基于PI3K/AKT信號通路探討琥珀散對子宮內(nèi)膜異位癥小鼠的影響及作用機制研究

孫新慧 郭亞楠 霍超越 林陶秀 ROBERTS SONG ZE 張文娟 何甜甜 張晨 賽佳洋 馬小娜

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs),簡稱內(nèi)異癥,是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織(間質(zhì)和腺體)出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體肌層以外的部位[1]。是臨床中引起女性痛經(jīng)、盆腔痛及不孕的主要原因之一。EMs的發(fā)病率為15%～20%,并且呈逐漸升高的趨勢[2]。其歸屬于中醫(yī)“痛經(jīng)”“癥瘕”“月經(jīng)過多”“不孕”等范疇[3]。

琥珀散出自《普濟本事方》,又稱“本事琥珀散”,原方由三棱、莪術(shù)、當歸、赤芍、熟地黃、劉寄奴、丹皮、肉桂、菊花、蒲黃組成,另有去菊花、蒲黃,而用烏藥、延胡索者,全方具有行氣活血、溫經(jīng)止痛之功效,臨床可作為治療寒凝血瘀型EMs的有效方[4]。課題組前期的臨床研究表明,琥珀散治療子宮內(nèi)膜異位癥療效確切[5]。前期實驗研究表明琥珀散可降低內(nèi)膜組織中的免疫因子(T helper cells,Th)1/Th2,降低基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)的含量、改善局部微環(huán)境,抑制內(nèi)膜細胞的粘附、侵襲、血管生成,以起到干預內(nèi)異癥的作用[6-9]。此外,有研究顯示,在EMs模型中,異位的內(nèi)膜磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號通路被激活,從而使得血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達得以增強,并且促進異位內(nèi)膜的浸潤及種植,推進EMs的發(fā)生和發(fā)展[10]。并且,我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)現(xiàn)琥珀散治療子宮內(nèi)膜異位癥與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)[11]。因此,本實驗主要研究琥珀散是否通過影響該信號通路而發(fā)揮對EMs的多靶點調(diào)控作用,為中醫(yī)藥防治EMs提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

選擇無特定病原體(specificpathogenfree,SPF)級,6～8周齡的雌性BALB/c小鼠60只,體質(zhì)量18～22 g,性周期4～5天。購于京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證編號:SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗室。條件:室內(nèi)溫度設(shè)定在20℃,濕度設(shè)定為60%,清潔度Ⅱ級,常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周。方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準,倫理審批號:BUCM-4-2021021501-1098。

1.2 實驗藥物

中藥琥珀散配方顆粒(三棱10 g、莪術(shù)10 g、赤芍15 g、劉寄奴10 g、牡丹皮10 g、肉桂6 g、當歸10 g、熟地黃15 g、延胡索12 g、烏藥15 g)購自北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院顆粒藥房,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供,配成溶液(1 mL藥液中約含1.6 g生藥),4℃冰箱存用;西藥將PI3K激酶抑制劑(LY294002,商品編號:A8250-50 mg),溶于二甲基亞砜(DMSO,商品編號:D2650-100 mL)中備用。

1.3 主要實驗試劑與儀器

0.9%氯化鈉溶液,碘伏,蘇木素染液,伊紅染液,4%多聚甲醛,二甲基亞砜(DMSO,商品編號:D2650-100 mL)、PI3K激酶抑制劑(LY294002,商品編號:A8250-50 mg),ELISA試劑盒:小鼠絲裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6481A)、小鼠血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6044A)、小鼠腫瘤蛋白p53(TP53)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6476A)、小鼠RACa絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6473A),由北京百諾威生物科技有限公司提供。免疫組化抗體:Anti-pan-AKT抗體(貨號:60203-2-Ig),Anti-PI3Kinase p85 beta抗體(貨號:67644-1-Ig),由北京百諾威生物科技有限公司提供。

病理切片機(德國徠卡公司,型號RM2235),組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司,型號KD-P),凍臺(武漢俊杰電子有限公司,型號JB-L7),烤片機(常州國華電器有限公司,型號DB-B2),烤箱[邦西儀器科技(上海)有限公司,型號101-1BS],倒置顯微鏡(日本尼康,型號Nikon Ci-S)。

1.4 建立小鼠模型

脫頸椎法處死捐贈BALB/c小鼠,將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺,用酒精將腹部消毒后,沿小鼠腹部正中線剖開腹腔,完整將其子宮取出,將子宮的漿肌層及其周圍的脂肪組織剔除,放入裝有10 mL的37℃生理鹽水的培養(yǎng)皿中,漂洗表面的血跡、漿肌層和脂肪碎屑后,將子宮一分為二,將兩個子宮角分別放入培養(yǎng)皿中,將其直接剪碎成約1 mm3大小的小碎片,并將此小碎片溶于1 mL的37℃生理鹽水中。酒精消毒接受鼠腹部后,于臍下0.5 cm偏正中線0.5 cm處的左下腹為進針點,將溶有子宮內(nèi)膜碎片的1 mL生理鹽水注入接受鼠的腹腔。手術(shù)全程在無菌條件下進行,全程操作在5分鐘內(nèi)完成[12]。造模后3周后將40只小鼠隨機分成4組,在各組中隨機挑選3只開腹觀察異位病灶的位置、形態(tài)等情況。

1.5 動物分組及給藥

將60只BALB/c小鼠隨機分為捐贈鼠20只,實驗鼠40只,再將40只實驗鼠隨機分為正常組、疾病模型組、琥珀散組、西藥組,每組10只。琥珀散組按成人臨床用藥量等效量的2倍給予14.3 g/kg灌胃,連續(xù)給藥4周;西藥組將LY294002溶于DMSO后腹腔注射,以0.04 g/kg進行計算,每周腹腔注射一次,給藥4周[13];正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥4周。待灌胃結(jié)束后,由于小鼠存在個體差異、耐受性差等原因,取材時正常組小鼠余7只,疾病模型組小鼠余7只,琥珀散組小鼠余7只,西藥組小鼠余6只。

1.6 取材及實驗檢測

在給藥結(jié)束后的第2天進行實驗取材。各組小鼠眼球后取血,3 000 r/min離心15分鐘,取上層血清裝入PE管,-80℃冰箱凍存。各組小鼠采用脊椎脫臼法處死后,開腹探查異位病灶生長情況,正常組取子宮,其余各小鼠取在位子宮內(nèi)膜和異位病灶,各組組織標本分割后置入4%多聚甲醛中保存。

1.6.1 各組小鼠異位病灶觀察 (1)異位病灶大體形態(tài)學比較:觀察異位病灶形態(tài)并用游標卡尺測量異位病灶體積(長×寬×高,單位:mm3)并進行稱重比較。(2)蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察在位及異位內(nèi)膜組織病理學變化:取多聚甲醛固定的在位或異位內(nèi)膜組織常規(guī)包埋,切片,HE染色后使用中性樹膠封片,置于光學顯微鏡下觀察、記錄并拍照。

1.6.2 ELISA法檢測各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3水平變化 參考ELISA試劑盒操作流程:以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,計算出標準曲線的直線回歸方程式,計算樣品濃度,乘以稀釋倍數(shù)后即可得實際樣品濃度。

1.6.3 免疫組化法檢測各組小鼠內(nèi)膜組織中PI3K、AKT的表達 待實驗結(jié)束后,每組隨機選取5只小鼠進行免疫組化檢測,經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋后,做5 μm連續(xù)切片,操作及染色步驟均嚴格按照免疫組化檢測試劑盒說明書進行。采用病理圖像分析儀對切片進行拍照,在相同視野下對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野,然后利用IPP軟件進行免疫組化吸光度表達分析,測定內(nèi)膜組織中PI3K、AKT的表達。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組異位EMs小鼠異位病灶觀察

EMs主要病理性增殖的外在表現(xiàn)為異位病灶的生長及體積的變化。造模后的第21天,于各組中隨機挑選 3 只子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠開腹觀察,除正常組以外,其余各組均見移植物生長,造模成功率為100%。大體觀察可見模型組的異位病灶體積明顯增大,重量增加,異位病灶呈單個或多房樣葡萄,大多數(shù)為透明樣,內(nèi)含大量透明或淡黃色清亮液體,質(zhì)地柔軟,囊泡表面覆蓋著豐富的血管網(wǎng),與周圍組織粘連明顯。與模型組相比,各治療組異位病灶的體積減小、重量減少、內(nèi)含液體減少、血管形成不明顯、粘連情況也較少。見圖1。

注:A為疾病模型組,B為西藥組,C為琥珀散組。

2.2 各組小鼠內(nèi)膜組織病理形態(tài)學變化

正常組小鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整、上皮細胞呈長柱狀排列、整齊連續(xù),多數(shù)為間質(zhì)細胞,含有豐富的腺體和血管;疾病模型組小鼠可見異位內(nèi)膜上皮細胞以低柱狀細胞或立方狀細胞為主,呈環(huán)形或鋸齒狀生長,部分區(qū)域內(nèi)膜也可呈乳頭狀生長,且有炎性細胞的浸潤,其間質(zhì)層可見血管豐富,腺體數(shù)量減少,甚至消失,肌層結(jié)構(gòu)不清晰。西藥組和琥珀散組的異位內(nèi)膜均可見不同程度的上皮細胞變薄,多為扁平狀或低立方狀,呈現(xiàn)出萎縮性改變,部分異位內(nèi)膜腺上皮明顯被破壞甚至消失。見圖2。

注:A為正常組子宮內(nèi)膜,B為疾病模型組異位灶,C為西藥組異位灶,D為琥珀散組異位灶。

2.3 各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量

與正常組相比,疾病模型組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量均顯著升高(P<0.01),琥珀散組、西藥組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量顯著降低(P<0.01);與琥珀散組相比,西藥組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量

2.4 各組小鼠在位內(nèi)膜組織PI3K、AKT免疫組織化學染色結(jié)果

2.4.1 各組小鼠在位內(nèi)膜組織PI3K表達比較 PI3K陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內(nèi)膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質(zhì)細胞中。與正常組相比,疾病模型組在位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組、西藥組小鼠在位子宮內(nèi)膜組織PI3K、的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組小鼠在位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖3。

表2 各組小鼠在位內(nèi)膜組織PI3K、AKT的表達

注:A為正常組;B為疾病模型組;C為西藥組;D為琥珀散組。

2.4.2 各組小鼠在位內(nèi)膜組織AKT表達比較 AKT陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內(nèi)膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質(zhì)細胞中。與正常組相比,疾病模型組在位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組、西藥組在位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組在位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖4。

注:A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

2.5 琥珀散對EMs小鼠在位、異位子宮內(nèi)膜組織PI3K、AKT表達的影響

2.5.1 各組小鼠在位、異位內(nèi)膜組織PI3K表達比較 PI3K陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內(nèi)膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質(zhì)細胞中。與正常組相比,疾病模型組異位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著升高(P<0.01);西藥組異位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組異位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01)。與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組異位子宮內(nèi)膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01);琥珀散組較西藥組異位內(nèi)膜PI3K表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表3、圖5。

表3 各組小鼠在位、異位內(nèi)膜組織PI3K、AKT的表達

注:A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

2.5.2 各組小鼠在位、異位內(nèi)膜組織AKT表達比較 AKT陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內(nèi)膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質(zhì)細胞中。與正常組相比,疾病模型組異位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達顯著升高(P<0.05);西藥組、琥珀散組異位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組異位子宮內(nèi)膜組織AKT的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見表3、圖6。

注: A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

3 討論

中醫(yī)學認為,EMs是以“正氣不足”為內(nèi)因,“血瘀”為外在表現(xiàn)的一種疾病,“瘀血”貫穿發(fā)病的始終,是其主要病理實質(zhì)[14]。瘀阻胞宮,不通則痛,發(fā)為痛經(jīng);瘀阻胞絡(luò),兩精不能相合,遂成不孕;瘀血日久不去,積聚腹中,固定成型,則為癥瘕[15]?；贓Ms“寒凝血瘀成癥”的中醫(yī)病機,課題組認為對本病的治療應消癥散結(jié)的同時應注意調(diào)補正氣,以活血化瘀、消癥散結(jié)為主,輔以疏肝解郁、溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血益氣等,如此才能使血瘀得化,寒熱平調(diào),邪去正復。

琥珀散是本課題組臨床治療EMs的常用方劑,方中三棱、莪術(shù)破血散結(jié);官桂、烏藥溫里散寒,行氣止痛;赤芍、當歸、熟地、丹皮、延胡索養(yǎng)血活血,通經(jīng)止痛;劉寄奴味苦性溫,可破瘀除癥、活血通經(jīng)、消癰散結(jié)。諸藥相和,共奏溫里散寒、破瘀消癥之效[11]。現(xiàn)代藥理研究表明,EMs的病理過程與免疫炎癥、氧化應激、自噬、凋亡和血管生成密切相關(guān)[16]。有研究表明,三棱具有造血功能,抗炎活性和免疫學特性[17];作為赤芍的主要藥理學成分的黃芩苷可通過核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)途徑抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的活力治療EMs,還可顯著增加G0/G1期的細胞數(shù)量,顯著減少S和G2/M期的細胞數(shù)量[18-19]。本實驗基于課題組的前期研究基礎(chǔ),主要研究琥珀散是否通過影響AKT1、TP53、VEGF-A、MAPK3細胞因子、PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮對EMs的多靶點調(diào)控作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn),AKT為PI3K下游的主要信號分子,亦是PI3K/AKT通路下游的重要的靶激酶,能夠被PI3K誘導磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated-AKT,P-AKT)而被激活,P-AKT誘導核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factory erythroid-2 related,Nrf2)與Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein,Keap1)解離并促進Nrf2核轉(zhuǎn)位,然后與抗氧化響應元件(Antioxidant response element,ARE)結(jié)合而誘導抗氧化酶(SOD、CAT等)和血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)轉(zhuǎn)錄表達,進而抑制氧化應激反應和線粒體損傷[20],在調(diào)節(jié)細胞生長,增殖,抗凋亡,細胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面起重要作用[21]。TP53可明顯調(diào)控細胞周期,與EMs有密切的相關(guān)性[22-23]。MAPK家族和其下游信號通路在調(diào)控細胞有絲分裂、遷移、代謝、粘附、侵襲、雌激素表達、細胞凋亡抑制、炎癥和血管生成中具有重要地位,尤其在EMs的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮中介和信號放大的作用,因此MAPK1和MAPK3亦是本事琥珀散的重要的干預靶點[24-25]。此外,有研究表明,PI3K/AKT途徑是一種密切參與到細胞增殖、運動、凋亡、代謝和免疫應答調(diào)節(jié)的信號通路[26-27],與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[28]。同時,亦有研究表明,EMs雖是良性婦科疾病,但其特點與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲能力相似,子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的活性隨著AKT的活化而增強,隨著AKT的抑制而減弱[29],而PI3K途徑的激活可誘導血管內(nèi)皮細胞生長,加速EMs的發(fā)展進程[30]。

本實驗采用同種異體移植中腹腔注射法造模,操作簡單,少有出血、感染死亡,有利于維持病灶組織形態(tài)和各類生化指標,使實驗結(jié)果更有臨床意義[31]。實驗研究發(fā)現(xiàn):疾病模型組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量的表達較正常組相比,均顯著升高,可能與細胞周期的調(diào)控有關(guān)[22-23],琥珀散組、西藥組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量表達與正常組相比無明顯差異;琥珀散組、西藥組血清TP53,AKT1,VEGF-A和MAPK3的含量與疾病模型組相比顯著降低,這可能與誘導血管內(nèi)皮細胞增長[32]、激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)1和ERK2,調(diào)節(jié)TSC2磷酸化[33],進而調(diào)控細胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[24]。此外,疾病模型組異位內(nèi)膜組織PI3K、AKT的蛋白含量表達較正常組相比均顯著升高,琥珀散組、西藥組異位內(nèi)膜組織PI3K、AKT的蛋白含量與疾病模型組相比,表達顯著降低。亦有研究表明,抑制PI3K/AKT信號通路活性可能對EMs有抑制作用[34],這與本實驗的研究結(jié)果相一致。

綜上所述,琥珀散可下調(diào)TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的表達,抑制PI3K/AKT信號通路,作用于細胞增殖、凋亡等過程,而發(fā)揮對EMs的多靶點調(diào)控作用。