E-cadherin蛋白相對表達量0.338±0.027 0.458±0.015a 0.197±0.020a 0.282±0.022b N-cadherin蛋白相對表達量0.427±0.047 0.270±0.083a 0.719±0.035a 0.316±0.023c組別NC組shRab25-1組NC+TGF-β組shRab25-1+TGF-β組

    3 討論

    Rab25 是囊泡轉(zhuǎn)運和膜動力學(xué)的主要調(diào)節(jié)因子,在細胞轉(zhuǎn)運這一正常生理過程中發(fā)揮重要作用,其與配體相互作用的改變及其活性的改變均能引起細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生異常,從而影響腫瘤細胞生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲[12]。目前的研究表明,Rab25 參與腫瘤細胞遷移和侵襲,在多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[13]。體外沉默Rab25可抑制高級別非小細胞肺癌[14]、成膠質(zhì)細胞瘤[15]、腎細胞癌[16]和前列腺癌[17]細胞遷移和侵襲。在胃癌細胞中可以觀察到沉默Rab25可以抑制腫瘤細胞侵襲[18]。在膀胱癌的研究中,沉默Rab25不僅能夠抑制體外腫瘤細胞遷移,還能減少體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。

    EMT是一種進化上保守的發(fā)育程序,與致癌有關(guān),通過增強侵襲能力和對凋亡刺激的抵抗力賦予腫瘤細胞轉(zhuǎn)移特性,被認為是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化中的一個基本事件[20]。隨著對Rab25 及EMT 的不斷深入研究,Rab25 被證實與多種腫瘤的EMT 密切相關(guān)。Yin等[21]研究報道,微小RNA(microRNA,miRNA)-577通過抑制乳腺癌中Rab25 的表達來抑制EMT。Jeong 等[22]研究報道,Rab25 可以通過血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)/血管內(nèi)皮細胞生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)信號通路誘導(dǎo)snail家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,SNAIL)表達,導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和EMT。Calvo等[23]在體外對前列腺癌小鼠模型的研究表明,Rab25的過表達與腫瘤細胞生長、侵襲和新生血管生成有關(guān),并在體外保留了具有增加腫瘤進展的致瘤性特征。既往研究表明,Rab25在前列腺癌中表達升高,體外研究發(fā)現(xiàn)Rab25表達下調(diào)可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,然而Rab25在前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚無深入研究[17]。

    在前列腺癌的發(fā)展過程中,上皮細胞可以發(fā)生EMT,其特點是表型從立方體到紡錘形的形態(tài)變化,導(dǎo)致細胞與細胞間黏附力喪失,從而使細胞遷移或轉(zhuǎn)移到不同器官[24]。這種生物行為與生化改變有關(guān),其中上皮細胞標(biāo)志物如E-cadherin 表達下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白和N-cadherin 表達上調(diào)[25]。上皮性腫瘤中最有效的EMT 誘導(dǎo)劑是TGF-β[26],TGF-β誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生EMT 常通過SMAD 介導(dǎo)或非SMAD 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并導(dǎo)致侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[27]。TGF-β誘導(dǎo)的EMT 在多種腫瘤中已被證實可被一些特異的分子靶標(biāo)通過靶向EMT 信號通路抑制[26]。因此,抑制EMT 過程是一種有希望的治療腫瘤轉(zhuǎn)移的策略。

    本研究成功完成了沉默Rab25的PLKO.1-puro-Rab25-shRNA 重組干擾質(zhì)粒的構(gòu)建,并成功篩選出能夠高效抑制LNCaP 細胞中Rab25 表達的重組干擾質(zhì)粒。本研究發(fā)現(xiàn),Rab25沉默后可以減少TGF-β介導(dǎo)的LNCaP 細胞的EMT,表明Rab25 是TGF-β誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP 細胞EMT 的一個關(guān)鍵中間因子,目前的證據(jù)證明Rab25沉默后可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的前列腺癌細胞的EMT,具體機制有待進一步研究。

    綜上所述,Rab25沉默可逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的前列腺癌LNCaP細胞的EMT,這為Rab25成為評估前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要生物標(biāo)志物提供了理論依據(jù),Rab25可能成為治療前列腺癌的新型分子靶標(biāo)。

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