投喂頻率對大口黑鱸幼魚生長及消化的影響

■ 孫洪慶 王 洋 楊 廣 朱國霞 白東清

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）又名加州鱸，有“淡水石斑魚”的美名，隸屬輻鰭魚綱（Actinopterygii）、鱸形目（Perciformes）、太陽魚科（Ceutrarchidae）、黑鱸屬（Micropterus），身體呈紡錘形，最適水溫為25～30 ℃[1-3]。該魚原產(chǎn)于加拿大和美國，于20 世紀70 年代引進我國，適應(yīng)性強，生長快，養(yǎng)殖周期短，易起捕，肉質(zhì)鮮美細嫩，無肌間刺，外形美觀，深受養(yǎng)殖戶和消費者的喜愛[4-6]。我國鱸魚養(yǎng)殖量，從2018年456 888 t增長到2020 年477 808 t，在養(yǎng)殖管理中，科學(xué)合理的投喂頻率是至關(guān)重要的，研究表明投喂頻率與生長發(fā)育和機體健康密切相關(guān)，不合理的投飼頻率會直接影響水產(chǎn)動物的生長、消化、攝食、飼料利用、水質(zhì)及養(yǎng)殖成本[7]。相關(guān)報道表明，養(yǎng)殖密度和飼料投喂量的增加是導(dǎo)致水質(zhì)環(huán)境惡化的原因之一，也是病害頻繁暴發(fā)的罪魁禍首[8]。目前，國內(nèi)外研究主要集中在大口黑鱸養(yǎng)殖技術(shù)、魚病治理、繁殖孵化和生長發(fā)育等方面，有關(guān)投喂頻率對大口黑鱸生長、消化和腸道健康的報道寥寥可數(shù)[9]。因此，本試驗通過研究投喂頻率對大口黑鱸幼魚生長、飼料效率、消化酶活性以及腸道和肝胰臟結(jié)構(gòu)形態(tài)，探討不同投喂頻率對大口黑鱸生長發(fā)育、消化能力及健康狀況的影響。為循環(huán)水系統(tǒng)中健康養(yǎng)殖大口黑鱸提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚

試驗用2 000尾健康大口黑鱸仔魚取自天津藍科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，經(jīng)過開口馴化，暫養(yǎng)兩周后，對幼魚隨機分組，稱體重，量體長。初始體質(zhì)量（5.3±0.6） g，初始體長（6.2±0.3） cm。

1.1.2 飼料配置

飼料原料由天津現(xiàn)代天驕水產(chǎn)飼料股份有限公司提供，用Y-3000S 粉碎機進行粉碎，過80 目篩，按照表1配方進行配制，用MB-22S制粒機制作飼料，孔徑2 mm，呈圓柱形，于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干，然后在室溫下回潮，并存放于避光通風(fēng)處，使用前根據(jù)大口黑鱸個體大小進行破碎，過篩去除細小顆粒后投喂，顆粒耐久性指數(shù)為91%～93%，在水中浸泡30 min散失率為10.7%，飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（%）

表2 各級叔丁醇的配置（mL）

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理

投喂頻率與時間分別為2 次/d（10：00，19：00），3 次/d（07：00，13：00，19：00），4 次/d（10：00，13：00，16：00，19：00），5 次/d（07：00，10：00，13：00，16：00，19：00）和6 次/d（07：00，10：00，13：00，16：00，19：00，22：00）。采用表觀飽食投喂法，根據(jù)試驗養(yǎng)殖期間，不同時間段大口黑鱸個體大小改變飼料大小，每次投喂時間30 min左右，結(jié)束投喂15 min后用虹吸法吸殘餌并稱重。試驗期間，采用室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，每天用廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司水質(zhì)快速檢測盒監(jiān)測水質(zhì)情況，養(yǎng)殖中水溫保持在26～28℃，溶氧≥6.0 mg/L，氨氮<0.05 mg/L，亞硝酸鹽<0.05 mg/L，pH 為6.5～7.6。試驗周期為8 周，每組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)50 尾魚，每組水體體積0.5 m3。

1.2.2 樣品采集

8 周養(yǎng)殖結(jié)束空腹24 h 后采集樣品，每個重復(fù)組隨機采集30 尾魚，用丁香酚快速麻醉后，用直尺和電子游標卡尺進行形態(tài)指數(shù)測量，使用1 mL 針頭抽取血液，每尾魚抽取0.5 mL，放入5 mL 離心管中靜置、離心，用于血液生化指標的測定。然后在冰袋上迅速取出胃、幽門盲囊、腸道和肝胰臟，用4 ℃生理鹽水沖洗內(nèi)外，放入-80 ℃冰箱保存，用于消化酶活性測定。另每個重復(fù)組隨機取6 尾魚，快速麻醉，冰袋上解剖，取出胃、幽門盲囊、腸道和肝胰臟，用4 ℃生理鹽水沖洗掉胃腸內(nèi)容物，迅速放入中性甲醛中進行固定，用于組織生理學(xué)切片觀察。

1.2.3 飼料常規(guī)成分的測定

利用常壓恒溫烘干法（GB/T 6435—2014）測量飼料中水分含量，利用馬弗爐550 ℃灼燒法測量飼料中粗灰分含量（GB/T 6438—2007），利用凱氏定氮法測量飼料中粗蛋白含量（GB/T 6432—2018），采用FOSS(KT 200 Kjeltec)），使用魯氏殘渣法測量飼料中粗脂肪含量（GB/T 6433—2006，葉列敏柯脂肪浸提器）。

1.2.4 生長指標測量

特定生長率（%/d）=100×（lnW2-lnW0）/T

增重率（%）=100×（W2-W0）/W0

攝食率（%）=W1×100/T×（W2+W0）/2

飼料系數(shù)=W1/（W2-W0）

蛋白質(zhì)效率=（W2-W0）/（W1×CP）

肥滿度（g/cm3）=W2/L3×100

臟體比（%）=W4/W5×100

式中：W0——大口黑鱸初始體質(zhì)量（g）；

W1——攝食飼料總質(zhì)量（g）；

W2——大口黑鱸最終體質(zhì)量（g）；

W4——內(nèi)臟團重（g）；

W5——大口黑鱸體質(zhì)量（g）；

T——養(yǎng)殖天數(shù)（d）；

L——大口黑鱸最終體長(cm)；

CP——飼料中所有含氮物質(zhì)（%）。

1.2.5 消化酶活性的測定

α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性采用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)試劑盒進行測定，方法參考試劑盒說明書。

1.2.6 肝胰臟和腸道組織切片的制作

試驗使用常規(guī)的石蠟切片法，組織經(jīng)過中性甲醛固定后，流動沖洗12 h，依次放入Ⅱ級叔丁醇（20%）、Ⅲ級叔丁醇（35%）、Ⅳ級叔丁醇（50%）、Ⅴ級叔丁醇（75%）和Ⅵ級叔丁醇（100%）進行脫水，脫水后放入液態(tài)石蠟中保存，經(jīng)過包埋后上切片機切片，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅染色，在經(jīng)過不同梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。組織切片后用顯微鏡進行觀察拍照[10]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)差異顯著再進行LSD 和Tukey’s法多重比較。數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂頻率對大口黑鱸幼魚生長及飼料利用的影響

由表3 可得，投喂頻率影響大口黑鱸幼魚生長和飼料利用率。其中，3、4次/d組和5次/d組特定生長率顯著高于6 次/d 組（P<0.05）；3 次/d 組和5 次/d 組增重率顯著高于6次/d組（P<0.05）；5次/d組攝食率顯著高于其余各組（P<0.05）；2次/d組和3次/d組飼料系數(shù)顯著低于4次/d組和6次/d組（P<0.05）；2次/d和3次/d組蛋白質(zhì)效率顯著高于4次/d組和6次/d組（P<0.05），其中3次/d組飼料系數(shù)最低，蛋白質(zhì)效率最高。6次/d組肥滿度顯著高于3次/d組（P<0.05）；2次/d組臟體比顯著高于3、4次/d組和6次/d組（P<0.05）?？梢?，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中投喂頻率為3次/d時更適合大口黑鱸幼魚生長。

表3 不同投喂頻率對大口黑鱸生長及飼料利用的影響

2.2 投喂頻率對大口黑鱸幼魚消化系統(tǒng)消化酶活性的影響

由表4 可知，投喂頻率影響大口黑鱸α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。

表4 不同投喂頻率對大口黑鱸幼魚消化酶的影響(U/mg prot.)

胃中α-淀粉酶活性最大值出現(xiàn)在2次/d 組，顯著高于其余各組（P<0.05）；幽門盲囊中6次/d組α-淀粉酶活性最高，與2次/d組差異不顯著（P>0.05），顯著高于3、4次/d組和5次/d組（P<0.05）；在腸道中，5次/d組α-淀粉酶活性最高，與6次/d組無顯著差異（P>0.05），顯著高于2、3 次/d 組和4 次/d 組（P<0.05）；在肝胰臟中，4 次/d 組α-淀粉酶活性顯著高于其余各組（P<0.05）。

胃中脂肪酶活性最大值出現(xiàn)在5 次/d 組，顯著高于其余各組（P<0.05）；幽門盲囊中5 次/d 組脂肪酶活性最高，與6次/d組無顯著差異（P>0.05），顯著高于2、3 次/d 組和4 次/d 組（P<0.05）；腸道中3 次/d 組脂肪酶活性顯著高于其余各組（P<0.05）；肝胰臟中2 次/d組脂肪酶活性最高，與4、5、6 次/d 組無顯著差異（P>0.05），顯著高于3次/d組（P<0.05）。

腸道中隨著投喂頻率的增加胰蛋白酶活性呈先升后降趨勢，其中3 次/d 組最高，顯著高于4、5 次/d 組和6 次/d 組（P<0.05）；肝胰臟中5 次/d 組胰蛋白酶活性最高，顯著高于2 次/d 組（P<0.05），與3、4 次/d 組和6次/d組無顯著差異（P>0.05）。

2.3 投喂頻率對大口黑鱸胃腸道和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由表5和圖1可知，投喂頻率對前、中和后腸的絨毛高度、寬度和肌層厚度有影響。前腸中，3次/d組絨毛高度顯著高于其余各組（P<0.05）；3 次/d 組絨毛寬度顯著高于4、5 次/d 組和6 次/d 組（P<0.05），與2 次/d組無顯著差異（P>0.05）；3 次/d 組肌層厚度顯著高于2、4 次/d 組和5 次/d 組（P<0.05），與6 次/d 組無顯著差異（P>0.05）。中腸中，2 次/d 組絨毛高度顯著高于其余各組（P<0.05）；4次/d 組絨毛寬度顯著高于3、5次/d和6次/d組（P<0.05），與2次/d組無顯著差異（P>0.05）組；2 次/d 組肌層厚度高于其余各組（P<0.05）。后腸中，2 次/d 組絨毛高度顯著高于其余各組（P<0.05）；3 次/d 組絨毛寬度顯著高于其余各組（P<0.05）；6 次/d組肌層厚度顯著高于其余各組（P<0.05）。

圖1 投喂頻率對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

表5 不同投喂頻率對大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響(μm)

由表6和圖2可知，投喂頻率影響胃的肌層、黏膜下層和黏膜層。3次/d組肌層厚度顯著高于2、4次/d組和5 次/d 組（P<0.05）。2 次/d 組黏膜下層厚度顯著高于其余各組（P<0.05）。4 次/d 組黏膜層厚度顯著高于其余各組（P<0.05）。

圖2 投喂頻率對大口黑鱸胃組織結(jié)構(gòu)的影響

表6 投喂頻率對大口黑鱸胃組織結(jié)構(gòu)的影響(μm)

由圖3可知，本試驗5個組中，肝胰臟細胞核透明，偏移、細胞空泡化和脂肪滴在各個組中均有出現(xiàn)，在投喂頻率相對較高的4、5次/d組和6次/d組中，這種情況更加明顯。2次/d組和3次/d組肝胰臟脂肪堆積程度，細胞輪廓、細胞核清晰度優(yōu)于4、5次/d組和6次/d組。

圖3 投喂頻率對大口黑鱸肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

3.1 投喂頻率對大口黑鱸生長的影響

現(xiàn)有的研究顯示，投喂頻率對水產(chǎn)動物的影響結(jié)論不一，有人認為投喂頻率不影響大口黑鱸、大雜交鱘和團頭魴的生長和飼料利用率[11-13]，有人認為隨著投喂頻率的增加，青魚攝食率顯著上升[14]，黃斑藍子魚蛋白質(zhì)效率顯著升高[15]，子二代中華鱘稚魚肥滿度和臟體比無顯著差異[16]。本研究中，當投喂頻率達到6次/d時，對大口黑鱸生長產(chǎn)生抑制，特定生長率顯著低于3～5 次/d 組，蛋白質(zhì)效果顯著低于2、3 次/d 組。魚類種類不同消化道長度不同，對飼料的消化程度有別，飼料在消化道停留時間不同。隨著投喂頻率變化，魚類攝食量會增加，魚類消化道短，飼料停留時間短，導(dǎo)致食物未被吸收便排出體外，進而使魚類飼料利用率下降，生長緩慢[17-18]。

3.2 投喂頻率對大口黑鱸消化酶活性的影響

消化酶活性決定了腸道消化能力的高低，常見的消化酶有脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶[19-20]。投喂頻率的增加造成魚類攝入量過高促進淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的合成，適宜的投喂頻率對消化酶活性存在一定影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，2 次/d 組大口黑鱸胃中α-淀粉酶活性最高，脂肪酶活性隨著投喂頻率的增加呈先上升后下降的趨勢。這與馮鵬霏[22]和宋國[23]報道的黃顙魚幼魚和條石鯛的胃α-淀粉酶2 次/d 組顯著高于其他各組的研究結(jié)果一致；幽門盲囊作為食物的“儲存?zhèn)}”，可進一步擴大腸道的吸收面積[24]。隨著投喂頻率的增加，幽門盲囊α-淀粉酶和脂肪酶呈先下降后上升的趨勢。這與強俊[25]報道，隨著投喂頻率的增加，奧尼羅非魚脂肪酶活性呈先下降后上升趨勢研究結(jié)果相吻合。

魚類腸道消化吸收能力與消化酶活力密切相關(guān)，而攝入飼料、攝食習(xí)性的差別都會對腸道消化酶造成影響[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，腸道中5 次/d 組α-淀粉酶活性顯著高于2、3 次/d 和4 次/d 組；脂肪酶和胰蛋白酶活性顯著高于4、5次/d組。而謝蘇明[27]研究發(fā)現(xiàn)，2次/d組大口黑鱸脂肪酶活性最高；褚志鵬[13]發(fā)現(xiàn)投喂頻率對大雜交鱘α-淀粉酶和脂肪酶無顯著影響；Xie 等[28]發(fā)現(xiàn)投喂頻率對大黃魚腸道胰蛋白酶活性有顯著影響。魚種差異和食性差異等內(nèi)源因素和養(yǎng)殖周期、養(yǎng)殖模式、溫度、水體酸堿度和光暗周期等外源因素均會對魚類消化酶活性產(chǎn)生影響[29-30]。

肝胰臟是魚類的代謝和排毒器官，在魚體中起著去氧化、肝糖的儲存和分泌性蛋白質(zhì)合成等功能，消化酶，膽汁等也是由肝胰臟合成。本研究中，投喂頻率影響肝胰臟中消化酶活性，其中，4 次/d 組α-淀粉酶活性顯著高于其他組，胰蛋白酶活性呈先上升后下降趨勢，脂肪酶活性呈先下降后上升的趨勢。而衛(wèi)育良等[31]發(fā)現(xiàn)，投喂頻率對紅鰭東方鲀的α-淀粉酶活性無顯著影響，脂肪酶活性呈先上升后下降的趨勢，肉食性魚類對淀粉利用率較差，隨著投喂頻率的增加，攝入的淀粉含量變高，從一開始刺激淀粉酶的分泌到淀粉過量堆積刺激脂肪酶的分泌的過程[21，32]。

3.3 投喂頻率對大口黑鱸胃腸道和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類體內(nèi)生理代謝和營養(yǎng)消化吸收的重要器官，腸絨毛為腸道中吸收飼料中養(yǎng)分的主要結(jié)構(gòu)，腸絨毛的高度和寬度的大小決定了腸黏膜的養(yǎng)分吸收面積，也表明腸道的健康情況[33]。腸道肌層厚度反映了腸道的收縮與擴張能力，當腸道功能紊亂腸道對飼料中營養(yǎng)成分吸收能力下降導(dǎo)致肌層變薄[34-36]。本試驗中，各組前、中、后腸的絨毛高度、寬度和肌層厚度均存在差異。其中在前腸中3 次/d 投喂絨毛高度、寬度和肌層厚度均高于其余各組，腸道消化吸收能力和健康狀況較好。有研究表明，大口黑鱸前腸皺襞數(shù)量顯著多于中腸和后腸，前腸為腸道的主要消化場所，而中腸和后腸的環(huán)境則為食物殘渣和糞便的排出提供了有利條件[37]。在Imsland 等[38]的報道中；每天投喂的圓鰭魚腸道出現(xiàn)上皮結(jié)構(gòu)紊亂，而每周投喂3 d和4 d投喂組的腸道健康狀況較好、固有層延長以及發(fā)炎等現(xiàn)象，進一步表明不合理的投喂頻率會對魚類腸道造成損傷。

大口黑鱸為有胃魚，其胃由黏膜層、黏膜下層、固有層、肌層組成，呈Y形，分為3個部分：最前端與食道相連為賁門部，最后端與幽門盲囊相連為幽門部，中間主體部分為胃體部[39]。胃腺細胞存在于黏膜層中，黏膜層的厚度關(guān)系到胃腺細胞數(shù)量的多少，肌層由平滑肌構(gòu)成，肌層厚度影響胃的收縮能力和消化能力[40-41]。本試驗中，隨著投喂頻率的增加，胃肌層和黏膜層厚度呈先上升后下降的趨勢。其中3次/d投喂組肌層厚度和黏膜層厚度均處于較高水平，由此推測，投喂頻率在3次/d時胃消化吸收能力處于較高水平。

通過組織切片觀察，本試驗中大口黑鱸2、3、4、5 次/d 和6 次/d 組肝胰臟均發(fā)現(xiàn)脂肪滴和細胞空泡化的情況，在4、5、6 次/d 組中情況尤為嚴重，每天投喂4、5、6 次/d 存在形狀不規(guī)則的細胞，這種情況被稱為脂肪化。Shearer[42]發(fā)現(xiàn)，當投喂頻率過高時，大鱗大麻哈魚肝胰臟中脂肪積累量上升，造成肝胰臟患病風(fēng)險增加；吉富羅非魚中，當投喂頻率過高時，其肝胰臟受到損傷[43]。以上說明過多的脂肪積累在肝臟中，引起魚類肝細胞細胞核偏移、細胞空泡化和細胞輪廓模糊，破壞了肝胰臟細胞結(jié)構(gòu)，也就是說肝胰臟中脂肪過量堆積是引起肝胰臟病變的可能之一[44]。由此推斷，本試驗中投喂頻率為2、3次/d時，大口黑鱸肝胰臟健康狀況較好狀態(tài)。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗通過分析不同投喂頻率對大口黑鱸的生長、飼料效率、消化能力組織器官健康狀況，得出在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)下3次/d投喂組為該環(huán)境下大口黑鱸幼魚適宜投喂頻率。