lncRNA FEZF1-AS1和IGF2BP1在肝癌組織中的表達及臨床意義

姚順春,張永川

原發(fā)性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,對我國人民生命健康構成嚴重的威脅。目前對肝癌的治療是以手術為主的綜合治療,但由于其惡性程度高、易復發(fā),病人5年生存率仍較低[1-2]。迄今為止,肝癌的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全明確,目前認為肝癌的發(fā)生是由基因和環(huán)境因素共同導致的結果,研究其發(fā)生發(fā)展機制,對于肝癌的診斷、治療和預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類非編碼RNA分子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌或促癌作用,研究表明,lncRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,調節(jié)肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移,可作為肝癌的生物標志物[3-4]。lncRNA Fez家族鋅指蛋白1反義RNA1(Fez family zinc finger protein 1 antisense RNA1,FEZF1-AS1)為lncRNA的一種,研究[5]顯示,lncRNA FEZF1-AS1在肝癌細胞中高表達,可促進肝癌細胞的生長、遷移和侵襲。胰島素樣生長因子2-mRNA結合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1,IGF2BP1)屬于單鏈RNA結合蛋白家族,可通過與mRNA結合,調控腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲[6]。研究[7]表明,微小RNA-139-5p(miR-139-5p)靶向調控IGF2BP1表達,抑制肝癌細胞增殖,誘導細胞凋亡。通過生物信息學分析顯示,lncRNA FEZF1-AS1與IGF2BP1有結合位點,因此推測lncRNA FEZF1-AS1可能調控IGF2BP1表達參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA及蛋白在肝癌組織中表達情況,探討lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表達水平與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年3月在本院進行手術治療的60例原發(fā)性肝癌病人作為研究對象,所有病人手術過程中取肝癌組織和癌旁組織,均經病理診斷為肝癌,且未經放化療治療。其中男32例,女28例;年齡41～83歲,平均年齡(61.7±10.30)歲;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期38例,Ⅲ～Ⅳ期22例;腫瘤直徑<5 cm 31例,腫瘤直徑≥5 cm 29例;有肝硬化33例,無肝硬化27例;有淋巴結轉移25例,無淋巴結轉移35例;低中分化36例,高分化24例;乙肝抗原陽性39例,陰性21例。研究樣本采集均經過本院倫理委員會批準,病人或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Trizol試劑購自美國Sigma公司,反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司,lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1和內參基因引物均由上海生工生物工程公司設計與合成,兔抗人IGF2BP1多克隆抗體購自美國Elabscience公司。

1.3 研究方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA表達 取肝癌組織與癌旁組織,超聲勻漿后,加入Trizol試劑提取總RNA,使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA,采用qRT-PCR檢測lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA水平。lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1和內參基因GAPDH基因序列設計引物見表1,反應結束后采用2-△△CT分析法計算lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 免疫組織化學染色檢測IGF2BP1蛋白表達 取肝癌組織與癌旁組織,石蠟包埋后切片,經過脫蠟、抗原熱修復、封閉后,加兔抗人IGF2BP1多克隆抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜,加入二抗,孵育后二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復染,顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

染色結果判斷標準:以細胞膜或細胞質出現(xiàn)黃色顆粒染色為陽性。根據(jù)陽性細胞數(shù)評分:陽性細胞≤5%,記0分;6%～25%,記1分;26%～50%記2分;51%～75%,記3分;75%以上記4分;根據(jù)細胞染色強度評分:細胞無明顯染色為0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。將兩項評分相乘作為最終評判標準:得分0～1分為IGF2BP1陰性表達,2分及以上為IGF2BP1陽性表達。

1.3.3 隨訪 隨訪日期截至2021年3月,主要采用門診隨訪和電話隨訪,每3個月隨訪一次,共隨訪36個月,死亡病人以死亡時為終止時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、χ2檢驗、相關分析及生存分析。

2 結果

2.1 lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA在肝癌組織與癌旁組織表達水平比較 結果顯示,肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1表達水平為(3.65±0.56),顯著高于癌旁組織(1.04±0.19),差異有統(tǒng)計學意義(t=34.19,P<0.01);肝癌組織中IGF2BP1 mRNA表達水平為(2.78±0.52),顯著高于癌旁組織(0.98±0.21),差異有統(tǒng)計學意義(t=24.86,P<0.01)。

2.2 肝癌組織、癌旁組織中IGF2BP1蛋白表達水平 免疫組織化學染色結果顯示,IGF2BP1主要定位于細胞質或細胞膜,肝癌組織中IGF2BP1蛋白陽性表達有40例,癌旁組織IGF2BP1蛋白陽性表達有14例,肝癌組織中IGF2BP1蛋白陽性表達率(66.67%)顯著高于癌旁組織(23.33%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.76,P<0.01)(見圖1)。

2.3 肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1與IGF2BP1 mRNA表達水平相關性 肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1與IGF2BP1 mRNA表達水平呈正相關關系(r=0.602,P<0.01)。

2.4 肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表達水平與臨床病理特征的關系 根據(jù)肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1表達情況將肝癌病人分為lncRNA FEZF1-AS1高表達組(≥3.65)、lncRNA FEZF1-AS1低表達組(<3.65),根據(jù)IGF2BP1蛋白陽性表達情況將肝癌病人分為IGF2BP1陽性表達組、IGF2BP1陰性表達組,分析發(fā)現(xiàn)不同年齡、性別、腫瘤大小、有無肝硬化、乙肝抗原陰陽性水平間lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低中分化程度和有淋巴結轉移的病人lncRNA FEZF1-AS1和IGF2BP1表達水平較高(P<0.05)(見表2)。

表2 肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表達水平與臨床病理特征的關系(n)

2.5 肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表達與肝癌病人預后的關系 對病人進行隨訪3年,通過Kaplan-Meier生存分析可知,lncRNA FEZF1-AS1高表達組3年累積生存率為31.45%,lncRNA FEZF1-AS1低表達3年累積生存率為61.40%,兩組生存率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.01,P<0.01)。IGF2BP1陽性表達組3年累積生存率31.18%,IGF2BP1陰性表達組3年累積生存率58.25%,兩組生存率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.74,P<0.01)(見圖2)。

3 討論

lncRNA可在基因轉錄及轉錄后等方面調控基因表達,多項報道顯示,肝癌組織中已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA,與肝癌預后、疾病進展和耐藥性有關[8]。lncRNA FEZF1-AS1在多種腫瘤組織或細胞中上調表達,發(fā)揮癌基因的作用,與血管內皮細胞凋亡、促進化療耐藥性、自噬和上皮-間充質轉化密切相關[9]。已有多項報道[10-12]顯示,lncRNA FEZF1-AS1在結腸癌、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌等多種腫瘤中上調表達,在促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。GONG等[13]研究表明,lncRNA FEZF1-AS1在肝細胞癌組織和細胞中表達上調,敲除lncRNA FEZF1-AS1可以顯著抑制肝癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。另有研究[14]表明,lncRNA FEZF1-AS1高表達與肝癌病人的侵襲性表型和不良預后相關,敲低FEZF1-AS1可以通過誘導細胞周期停滯而抑制肝癌細胞的增殖,通過抑制JAK2/STAT3信號抑制細胞的遷移、侵襲與上皮-間質轉化。本研究結果顯示,肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1表達水平顯著高于癌旁組織,與先前報道一致,且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低中分化程度和有淋巴結轉移的病人lncRNA FEZF1-AS1表達水平較高,推測lncRNA FEZF1-AS1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用。

IGF2BP家族包含IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3,可通過識別靶mRNA上的m6A修飾參與調控作用,IGF2BP1可以增強腫瘤細胞的增殖、轉移等能力,與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關,多項研究[15-16]結果表明,IGF2BP1在腎癌、肝癌等多種惡性腫瘤表達水平升高,被認為是一種致癌基因。張平等[17]研究表明,結直腸癌組織中IGF2BP1蛋白陽性率顯著升高,且其表達與腫瘤組織分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和病人預后相關。研究[18]報道,IGF2BP1在肝癌組織中表達上調,IGF2BP1可能通過m6A甲基化及miRNA抑制作用的方式上調mRNA的表達,促進肝癌發(fā)生并導致不良預后。本研究結果顯示,肝癌組織中IGF2BP1 mRNA及蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織,與報道一致,且其表達水平與肝癌病人臨床分期、分化程度和淋巴結轉移有關,提示IGF2BP1參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。研究[19]顯示,miR-29可通過靶向抑制IGF2BP1的表達而抑制肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲,表明抑制IGF2BP1的表達可顯著抑制肝癌的進展,為肝癌的靶向治療提供一個方向。

有研究[20-21]顯示lncRNA FEZF1-AS1與膠質瘤病人預后有關,其表達高的膠質瘤病人生存期較短,IGF2BP1與卵巢癌病人預后有關。本研究結果顯示,lncRNA FEZF1-AS1高表達組肝癌病人3年累積生存率顯著低于lncRNA FEZF1-AS1低表達組,IGF2BP1陽性表達組肝癌病人3年累積生存率顯著低于陰性表達組病人,提示lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1可能通過調控腫瘤進展而影響肝癌病人預后情況。然而,lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚不清楚。IGF2BP1為RNA結合蛋白,研究顯示lncRNA LIN28B-AS1直接與IGF2BP1結合促進肝癌細胞的生長、增殖、遷移和侵襲[22]。本研究結果顯示,肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1與IGF2BP1 mRNA表達水平呈正相關性,提示兩者共同促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。進一步通過starbase生物學軟件預測發(fā)現(xiàn),lncRNA FEZF1-AS1與IGF2BP1有結合位點,因此本研究推測,lncRNA FEZF1-AS1可能通過靶向結合IGF2BP1,共同促進肝癌的發(fā)生發(fā)展,進而影響病人預后。

綜上所述,肝癌組織中l(wèi)ncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1高表達,二者均與肝癌病人臨床分期、分化程度、淋巴結轉移等臨床病理特征和預后有關,可能作為肝癌病人潛在的預后標志物。