雙 酶 法 制 備 大 米 多 肽 的 研 究

■ 顧杰瑞 劉可意 丁 烽 劉午若 文穎月 李丕武

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353）

大米是我國(guó)重要的糧食作物之一，2021年度我國(guó)大米總產(chǎn)量約為1.47億噸，占全球大米產(chǎn)量的29%[1]。大米中主要成分包括碳水化合物（75%～80%）、蛋白質(zhì)（7%～8%）和脂質(zhì)（1.3%～1.8%），過(guò)去在我國(guó)食品加工行業(yè)中多以大米為原料生產(chǎn)淀粉和糖漿等產(chǎn)品，作為其生產(chǎn)副產(chǎn)物的大米蛋白卻沒有得到很好的利用，以往多被直接用作動(dòng)物飼料，少數(shù)被開發(fā)利用成相關(guān)產(chǎn)品，大量的高質(zhì)量蛋白資源遭到浪費(fèi)。

隨著近年來(lái)我國(guó)市場(chǎng)對(duì)蛋白粉需求量的不斷擴(kuò)大，可作為食用蛋白粉直接生產(chǎn)原料的大米蛋白受到社會(huì)和市場(chǎng)越來(lái)越多的關(guān)注[2]。大米蛋白（rice protein，RP）具有易于消化吸收、低致敏性等特點(diǎn)，其生物效價(jià)為77，與WHO/FAO建議的營(yíng)養(yǎng)模型相近，是一種優(yōu)質(zhì)的植源性膳食蛋白。由大米蛋白制備的大米多肽不僅有著很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[3]。大米蛋白主要由清蛋白（2%～5%）、球蛋白（2%～10%）、谷蛋白（66%～78%）和醇溶蛋白（1%～5%）組成，其中，水不溶性的谷蛋白和醇溶蛋白占80%以上[4]。現(xiàn)有大米蛋白肽制備方法中最常用的是通過(guò)堿液溶解，然后加酸沉淀的方式，但是，在高堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)的產(chǎn)率通常很低，且容易發(fā)生交叉耦合和重排[5]，從而降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前研究和實(shí)踐方法中多采用酶制劑對(duì)大米蛋白進(jìn)行增溶改性，并對(duì)其水解產(chǎn)物大米多肽進(jìn)行功能特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)。馬曉雨等[6]采用胰蛋白酶法將大米蛋白酶解，使大米蛋白的溶解和乳化性能得到明顯的提高，其抗氧化能力明顯增強(qiáng)，并可有效地改善其功能性。Singh 等[7]利用木瓜蛋白酶處理米糠蛋白，得到的水解產(chǎn)物RBPH 具有較高的溶解度和消化率，其潛在的生物活性有一定程度增加。許多研究者對(duì)超聲輔助酶處理大米蛋白的工藝進(jìn)行了探究，如Fathi等[8]使用超聲-Alcalase 聯(lián)合處理的方法水解米糠蛋白（RBP），證實(shí)了超聲處理通過(guò)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)酶水解的作用，并在超聲條件（150 W，40 min）下取得最高的水解度[（27.35±0.45）%]。與非水解樣品相比，生成水解物的蛋白質(zhì)和肽擁有更低的分子量。還有研究者運(yùn)用多酶共同作用復(fù)合酶解等方式處理大米蛋白，如徐珍珍等[9]以大米蛋白為原料，采用優(yōu)化后的酶解法，制備大米蛋白肽，其蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)43.9%，且分子量較低，感官評(píng)定及生物活性均較好。為了進(jìn)一步提高酶法水解大米蛋白的效力，本研究采用堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解大米蛋白的工藝，結(jié)合超聲預(yù)處理技術(shù)，進(jìn)行大米蛋白肽制備，檢測(cè)其溶解度和溶液中短肽含量的變化，并通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術(shù)和氨基酸分析儀對(duì)復(fù)合酶解產(chǎn)物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)和氨基酸成分分析，進(jìn)而優(yōu)化大米蛋白肽生產(chǎn)工藝，為大米蛋白的深加工技術(shù)提供進(jìn)一步的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大米蛋白粉，山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活力單位200 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活力單位200 000 U/g），山東隆科特酶制劑有限公司；Methyl red 甲基紅指示劑、Bromocresol Green 溴甲酚綠指示劑，北京酷來(lái)搏科技有限公司；混合氨基酸標(biāo)品，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、三氯乙酸，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器與設(shè)備

SCIENTZ-HF5000 超聲波循環(huán)提取機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ES-E 系列標(biāo)準(zhǔn)分析天平，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；PHS-3C 精密pH 計(jì)，濟(jì)南歐萊博生物科技有限公司；ZQZY-CF8E 三層組合式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；DSHZ-300 旋轉(zhuǎn)式水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；德國(guó)Hermle（哈默）大容量冷凍型高速離心機(jī)Z326K，賀默(上海)儀器科技有限公司；KDN-16C數(shù)顯溫控消化爐、KDN-1000全自動(dòng)定氮儀，上海新嘉電子有限公司；FT-IRTracer100 傅里葉變換紅外光譜，日本島津公司;日立氨基酸自動(dòng)分析儀L-8900，廣州儀德精密科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

稱取10 g（精確至0.000 1 g）大米蛋白粉置于250 mL玻璃燒杯中，加入0.1 mol/L NaOH溶液120 mL，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，配置成固液比1∶12的大米蛋白懸液，進(jìn)行超聲預(yù)處理[10（]超聲處理的條件為：在每升處理液施加超聲功率250 W、超聲處理時(shí)間10 min、超聲工作間歇比1∶2、循環(huán)速率30 r/s）。冷卻至室溫后，在8 000 r/min、18 ℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為對(duì)照組。

將超聲預(yù)處理過(guò)的溶液pH 調(diào)至10，在50 ℃條件下，按質(zhì)量比0.8%加入堿性蛋白酶酶解2 h，酶解過(guò)程中保持pH不變，酶解結(jié)束后90 ℃水浴滅酶10 min，待冷卻到室溫，在8 000 r/min 、18 ℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為單一酶解組。

用0.2 mol/L HCl溶液將單一酶解組初始pH調(diào)節(jié)為7.5，按質(zhì)量比0.8%加入中性蛋白酶，在50 ℃條件下酶解2 h，酶解過(guò)程中維持pH 不變，復(fù)合酶解液水浴90 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后，在8 000 r/min 、18℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為復(fù)合酶解組。

1.3.2 總氮含量的測(cè)定

總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[11]。使用移液器吸取1 mL 樣品溶液置于250 mL 消化管底部，加入0.4 g 五水硫酸銅和6 g 無(wú)水硫酸鉀，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)分次沿壁緩慢加入10 mL 濃硫酸，用掌心輕拍消化管外壁，將樣品和試劑小心混勻，在消化管口處放置彎頸漏斗，靜置過(guò)夜。放入消化爐中消解，首先設(shè)置240 ℃，不蓋蓋子保持30 min，然后轉(zhuǎn)為420 ℃，直至溶液變?yōu)榈{(lán)色，繼續(xù)保持1 h 后，將消化爐關(guān)掉，室溫冷卻、待測(cè)。利用全自動(dòng)凱氏定氮儀對(duì)消化管進(jìn)行蒸餾，設(shè)置程序?yàn)榧尤?0 mL超純水、40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的氫氧化鈉溶液，反應(yīng)2 min 后，開始加熱，用20 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硼酸溶液吸收。在蒸餾過(guò)程中，硼酸溶液會(huì)不斷吸收蒸餾出的氨水。在蒸餾結(jié)束后的硼酸吸收液中滴加1～2 滴甲基紅-溴甲酚綠指示劑，混勻，用酸性滴定管向蒸餾液中加入0.1 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，直至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色，并記錄鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗體積。

式中：X——試樣中總氮含量（g/mL）；

V1——滴定試樣時(shí)所消耗的鹽酸體積（mL）；

V2——滴定空白試樣時(shí)所消耗的鹽酸體積（mL）；

V3——試樣取用量（mL）；

c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L）；

0.014——與1.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)HCl 溶液相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量（g）。

1.3.3 大米蛋白粉溶解度測(cè)定

使用量程為10 mL玻璃量筒分別準(zhǔn)確量取對(duì)照組、單一酶解組和復(fù)合酶解組的大米蛋白溶液各10 mL，置于50 mL玻璃燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 200 r/min 離心10 min，小心移取上清液1 mL，放入消化管中，通過(guò)1.2.2中的方法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，同時(shí)測(cè)定同一樣品總蛋白質(zhì)含量[12]。

1.3.4 大米蛋白溶液中短肽含量評(píng)價(jià)

用三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）來(lái)衡量大米多肽中短肽含量[13]。使用量程為10 mL 的玻璃量筒分別準(zhǔn)確稱取對(duì)照組、單一酶解組和復(fù)合酶解組大米蛋白溶液各10 mL，置于50 mL玻璃燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，使用10 mL 移液管分別準(zhǔn)確加入10 mL 10%的三氯乙酸（TCA），靜置30 min后4 200 r/min 離心10 min，取上清液2 mL 進(jìn)行微量凱氏定氮，測(cè)定其三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）。

1.3.5 大米蛋白肽的結(jié)構(gòu)鑒定

將45 ℃烘干至恒重的大米蛋白粉狀樣品與KBr按1∶100 比例在研缽中研磨混勻，壓片后均勻地平鋪于FTIR Tracer100 傅里葉紅外光譜儀的金剛石檢測(cè)窗口，旋轉(zhuǎn)壓力旋鈕至指示壓力，確保試樣和測(cè)試面窗口保持緊密的接觸，以減少在試驗(yàn)中的紅外光束損耗。記錄每個(gè)樣品在波數(shù)400～4 000 cm-1光譜范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率掃描32 次光譜的平均值。在做樣品之前須做空白干凈金剛石的背景掃描。檢測(cè)到的光譜數(shù)據(jù)采用FT-IR Tracer100 光譜儀所配備的軟件OMNIC 進(jìn)行基線校正和均一化處理，最后計(jì)算光譜差值，得到紅外光譜[14]。

1.3.6 氨基酸成分分析

將樣品稱重后放入玻璃水解管，并加入6 mol/L鹽酸10 mL，在減壓下密封水解管，垂直氮吹3 min后，壓蓋密封，使用水解器在110 ℃的加熱溫度下分解22 h。加熱結(jié)束后，將水解管取出冷卻至室溫，在減壓下干燥成固體，去除鹽酸。最后使用0.02 mol/L鹽酸稀釋至一定濃度后用作樣品，最終標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.5 mg prot./mL。樣品上機(jī)前用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)器波長(zhǎng)為570 nm和440 nm，色譜柱型號(hào)為L(zhǎng)CA K06/Na，流動(dòng)相為緩沖液A、緩沖液B、緩沖液D（再生液）和水，洗脫泵流速：0.45 mL/min，衍生泵流速：0.25 mL/min，溫度為58～75 ℃梯度溫控，壓力為3～7 MPa[15]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素分析（oneway ANOVA），用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白溶液溶解度的測(cè)定結(jié)果分析

如圖1所示，對(duì)照組溶解度為37.05%，與對(duì)照組相比，單一酶解組溶解度（51.55%）極顯著提高（P<0.01）；復(fù)合酶解組溶解度（56.18%）極顯著提高（P<0.01）。復(fù)合酶解組溶解度顯著高于單一酶解組（P<0.05）。

圖1 不同酶解條件大米多肽溶液溶解度

2.2 大米蛋白溶液中短肽含量的測(cè)定結(jié)果分析

如圖2 所示，對(duì)照組的短肽含量?jī)H為12.15%，與對(duì)照組相比，單一酶解組短肽含量（71.44%）極顯著提高（P<0.01）；復(fù)合酶解組短肽含量（89.38%）極顯著提高（P<0.01）。復(fù)合酶解組溶解度顯著高于單一酶解組（P<0.05）。

圖2 不同酶解條件大米蛋白溶液中短肽含量

2.3 大米蛋白肽的結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，3 309.23 cm-1附近吸收峰主要?dú)w因于酰胺Ⅱ帶的泛頻和費(fèi)米振動(dòng)；2 892.65 cm-1附近吸收峰處于酰胺B 帶，歸屬于C―H 伸縮振動(dòng)；1 632.72 cm-1附近吸收峰屬于酰胺Ⅰ帶，主要是由80% C═O 伸縮振動(dòng)所導(dǎo)致，表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 557.31 cm-1附近吸收峰主要是由60%―H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)和40%C―N伸縮振動(dòng)所導(dǎo)致；1 406.90 cm-1附近吸收峰主要?dú)w屬于―CH3和―CH2的不對(duì)稱變形振動(dòng)；1 240.58 cm-1附近吸收峰屬于酰胺Ⅲ帶，主要是C═O彎曲振動(dòng)和C―N伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生；1 097.57 cm-1附近吸收峰可歸為少量胱氨酸氧化物。

圖3 復(fù)合酶解組大米多肽紅外光譜分峰圖

2.4 大米蛋白肽的氨基酸成分分析

如圖4、圖5所示，樣品中含量最高的是谷氨酸，含量達(dá)到了8.8 nmol/L，接下來(lái)依次是天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸，含量均達(dá)到了4 nmol/L以上，主要氨基酸成分中還有絲氨酸、纈氨酸和精氨酸，含量分別為3.631、3.309、3.181 nmol/L。除了含量排名前8 位的氨基酸之外，其他氨基酸（蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸）共占比28.31%。

圖4 復(fù)合酶解組大米多肽中主要氨基酸成分及其含量

圖5 復(fù)合酶解組大米多肽VIS1和VIS2整體色譜圖

3 討論

溶解度是蛋白質(zhì)的一種功能特性，是在不同加工條件下判斷蛋白質(zhì)潛在應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵因素，可以作為評(píng)價(jià)指標(biāo)在食品和飼料研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[16-17]。物質(zhì)溶解能力的大小往往取決于其內(nèi)在組成部分。未經(jīng)處理的大米蛋白溶解度較低，與其中所含高比例的谷蛋白和醇溶蛋白有較大關(guān)系。由圖1可得，經(jīng)過(guò)超聲和堿處理的大米蛋白溶液溶解度可達(dá)37.05%，這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)超聲波處理后蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的改變，增強(qiáng)了其溶解性，并且經(jīng)過(guò)超聲處理可以使蛋白酶更好地作用于蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而部分堿溶性蛋白在堿性環(huán)境下有著更好的溶解效果。與對(duì)照組相比，單一酶解組和復(fù)合酶解組使得大米蛋白溶液溶解度得到進(jìn)一步提升，說(shuō)明堿性蛋白酶和中性蛋白酶的復(fù)合酶解對(duì)大米蛋白的溶解度有顯著提升作用，這很大程度上是因?yàn)閴A性蛋白酶的作用位點(diǎn)多存在于谷蛋白和醇溶蛋白上，經(jīng)過(guò)酶解作用后，使兩者的肽鏈被切斷，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溶解度顯著提高，而中性蛋白酶作為堿性蛋白酶的補(bǔ)充，使得大米蛋白的水解更為徹底。

三氯乙酸可以作為蛋白質(zhì)沉淀劑，將大米蛋白溶液中的可溶性蛋白質(zhì)和肽鏈較長(zhǎng)的肽沉淀，并用酸將短肽溶解出來(lái)，所以可以利用三氯乙酸氮溶指數(shù)(TCA-NSI)與相同條件下蛋白溶液溶解度的比值，來(lái)反映短肽在蛋白溶液的溶質(zhì)中所占比例，簡(jiǎn)稱短肽含量。相比于游離氨基酸，動(dòng)物機(jī)體以短肽形式吸收的氨基酸強(qiáng)度要更高，并且短肽這種易吸收特性有利于動(dòng)物體內(nèi)腸道益生菌的繁殖和微量元素的吸收，以促進(jìn)動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。與對(duì)照組和單一酶解組相比，復(fù)合酶解組中短肽在溶液溶質(zhì)中所占的比例有顯著的提高，可以說(shuō)明堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)大米蛋白有著極佳的酶解效果，能夠使大米蛋白內(nèi)部的功能區(qū)更多地被釋放出來(lái)，從而使其具有制備各種功能短肽的條件，增進(jìn)其利用價(jià)值。

據(jù)相關(guān)研究表明[19-20]，大米多肽可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)多個(gè)生理過(guò)程，還具備抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。為了進(jìn)一步證明經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶和中性蛋白酶作用的大米蛋白溶液中，主要成分為具有多種生物學(xué)功能的多肽，而非小分子氨基酸，我們利用FTIR 技術(shù)對(duì)復(fù)合酶解組中的溶質(zhì)進(jìn)行了分析檢測(cè)，由圖3 分析可得，復(fù)合酶解組中溶質(zhì)的特征峰位置與蛋白肽相吻合[21]，可以判定通過(guò)堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解所制得的大米蛋白肽具有多肽的基本結(jié)構(gòu)，而不是小分子氨基酸結(jié)構(gòu)。

將復(fù)合酶解組制得的產(chǎn)物大米多肽溶液進(jìn)行氨基酸成分分析[22]，根據(jù)圖4、圖5 可得，經(jīng)復(fù)合酶解后的大米多肽中，具有8 種人體必需的氨基酸，氨基酸組成和種類十分豐富。將所測(cè)得的大米蛋白肽氨基酸成分與豆粕蛋白、玉米蛋白相比[23]，大米蛋白的生物價(jià)相對(duì)較高，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與動(dòng)物源蛋白相媲美。在保健功能方面，大米多肽還能夠降低人體內(nèi)的膽固醇水平，預(yù)防高血壓，并具有促進(jìn)傷口愈合的功效[24-25]。根據(jù)上表分析，大米蛋白與豆粕蛋白、玉米蛋白相比，三者含有的氨基酸種類齊全，均含有人體所需的8 種必需氨基酸和2 種半必需氨基酸。雖然大米蛋白必需氨基酸總量較豆粕蛋白略低，但大米蛋白的氨基酸組成較為均衡，符合世界衛(wèi)生組織的建議。并且大米蛋白具有低抗原性，更有利于生產(chǎn)嬰幼兒食品。

本試驗(yàn)使用了堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解大米蛋白，結(jié)合超聲預(yù)處理技術(shù)，優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，顯著提高了大米多肽溶液的溶解度和短肽含量，并分析了大米蛋白肽的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸成分，為大米蛋白的深加工技術(shù)提供進(jìn)一步的研究基礎(chǔ)。

但本試驗(yàn)未對(duì)蛋白肽中所含的風(fēng)味物質(zhì)展開研究，未來(lái)市場(chǎng)會(huì)對(duì)蛋白肽相關(guān)產(chǎn)品表現(xiàn)出極大興趣，相應(yīng)的功能性飲料和保健飲品也會(huì)隨之逐漸面世。在未來(lái)的研究中，可以嘗試多種不同的酶對(duì)植物蛋白進(jìn)行復(fù)合酶解，結(jié)合超聲處理，提高產(chǎn)物濃度，改善其風(fēng)味和口感，并對(duì)產(chǎn)物多肽的功能性展開研究，生產(chǎn)出更多對(duì)身體健康有益的產(chǎn)品，減少大米蛋白資源的浪費(fèi)，促進(jìn)中國(guó)食品深加工技術(shù)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究首次通過(guò)堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)大米蛋白溶液的復(fù)合酶解作用，與超聲預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，使所得大米多肽溶液溶解度提高到56.18%，且溶質(zhì)中短肽含量占比高達(dá)89.38%。通過(guò)FTIR 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶解產(chǎn)物紅外光譜特征峰位置與蛋白肽基本符合，具有多肽的基本結(jié)構(gòu)。氨基酸分析儀的檢測(cè)結(jié)果表明，其氨基酸組成豐富，含有8 種必需氨基酸，大米蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了充分地提高。