飼料磷脂水平對中華絨螯蟹仔蟹存活、生長、消化酶活性、生化指標及Neverland基因表達的影響

■ 袁 融 滿敦蕊 石偉帥 陶長紅 姜玉聲 衣啟麟 黃 姝 左然濤

（大連海洋大學水產與生命學院，農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023）

中華絨螯蟹（Eriocheir Sinensis）又稱大閘蟹或河蟹，因其豐富的營養(yǎng)價值和獨特的口感而廣受消費者喜愛[1-2]。近年來，日益增長的市場需求導致中華絨螯蟹過度捕撈，其自然資源量嚴重下降[3]。隨著中華絨螯蟹人工繁育和苗種培育技術被相繼突破，中華絨螯蟹人工增養(yǎng)殖發(fā)展迅速[4-5]，現(xiàn)已成為我國重要的水產經濟養(yǎng)殖品種之一，養(yǎng)殖年產量已突破80 萬噸[6]。傳統(tǒng)的中華絨螯蟹養(yǎng)殖中，通常飼喂玉米、南瓜、大豆和雜魚等[7]，這些生物餌料存在營養(yǎng)不均衡、供應不穩(wěn)定、貯藏不方便、容易攜帶致病菌等缺陷[8]。2022 年農業(yè)農村部印發(fā)《“十四五”全國漁業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，明確提出推動配合飼料代替野生幼雜魚、推進生態(tài)健康養(yǎng)殖模式。因此，開發(fā)和推廣應用中華絨螯蟹配合飼料勢在必行。

脂類是生物體的重要能量物質，同時也是必需脂肪酸的來源和脂溶性維生素的載體[9-12]。磷脂是一類分子中含磷的極性脂，包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿[13-14]。磷脂在促進水生動物的生長、免疫、性腺發(fā)育和繁殖性能等方面發(fā)揮著重要作用[13，15-21]。中華絨螯蟹的磷脂需求受生長階段、磷脂來源和其他營養(yǎng)素（如膽固醇）水平的影響。飼料中添加2%～4%的大豆卵磷脂能有效提高中華絨螯蟹幼體[初始體質量為（1.23±0.36） g]的蛻殼率和生長速度[22]。飼料中添加2.89%～2.95%的大豆卵磷脂可以提高中華絨螯蟹幼蟹[初始體質量為（0.52±0.01） g]的生長速度和抗氧化能力并促進了脂肪從肝胰腺向肌肉的轉移效率[23]。磷蝦油對中華絨螯蟹幼蟹[初始體質量為(0.26±0.01) g]的促生長效果最好，其次是卵黃磷脂，大豆卵磷脂的促生長效果最差[24]。

蛻殼是甲殼動物的重要生理活動，雖然磷脂對甲殼動物生長和蛻殼的有益影響已被廣泛報道，但其調控機制尚不完全清楚。消化酶在營養(yǎng)物質的消化和吸收中起著重要作用。消化酶活性直接反映動物消化能力和飼料轉化效率，并影響其生長速度[25]。研究表明，磷脂營養(yǎng)對水生動物消化酶活性有顯著促進作用[26-29]。磷脂和膽固醇的協(xié)調作用在甲殼動物中被廣泛證明，但相關機制尚未闡明。Neverland基因（Nvd）最早在家蠶和果蠅中發(fā)現(xiàn)[30-33]，Nvd的調節(jié)作用主要是通過與膽固醇7-脫氫酶結合，使膽固醇脫氫形成7-脫氫膽固醇（維生素D 前體），然后在CYP105A1和CYP2R1 這兩種酶的作用下生成1α，25-二羥基維生素D3（俗稱維生素D3）[34-37]。維生素D 可以促進甲殼動物對鈣的吸收，有利于其蛻皮和生長[38-40]。然而，目前尚不清楚添加磷脂對中華絨螯蟹Nvd表達的影響。因此，本研究旨在探究飼料中添加磷脂對中華絨螯蟹仔蟹存活、生長、消化酶活性、生化指標和Nvd表達的影響，以期為理解磷脂對中華絨螯蟹的有益作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

本實驗以魚粉、豆粕和酪蛋白為主要蛋白源，以大豆卵磷脂和棕櫚油為主要脂肪源，通過梯度添加大豆卵磷脂配制了5 種等氮等脂的飼料，飼料磷脂水平依次為0、1%、2%、3%和4%，飼料配方組成和營養(yǎng)水平如表1 所示。在飼料制備之前，所有固體飼料原料粉碎過80 目篩。依據逐級擴大的原則，準確稱量固體原料并充分混合，隨后將其與相應的脂類混合物再次混勻，最后加入35%的純凈水。使用雙螺桿自動制粒機（濟南鼎潤機械公司）將飼料原料壓制成直徑1.5 mm 的飼料。制作好的飼料低溫（55 ℃）烘干，冷卻后密封在自封袋中，保存在-20 ℃冰箱中備用。

表1 實驗飼料配方及組成（干物質基礎，%）

1.2 飼養(yǎng)實驗和日常管理

實驗于2021 年8 月—10 月在遼寧省盤錦市光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心實驗基地開展。實驗用淡水為地下井水，在室外土池曝氣1 個月，在砂濾后被抽室內蓄水池繼續(xù)曝氣。

實驗所用中華絨螯蟹仔蟹購自江蘇省南通市海通水產有限公司，被暫養(yǎng)在室內水泥池進行為期2 周的馴化，每天早晚兩次投喂對照組飼料，以適應養(yǎng)殖環(huán)境和實驗飼料。暫養(yǎng)結束后，隨機選取體質量相近（0.52±0.02） g、附肢完整的健康仔蟹，置于15 個塑料水槽（60 cm×40 cm×40 cm）中，每個水槽放養(yǎng)20 只。每種實驗飼料隨機投喂3 個水槽的仔蟹。在每個水槽放置一定數(shù)量的塑料管和塑料網以減少同類之間殘食。每天兩次（07：00 和17：00）對中華絨螯蟹進行表觀飽食投喂，每次投喂后通過虹吸清除殘餌、糞便。每隔一天換水1 次，每次換水量為水箱體積的50%。攝食生長實驗共持續(xù)60 d，實驗期間，水體pH 7.6～7.8，水溫23～26 ℃，溶氧8 mg/L 以上，氨氮和亞硝酸鹽濃度分別控制在0.05 mg/L和0.07 mg/L以下。

1.3 樣本采集

實驗結束后，對中華絨螯蟹進行24 h 饑餓處理，并對每個水槽仔蟹進行計數(shù)和稱重。隨后，從每個水槽中隨機挑選3～4 只仔蟹置于冰上麻醉，解剖獲取肝胰腺，并將其放入無酶離心管，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 生化分析

使用南京建成生物工程研究所有限公司的試劑盒測定中華絨螯蟹肝胰腺中三酰甘油、總膽固醇、蛋白質的含量和脂肪酶、纖維素酶、胰蛋白酶、淀粉酶的活性。

1.5 實時定量PCR

使用DP424 Trizol通用試劑（天根）提取仔蟹的肝胰腺總RNA。使用瓊脂糖電泳檢測RNA 完整性，并利用Agilent 2100 生物分析儀顯微分光光度計檢測RNA 濃度。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit （Perfect Real Time）試劑盒（北京依珊匯通科技有限公司）獲取cDNA，反轉錄體系見下表2，反應條件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，cDNA保存于-20 ℃。

表2 cDNA生成體系

實時熒光定量引物序列見下表3，將反轉錄得到的cDNA 用DEPC water稀釋5倍作為模板，使用Light-Cycler?96（Roche Group，Basel，Switzerland）熒光定量PCR 儀，按照PrimeScriptTMReal time PCR Ki（t寶日醫(yī)生物技術有限公司）配置反應體系，具體見下表4，反應條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40 個循環(huán)；95 ℃，10 s；65 ℃，60 s；97 ℃，1 s。最后采用2-ΔΔCT算法分析實時定量數(shù)據。

表3 實時熒光定量所使用的引物

表4 實時熒光定量反應體系

1.6 計算與統(tǒng)計分析

增重率（WGR，%）=（Wf-Wi）/Wi×100

存活率（SR，%）=Nf/Ni×100

特定生長率（SGR，%/d）=（lnWf-lnWi）/d×100

飼料系數(shù)（FCR）=F/（Wf-Wi）

式中：Wi和Wf——分別為各水槽仔蟹的初始體質量和終末體質量（g）；

Ni和Nf——分別為各水槽仔蟹的初始和最終數(shù)量；

d——實驗天數(shù)(d)；

F——實驗期間各水槽仔蟹攝食的飼料質量(g)。

所有數(shù)據進行正態(tài)性和方差齊性檢驗后，利用SPSS 單因素方差分析法（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，使用Duncan’s 多重比較法進行組間差異性檢驗。若P<0.05，則認為存在顯著差異，統(tǒng)計結果以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加磷脂對仔蟹存活、生長和飼料系數(shù)的影響

如圖1 所示，隨著飼料磷脂添加水平升高，仔蟹存活率呈先升高后下降的趨勢，當磷脂添加水平為2%時仔蟹存活率最高，但各組間差異不顯著（P>0.05）。飼料中添加磷脂不同程度提高了仔蟹增重率和特定生長率，其中1%磷脂添加組仔蟹的增重率和特定生長率最高，顯著高于對照組和3%磷脂添加組（P<0.05）。飼料中添加磷脂在不同程度上降低了飼料系數(shù)，當磷脂添加水平為1%時飼料系數(shù)最低，顯著低于對照組和3%磷脂添加組（P<0.05）。

圖1 磷脂水平對中華絨螯蟹仔蟹存活率、增重率、特定生長率和飼料系料的影響

2.2 飼料中添加磷脂對仔蟹消化酶活性的影響

如圖2 所示，較高磷脂添加水平顯著降低了仔蟹胰蛋白酶和淀粉酶活性。當磷脂添加水平為3%和4%時，仔蟹胰蛋白酶和淀粉酶活性均顯著低于對照組和1%磷脂添加組（P<0.05）。隨著飼料磷脂添加水平升高，仔蟹纖維素酶活性先升高后下降，當磷脂添加水平為1%時纖維素酶活性最高，顯著高于3%和4%磷脂添加組（P<0.05）。隨著飼料磷脂添加水平升高，仔蟹脂肪酶活性呈先降低后升高，磷脂添加水平為2%時仔蟹脂肪酶活性最低，與3%磷脂組差異不顯著（P>0.05），但顯著低于其他各組（P<0.05）。

圖2 磷脂水平對中華絨螯蟹扣蟹肝胰腺消化酶活性的影響

2.3 飼料中添加磷脂對仔蟹肝胰腺中三酰甘油和總膽固醇含量的影響

如圖3 所示，隨著磷脂添加水平升高，仔蟹肝胰腺三酰甘油含量顯著降低，3%和4%磷脂添加組三酰甘油含量顯著低于對照組和1%磷脂添加組（P<0.05）。飼料中添加磷脂未對肝胰腺總膽固醇含量產生顯著影響（P>0.05）。

圖3 磷脂水平對中華絨螯蟹仔蟹肝胰腺中三酰甘油和總膽固醇含量的影響

2.4 飼料中添加磷脂對仔蟹肝胰腺中Neverland 基因（Nvd）相對表達量的影響

如圖4 所示，飼料磷脂添加水平顯著影響了仔蟹肝胰腺Nvd基因表達量。隨著磷脂添加水平升高至2%，Nvd表達量顯著增加了1.9 倍（P<0.05），之后隨著磷脂水平的進一步提高，Nvd的轉錄水平顯著降低至對照組水平（P<0.05）。

圖4 磷脂水平對中華絨螯蟹仔蟹肝胰腺Neverland表達的影響

3 討論

本研究中，仔蟹存活率均高于80%，由于甲殼動物個體之間的相互蠶食是不可避免的，因此本實驗中仔蟹的成活率是可接受的。本研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加磷脂未對仔蟹存活率產生顯著影響，但適量添加磷脂（1%）顯著提高了仔蟹的增重率和特定生長率。本研究結果與三疣梭子蟹[18，42]、斑節(jié)對蝦[43]、長毛對蝦[44]、金頭鯛[45]中的研究結果相似，但與中華絨螯蟹[46]、三疣梭子蟹[17]、鋸緣青蟹[47-48]中的研究結果不一致，后者發(fā)現(xiàn)飼料中磷脂最適添加量為2%～3%。上述研究結果差異的原因可能與不同種類實驗動物、不同生長階段和磷脂源的添加種類有關[24]。磷蝦油對中華絨螯蟹幼蟹[初始體質量（0.26±0.01） g]的促生長效果最好，其次是卵黃磷脂，大豆卵磷脂的促生長效果最差[24]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加磷脂不同程度降低了仔蟹的飼料系數(shù)，其中磷脂添加水平為1%時，飼料系數(shù)最低，這說明飼料中添加1%磷脂不僅能顯著提高仔蟹的生長性能，還可以在一定程度上提高飼料轉化效率，降低養(yǎng)殖飼料成本。

肝胰腺是甲殼動物重要的消化器官，它不僅負責營養(yǎng)物質的儲存和轉運，也參與激素和酶的合成與分泌，在新陳代謝調控中發(fā)揮著重要作用[49]。本研究中，與對照組和低磷脂添加組相比，仔蟹胰蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶活性在較高磷脂水平（3%～4%）添加時顯著降低。這說明大豆卵磷脂過量添加會降低仔蟹的消化率，陳永坡[50]的研究也發(fā)現(xiàn)飼料磷脂水平高于3.29%時，幼草魚肝胰腺的胰蛋白酶和淀粉酶活性降低。一方面可能是由于磷脂添加提高了脂類乳化和消化能力，提高了脂類營養(yǎng)供能比例，從而降低了其他營養(yǎng)素的消化（如脂肪對蛋白質的節(jié)約效應[51-53]），另一方面可能是由于大豆卵磷脂中富含的亞油酸引起的炎癥反應有關[54-56]，特別是腸道炎癥反應造成腸道損傷，降低了消化酶的分泌[57-58]。而脂肪酶的活性則是隨著磷脂水平的提高表現(xiàn)出先降后升的趨勢，在磷脂水平2%時，脂肪酶的活性最低。我們認為這可能與仔蟹對營養(yǎng)物質種類需求的轉變有關。當磷脂水平較低時，仔蟹的器官發(fā)育尚不完善，消化脂肪的能力較弱，因此需要更多的脂肪酶來消化腸道中的脂質，此時仔蟹的主要供能物質是碳水化合物和蛋白質。當磷脂水平逐漸升高，由于磷脂能夠促進脂質乳化，幫助腸道吸收，仔蟹消化脂肪的壓力降低，因而脂肪酶的活性也隨之下降。而隨著磷脂水平的進一步上升，大量脂質被磷脂乳化，導致脂肪酶的活性也隨之升高[59]，而大量的脂質被仔蟹利用并用于提供能量，因此仔蟹降低了對于碳水化合物的依賴[60]。本研究中三酰甘油這種供能脂類的含量在磷脂水平為3%時出現(xiàn)顯著降低，這與林志燈[46]的研究一致，他認為磷脂水平的提高會促進供能脂類從肝胰腺向肌肉組織轉運以滿足生長所需。

鈣是構成蟹殼的主要成分也是多種酶的激活劑，對激素、神經和肌肉的正常功能起著重要作用[61]。鈣對中華絨螯蟹蛻殼有著重要影響，中華絨螯蟹會在蛻殼前攝取大量鈣質儲存于血淋巴和肝胰腺以確保蛻殼[62]，并在蛻殼后期攝取鈣來進行外殼鈣化及促進機體機能恢復[63]。中華絨螯蟹會通過腸道和鰓來吸收水體中的鈣[64]，再通過血液將鈣運輸?shù)浇M織中去。膽固醇是維生素D的前體，它先脫氫轉化為7-脫氫膽固醇，然后在酶的催化作用下轉化成維生素D3，而維生素D3對促進水產動物腸道鈣的吸收和調節(jié)血鈣濃度有著重要的影響[65-66]，因此膽固醇有可能通過轉變?yōu)榫S生素D3來影響中華絨螯蟹血鈣水平。不過，有學者認為中華絨螯蟹身披碳酸鈣質外殼，這可能會使表皮無法通過接觸紫外線7-脫氫膽固醇轉變?yōu)榫S生素D3。但根據實際觀察，中華絨螯蟹喜在水淺、陽光明媚的白天蛻殼，中華絨螯蟹從舊殼中蛻出來，表皮會裸露出來，暴露在紫外線下，剛蛻完殼的中華絨螯蟹背部呈黑色，這可能會有助于中華絨螯蟹吸收陽光產生維生素D3，有報道稱不同的光照強度會影響中國對蝦的生長[67]。Nvd的轉錄產物能將膽固醇轉化成7-脫氫膽固醇，在維生素D 的合成過程發(fā)揮作用。Nvd的表達水平在一定程度反映了維生素D的合成水平，而甲殼動物獲得維生素D 的途徑除了自身合成，還有從食物中獲取，Liu 等[39]發(fā)現(xiàn)由于維生素D 是一種脂溶性維生素，充足的脂肪攝入可以幫助機體吸收更多的維生素D，脂肪酶的活性在磷脂水平為1%～2%是下降的，這說明機體吸收的維生素D 會減少，為了滿足蛻皮和生長所需，仔蟹需要合成更多的維生素D，因此Nvd的表達水平在磷脂水平為1%～2%有明顯的提高。

4 結論

綜上所述，飼料中添加1%磷脂顯著提高了中華絨螯蟹仔蟹的生長和飼料轉化率，2%磷脂顯著提高了仔蟹肝胰腺維生素D 合成調控基因Nvd的表達量，而較高磷脂添加水平（3%～4%）顯著降低了仔蟹肝胰腺中胰蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶的活性。綜合存活率和生長性能，中華絨螯蟹仔蟹飼料中磷脂的最適添加水平為1%。