氮、磷肥及其配合施用對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)及氨基酸含量與組成的影響

李明傳,崔祥宇,李信書*,何培民,徐軍田,伏光輝,陳百堯

(1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;3.連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心,江蘇 連云港 222044)

引 言

條斑紫菜(PyropiayezoensisUeda)是世界上人工栽培歷史久遠(yuǎn)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的經(jīng)濟(jì)海藻之一,其年產(chǎn)值約18億美元[1]。條斑紫菜主要產(chǎn)地分布在中國(guó)、日本和韓國(guó),經(jīng)加工烘干后制作成海苔以供食用。我國(guó)的栽培區(qū)域主要集中在蘇北沿海地區(qū)。紫菜味鮮美,蛋白質(zhì)含量高而質(zhì)量好,無機(jī)元素非常豐富,富含膳食纖維及各種維生素[2],深受世界各地人們的喜愛。

食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成比例雖不盡相同,但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)劣主要取決于所含必需氨基酸的種類、數(shù)量和組成比例。條斑紫菜氨基酸含量占干重的30%左右,含有人體所需的所有必需氨基酸,并且必需氨基酸含量及比例都明顯高于WHO/FAO的必需氨基酸模式[3]。所以條斑紫菜的氨基酸的含量及其組成是條斑紫菜及其重要的品質(zhì)性狀之一,但紫菜的氨基酸含量與組成受到水流、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境條件的影響[3]。

游離氨基酸(FAA)是指以游離狀態(tài)存在的氨基酸。與水解氨基酸相比,FAA對(duì)營(yíng)養(yǎng)的貢獻(xiàn)不是很大,但FAA是重要的滋味物質(zhì)和香味前體物質(zhì),具有酸、甜、苦、咸、鮮等多種味道[4],其中谷氨酸與天冬氨酸呈鮮味,甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸則呈甜味。研究表明FAA的含量是影響條斑紫菜風(fēng)味的重要因素之一,特別是含量較大的Ala、Glu、Asp、Arg等4種主要氨基酸,被認(rèn)為對(duì)條斑紫菜的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[5-6]。

紫菜的生長(zhǎng)需要大量吸收碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素,養(yǎng)殖海區(qū)的水流流速、營(yíng)養(yǎng)鹽供應(yīng)及季節(jié)影響紫菜的生長(zhǎng)和品質(zhì),影響紫菜的氨基酸組成[3,7-8]。本文探討了硝酸氮(N)和磷酸鹽(P)供應(yīng)對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)特性和氨基酸含量與組成的影響,為條斑紫菜的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜采自連云港海域養(yǎng)殖區(qū),挑選出色澤鮮亮、植株長(zhǎng)約5 cm、生長(zhǎng)良好的個(gè)體,在10 ℃、光照度6 000 lx、光暗周期為12 h∶12 h的條件下,用過濾的自然海水在5 L的三角燒瓶中持續(xù)充氣培養(yǎng),培養(yǎng)密度約為1 g/L。每2 d換一次新鮮海水,培養(yǎng)4 d后備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

1.3 生長(zhǎng)的測(cè)定

每隔2 d測(cè)定一次藻體的鮮質(zhì)量,共培養(yǎng)8 d。按下式計(jì)算特定生長(zhǎng)速率(specific growth rate,SGR)[10]:

SGR=100%(ln Wt-ln W0)/t

式中,W0為初始藻鮮重(g);Wt為培養(yǎng)t時(shí)間藻的鮮重(g);t為試驗(yàn)培養(yǎng)的時(shí)間(d)。

1.4 游離氨基酸的測(cè)定

稱取條斑紫菜0.05 g(精確至0.1 mg),放入研缽加入石英砂并滴加3 mL的磷酸緩沖液充分研磨至勻漿裝。轉(zhuǎn)移到離心管后,3 000×g離心5 min,過濾。按濾液體積加入等體積的7%的磺基水楊酸混合,1 h后3 000×g離心5 min,取上清液,過濾備用。

1.5 總氨基酸的測(cè)定

稱取100 mg(精確至0.1 mg)紫菜于特制的水解管底部,緩慢加入4 mL 6 mol/L HCl并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)水解管,保證樣品全部在試管底部并保證樣品得到全部潤(rùn)濕,旋緊蓋子。110±1 ℃水解24 h。切開水解管用去離子水全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容,雙層濾后紙過濾,取濾液1 mL置于25 mL小燒杯中,在加NaOH的真空干燥器中蒸干(水浴加熱不超過50 ℃),加入pH 2.2 HCl 1 mL溶解后,溶液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中備用。

1.6 色譜條件

采用LC98-I AAA氨基酸分析系統(tǒng)二元梯度高效液相色譜系統(tǒng)及專用C18色譜柱,采用紫外檢測(cè)器完成氨基酸的檢測(cè)。色譜柱:氨基酸分析專用ODS柱;柱溫:40 ℃;流速:1 mL/min;波長(zhǎng):254 nm。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用excel2007、origin7.0、N2000色譜工作站進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)分析。生長(zhǎng)結(jié)果采用雙因子方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析,p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 N、P及其配合對(duì)條斑紫菜葉狀體生長(zhǎng)的影響

圖1顯示培養(yǎng)一周后在不同施肥條件下條斑紫菜葉狀體的相對(duì)生長(zhǎng)率。以N、P配合施用條斑紫菜葉狀體相對(duì)生長(zhǎng)率最高,達(dá)到14.4%,施P肥處理組的相對(duì)生長(zhǎng)率居第二,達(dá)12.3%,僅施N肥的效果平平,相對(duì)生長(zhǎng)率為10.5%,高于對(duì)照的9.4%。說明N和P對(duì)條斑紫菜的生長(zhǎng)存在顯著的交互作用(p<0.05),證明N、P配合極為有效。

圖1 N、P及其配合對(duì)條斑紫菜葉狀體生長(zhǎng)率的影響(上標(biāo)不同字母表示不同生長(zhǎng)率之間有顯著性差異,P<0.05)

2.2 不同N、P條件對(duì)條斑紫菜葉狀體氨基酸含量的影響

圖2清楚顯示了17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的出峰順序與時(shí)間。在選定色譜條件下,17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品可被充分衍生,各氨基酸衍生物依次出峰,基線平穩(wěn),分辨率高。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸(A)和條斑紫菜氨基酸(B)的分離色譜圖(1.天冬氨酸;2. 蘇氨酸;3. 絲氨酸;4.谷氨酸;5. 甘氨酸; 6. 丙氨酸;7. 胱氨酸;8. 纈氨酸;9. 蛋氨酸;10. 異亮氨酸;11. 亮氨酸;12. 酪氨酸;13. 苯丙氨酸;14. 賴氨酸;15. 脯氨酸;16. 組氨酸;17. 精氨酸)

N、P及配合施用對(duì)條斑紫菜氨基酸總含量產(chǎn)生不同的影響。和對(duì)照比較,N、P肥配合施用對(duì)條斑紫菜氨基酸總含量表現(xiàn)為互助效應(yīng),增加最多,達(dá)14.1%;而單施N肥使條斑紫菜的氨基酸總含量增加9.3%;相反,單施P肥對(duì)條斑紫菜氨基酸總含量表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng),下降5.8%。N、P肥配合施用使條斑紫菜氨基酸含量增加最多的是Ala,比對(duì)照增加49.5%,其次是Phe和Val等(表1)。在條斑紫菜中8種必需氨基酸占總氨基酸含量的百分比大于40%,含量最高的3種必需氨基酸分別是Ala、Leu和Val,N、P肥配合施用均使8種必需氨基酸占總氨基酸含量的百分比有所增加。

表1 N、P及其配合對(duì)條斑紫菜葉狀體氨基酸含量的影響

添加N、P肥均提高紫菜FAA的含量,單獨(dú)添加P肥FAA較對(duì)照略增加8.0%,單獨(dú)施氮肥FAA較對(duì)照增加32.4%,而同時(shí)施N、P肥FAA則大幅增加61.3%(表2)。不過單獨(dú)添加N肥使FAA占總氨基酸百分比百分比由對(duì)照的6.78%增加到8.22%,單獨(dú)施P肥使紫菜的FAA占總氨基酸百分比增加到7.77%。同時(shí)施N、P肥紫菜的FAA占總氨基酸百分比為9.58%(表2)。

表2 N、P肥及其配合施用對(duì)條斑紫菜葉狀體中游離氨基酸(FAA)含量的影響

在FAA的呈味氨基酸中,芳香族游離氨基酸(Tyr+Phe)含量為0.08～0.16 mg/g,所占比例為0.3%～0.58%,添加N或P能提高芳香族游離氨基酸(Tyr+Phe)的含量。鮮味氨基酸(Asp+Glu)含量為5.6～7.24 mg/g,所占比例為21.64%～27.41%,單獨(dú)添加N或P使鮮味氨基酸含量略有降低,但同時(shí)施N、P肥則使鮮味氨基酸含量略有增加。實(shí)測(cè)甜味氨基酸(Ser+Gly+Ala+Pro)含量為7.3～16.07 mg/g所占比例為28.2%～38.51%,單獨(dú)或同時(shí)添加N、P肥均使甜味氨基酸含量大幅增加(圖3),其中尤以Ala的增幅最大,達(dá)3.1倍(表2)。

圖3 不同N、P肥條件下條斑紫菜呈味氨基酸的組成(圖中數(shù)字上標(biāo)字母不同表示差異顯著P<0.05)

3 討論

與陸地高等植物一樣,氮和磷也是海藻生長(zhǎng)的限制因子。近年來,由于紫菜栽培業(yè)者盲目擴(kuò)大紫菜栽培面積,高密度的栽培造成海區(qū)氮、磷缺乏,嚴(yán)重影響紫菜的產(chǎn)量和品質(zhì),甚至造成大面積病害。本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)行氮肥和磷肥單獨(dú)施用及配合施用,可以得到這樣的結(jié)論:單施氮肥無助于條斑紫菜生長(zhǎng),但顯著促進(jìn)增加氨基酸含量的增加;單施磷肥顯著促進(jìn)條斑紫菜生長(zhǎng),但使氨基酸含量降低;只有氮肥與磷肥配合施用,既顯著促進(jìn)條斑紫菜生長(zhǎng),增加鮮重,又顯著增加氨基酸含量,并使呈味氨基酸增加,改善條斑紫菜食用品質(zhì),表現(xiàn)出氮肥和磷肥配合施用的互助效應(yīng)。

單獨(dú)添加氮并沒有顯著促進(jìn)紫菜的生長(zhǎng),這可能因?yàn)閷?duì)照的氮濃度足以維持紫菜較快的生長(zhǎng)需要,不過很多藻類的生長(zhǎng)率會(huì)隨著葉片中氮含量下降而下降[11];也可能是因?yàn)樽喜梭w內(nèi)貯存足夠多的氮,在短期內(nèi)可以提供生長(zhǎng)所需。李信書等[8]發(fā)現(xiàn),單獨(dú)添加氮不能促進(jìn)條斑紫菜生長(zhǎng),但可促進(jìn)組織氮的積累,包括游離氨基酸、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白在內(nèi)的可溶性蛋白的合成。紫菜等紅藻體內(nèi)的氮含量與環(huán)境中氮含量的相關(guān)性比綠藻和褐藻要緊密得多[12]。氮以無機(jī)或有機(jī)代謝物形式貯存起來,這稱之為奢侈消費(fèi)或奢侈同化,這是藻類應(yīng)對(duì)氮限制的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制[8,13]。盡管如此,添加氮將對(duì)提高蛋白氨基酸的含量尤其是游離氨基酸的含量大有裨益。

磷在植物代謝中非常重要,它是核酸、核蛋白和磷脂的主要成分,并與蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)有密切關(guān)系。在磷限制的環(huán)境條件下,植物的光合作用受到嚴(yán)重抑制,抑制率可達(dá)50%[14]。大葉藻(Zosteramarina)在磷不限制的情況下,堿性磷酸酶活性對(duì)于優(yōu)化C和N的代謝至關(guān)重要[15]。這與本文中磷與氮之間存在協(xié)同作用的結(jié)果相一致,同時(shí)添加氮磷有利于促進(jìn)生長(zhǎng)、蛋白氨基酸積累和游離氨基酸含量的提高。

紫菜中的氨基酸總量受風(fēng)浪、潮流和海水中營(yíng)養(yǎng)物等的影響[7],實(shí)際上海水流動(dòng)改善了營(yíng)養(yǎng)鹽和二氧化碳的供給狀況,從而影響紫菜氨基酸的含量。氨基酸含量尤其是8種必需氨基酸的含量是評(píng)價(jià)食物品質(zhì)的主要依據(jù)。添加氮和磷均能提高紫菜蛋白質(zhì)的含量,8種必需氨基酸所占的比例也有所提高。氮限制使提克江蘺(Gracilariatikvahiae)的游離氨基酸含量迅速下降,這意味著當(dāng)外界氮源減少時(shí),游離氨基酸充當(dāng)?shù)A存的功能而被利用[16]。因此在海區(qū)缺少營(yíng)養(yǎng)鹽時(shí),適當(dāng)施肥有利于提高紫菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

FAA含量可以作為魚、蝦、貝等水產(chǎn)品鮮美度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]。Yoshie等[18]研究表明紫菜中FAA含量越高,包含的Ala、Asp、Glu和Gly等越多,就越能讓人能感到紫菜的鮮美。同時(shí)添加氮磷呈甜味的Ala和Gly及鮮味的Glu都有顯著提高,有利于改善紫菜的品質(zhì)。馬家海等[19]也認(rèn)為中國(guó)產(chǎn)條斑紫菜的游離Ala含量較高,所以甜味較濃,這可能與中國(guó)海區(qū)營(yíng)養(yǎng)鹽供給有關(guān)。不過紫菜的品質(zhì)除了受氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的影響外,還受到其它因素的影響。Niwa等[6]的研究結(jié)果顯示日本神戶紫菜FAA中Glu含量隨采收季節(jié)明顯遞減,認(rèn)為前期采收的紫菜游離Glu含量高,口感好。紀(jì)明侯等[7]指出條斑紫菜的氨基酸含量變化隨不同海區(qū)的肥度而變化,同時(shí)季節(jié)也對(duì)氨基酸的含量和組成構(gòu)成影響。說明紫菜氨基酸和FAA的含量和組成除受到營(yíng)養(yǎng)鹽的影響,還可能受到溫度、光照、紫菜發(fā)育階段等因素的影響。