亞硒酸鈉對(duì)羊肚菌液體發(fā)酵的影響

杜孟祥, 戚姚瑛, 王子玉, 張杰杰, 孫玉軍*

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100;2.安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

羊肚菌(Morchellaesculenta)屬子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱(Discomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellac)、羊肚菌屬(Morchella)[1]。羊肚菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極其豐富,具有很高的食用和藥用價(jià)值。羊肚菌中含有大量的多糖和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì),研究表明所含有的多糖具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及降血脂等特性[2]。

微量元素是一類對(duì)維持機(jī)體正常生命活動(dòng)及治療和預(yù)防疾病具有重要意義的物質(zhì),但是機(jī)體自身不能合成,需要外源補(bǔ)充[3]。硒是人體必需微量元素,具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗炎癥[6]等多種功能。在生物體中無(wú)機(jī)硒通過(guò)與多糖、多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合,轉(zhuǎn)化而形成有機(jī)硒[7-8],在人體中主要以硒代氨基酸的形式存在[9]。研究表明,有機(jī)硒類化合物依布硒在體外抗病毒試驗(yàn)中,能顯著抑制新冠病毒復(fù)制,在新冠病毒的臨床治療中具有一定潛力[10]。

野生羊肚菌資源有限,人工栽培環(huán)境條件苛刻,而現(xiàn)代液體發(fā)酵技術(shù)不僅成本低,還不受環(huán)境因素限制,羊肚菌發(fā)酵菌絲還具有產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、周期短等特點(diǎn)[11]。食用菌具有很強(qiáng)的微量元素富集能力,易于將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒[12],富集微量元素的食用菌在補(bǔ)充人體所需微量元素的同時(shí),藥理活性也有所提升。

本研究對(duì)不同來(lái)源的5株羊肚菌菌株的硒耐受能力進(jìn)行比較,篩選具有較好耐受能力的菌株,進(jìn)一步在添加不同濃度亞硒酸鈉的液體培養(yǎng)基中,測(cè)定菌絲生長(zhǎng)和菌絲中硒富集率等指標(biāo),探究羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的最適添加量,為羊肚菌富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

1.1.1 供試材料 5株野生羊肚菌由鳳陽(yáng)及周邊地區(qū)采集分離獲得,按采集時(shí)間分別編號(hào)為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5。

1.1.2 供試試劑 葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Na2SeO3、2,3-二胺基萘、鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸二鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、濃硫酸、蒽酮、濃硝酸、高氯酸、環(huán)己烷、雙氧水等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600型熒光分光光度計(jì)(日本日立有限公司);FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);GI80DS型高溫高壓蒸汽滅菌鍋(致微儀器有限公司);KS-5200DE型液晶超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司);XHF-DY型高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司);V-500型可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);DT5-4型離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);SPH2102型溫控臺(tái)式搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 固體培養(yǎng)基:200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水。液體發(fā)酵培養(yǎng)基:20 g葡萄糖、5 g蛋白胨、3 g KH2PO4、1 g MgSO4·7H2O、1 000 mL蒸餾水。富硒培養(yǎng)基:稱取0.5 g亞硒酸鈉溶于100 mL超純水中,配制成5 mg/mL亞硒酸鈉母液,向培養(yǎng)基中添加母液,配制成亞硒酸鈉終質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL的富硒固體和富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.2 菌種活化 將4 ℃下保存的羊肚菌母種接種到固體平板培養(yǎng)基中,26 ℃培養(yǎng)3 d,備用。

1.3.3 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定 用內(nèi)徑6.6 mm打孔器取活化好的羊肚菌菌塊,接入富硒固體培養(yǎng)基中央,培養(yǎng)24 h,采用十字交叉法,用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑(mm)。

1.3.4 羊肚菌富硒液體發(fā)酵培養(yǎng) 取10塊0.5 cm2的固體培養(yǎng)物接入150 mL液體培養(yǎng)基中,26 ℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)5 d,使用高速分散器分散菌絲球,得羊肚菌種子液。種子液按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,26 ℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)。

1.3.5 生物量測(cè)定 抽濾分離菌絲體和發(fā)酵液,菌絲體冷凍干燥,稱重記錄質(zhì)量,計(jì)算生物量(g/L)。

1.3.6 羊肚菌菌絲胞內(nèi)生物活性物質(zhì)測(cè)定

1.3.6.1 胞內(nèi)總蛋白含量測(cè)定 稱取0.100 0 g富硒發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體粉末,加入5 mL蒸餾水重懸,超聲破碎1 h(溫度為60 ℃,功率為100 W)。12 000 r/min離心10 min,上清液即為蛋白提取液。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行含量測(cè)定[13]。

1.3.6.2 胞內(nèi)可溶性糖含量測(cè)定 富硒發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體粉末按料液比1∶40加入蒸餾水,90 ℃水浴浸提2 h。離心取上清液,采用蒽酮-硫酸法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.3.6.3 胞內(nèi)有機(jī)硒含量測(cè)定 取0.5 g富硒菌絲體粉末于消化管中,加入2 mL 30%過(guò)氧化氫、8 mL濃硝酸、2 mL高氯酸,消化過(guò)夜,加熱蒸發(fā)后樣液,用稀鹽酸定容,采用2,3-二氨基萘熒光法測(cè)定硒含量[15]。富硒率計(jì)算公式如下:

其中,Xi為菌絲體硒含量(mg/g);mi為菌絲體生物量(g);MNa2SeO3為亞硒酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量;MSe為硒相對(duì)原子質(zhì)量;Ci為亞硒酸鈉質(zhì)量濃度(mg/mL);V為發(fā)酵液體積(mL)。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有樣品采用3個(gè)重復(fù),結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。分別采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同羊肚菌菌株耐硒性能比較

圖1為5株羊肚菌在不同濃度的亞硒酸鈉固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h的菌落直徑的比較。在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為0～50 μg/mL范圍內(nèi)的固體培養(yǎng)基上,Y2菌株的菌落直徑最大,顯著高于其他菌株(P<0.05),菌落直徑由大到小依次為Y2、Y5、Y3、Y1、Y4。富硒固體培養(yǎng)過(guò)程中,亞硒酸鈉質(zhì)量濃度較低(≤20 μg/mL)時(shí),對(duì)5株羊肚菌菌絲生長(zhǎng)有輕微的促進(jìn)作用(如Y2),或者沒有影響(如Y4);當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度較高(≥30 μg/mL)時(shí),對(duì)5株羊肚菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用。

圖1 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)羊肚菌固體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of sodium selenite on mycelium growth of Morchella esculenta in solid culture

亞硒酸鈉的濃度不僅影響菌絲的生長(zhǎng)速度,對(duì)菌絲的健壯程度和菌落的形態(tài)也有影響,如圖2和表1所示。亞硒酸鈉質(zhì)量濃度較低(≤20 μg/mL)時(shí),菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好,菌絲呈白色濃密狀,生長(zhǎng)速度相較于對(duì)照組略快。隨著亞硒酸鈉濃度增加,Y2菌絲生長(zhǎng)受到抑制,顏色變紅、菌落稀,密度較低。圖2為菌株Y2在不同濃度富硒固體培養(yǎng)基中的菌落形態(tài),其他菌株形態(tài)接近,未列出。比較以上5種菌株在富硒固體培養(yǎng)基上的菌落直徑,可以看出羊肚菌Y2菌株耐硒能力最強(qiáng),其在含有20 μg/mL亞硒酸鈉的平板上,菌絲延伸速度最快,因此作為后續(xù)富硒發(fā)酵的菌株。

圖2 亞硒酸鈉對(duì)羊肚菌Y2菌株菌落形態(tài)的影響Fig.2 Effects of sodium selenite on colony morphology of Morchella esculenta Y2 strain

表1 亞硒酸鈉對(duì)羊肚菌Y2菌株生長(zhǎng)的影響

2.2 羊肚菌Y2菌株液體發(fā)酵生長(zhǎng)曲線

在液體發(fā)酵條件下,羊肚菌Y2菌株菌絲體生物量隨著液體發(fā)酵時(shí)間的增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖3)。培養(yǎng)1～2 d增長(zhǎng)速率最快,之后由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗,生物量積累速度降低,但總量仍在增加,在培養(yǎng)5 d后獲得最大生物量5.287 g/L。故羊肚菌Y2菌株富硒液體發(fā)酵時(shí)間選擇5 d。

圖3 羊肚菌Y2菌株生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Morchella esculenta Y2 strain

2.3 亞硒酸鈉濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體生物量的影響

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的亞硒酸鈉,振蕩培養(yǎng)5 d后,測(cè)定其生物量的積累,結(jié)果如圖4所示。亞硒酸鈉添加質(zhì)量濃度≤20 μg/mL時(shí),羊肚菌Y2菌株菌絲體生物量隨著亞硒酸鈉濃度的增加而略增加,未加硒時(shí)菌絲體生物量為5.276 g/L,亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),菌絲體生物量最大,為5.500 g/L,但差異不顯著;亞硒酸鈉質(zhì)量濃度≥30 μg/mL后,菌絲體生物量呈下降趨勢(shì)(圖4)。

圖4 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲生物量的影響Fig.4 Effects of sodium selenite concentration on the mycelial biomass in liquid fermentation of Morchella esculenta Y2 strain

2.4 亞硒酸鈉濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)總蛋白含量的影響

亞硒酸鈉質(zhì)量濃度在0～50 μg/mL范圍內(nèi),羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)總蛋白含量隨著亞硒酸鈉添加量的增大而減小(圖5)。未加硒組菌絲體胞內(nèi)總蛋白含量為2.4 mg/g,亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10、20 μg/mL時(shí),胞內(nèi)總蛋白含量分別降到2.35和2.25 mg/g,比未加硒組分別降低2.08%和6.25%,表明液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉使羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)總蛋白合成減弱。當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度在30、40、50 μg/mL時(shí),蛋白質(zhì)含量顯著下降,分別比未加硒組下降16.67%、27.92%、32.5%。

圖5 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)總蛋白含量的影響Fig.5 Effects of sodium selenite concentration on the content of total protein in the mycelium of Morchella esculenta Y2 strain under liquid fermentation

2.5 亞硒酸鈉濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)可溶性糖含量的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度在0～50 μg/mL范圍內(nèi)會(huì)促進(jìn)羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)可溶性糖的合成,可溶性糖含量隨著亞硒酸鈉添加量的增大出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)(圖6)。當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),菌絲體可溶性糖含量達(dá)到最大值(161.6 mg/g),顯著高于未加硒組的129.6 mg/g。

圖6 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)可溶性糖含量的影響Fig.6 Effects of sodium selenite concentration on intracellular soluble sugar content in the mycelium of Morchella esculenta Y2 strain under liquid fermentation

2.6 亞硒酸鈉濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)有機(jī)硒富集率的影響

由表2可知,隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增大,羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)有機(jī)硒含量和富硒率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),其菌絲體硒含量和富硒率均為最大,分別可達(dá)0.180 mg/g和10.84%。綜上,確定羊肚菌Y2菌株富硒液體發(fā)酵的最佳亞硒酸鈉添加質(zhì)量濃度為20 μg/mL。

表2 亞硒酸鈉濃度對(duì)液體發(fā)酵羊肚菌Y2菌株菌絲體胞內(nèi)有機(jī)硒富集率的影響

3 結(jié)論與討論

羊肚菌液體發(fā)酵多用于液體制種、食品和醫(yī)藥研發(fā)等方面,液體菌種具有生產(chǎn)成本低、周期短、菌齡一致等優(yōu)點(diǎn);羊肚菌發(fā)酵產(chǎn)物現(xiàn)已開發(fā)為調(diào)味品、調(diào)味醬、保健飲品、保健酒、發(fā)酵醋和腐乳等多種功能性食品;羊肚菌發(fā)酵液和菌絲體均含有多種藥用活性成分,可用于改善胃粘膜損傷和新型降血脂類藥物的開發(fā)與研究[16]。羊肚菌本身具有較高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,且對(duì)硒元素具有較強(qiáng)的富集和轉(zhuǎn)化能力,將羊肚菌進(jìn)行富硒發(fā)酵培養(yǎng),得到的含硒活性物質(zhì)可同時(shí)兼顧羊肚菌和硒的優(yōu)點(diǎn),在保健品開發(fā)和醫(yī)藥研發(fā)等方面具有巨大潛力,因此富硒羊肚菌有很大的市場(chǎng)前景[17-18]。

現(xiàn)階段對(duì)于富硒羊肚菌的研究多集中在液體發(fā)酵培養(yǎng)階段,且不同菌株和不同培養(yǎng)條件之間具有較大差異[19]。張躍非[20]在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為9 μg/mL時(shí),液體發(fā)酵培養(yǎng)得到菌絲體富硒率為18.34%。冮潔等[21]報(bào)道,通過(guò)深層液體發(fā)酵培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)基中亞硒酸鈉添加質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)最終菌絲體中硒含量達(dá)0.13 mg/g,富硒率為9.10%,比培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高了50.41%。向戌蓮等[22]通過(guò)優(yōu)化富硒發(fā)酵培養(yǎng)條件,在硒質(zhì)量添加質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí),無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的硒源利用率為1.85%。在本研究中通過(guò)富硒固體培養(yǎng)篩選出生長(zhǎng)速度最快的羊肚菌Y2菌株,進(jìn)行富硒發(fā)酵培養(yǎng),亞硒酸鈉添加質(zhì)量濃度在20 μg/mL時(shí)菌絲體生物量為5.500 g/L、胞內(nèi)總蛋白含量為2.25 mg/g、胞內(nèi)可溶性糖含量為161.6 mg/g、胞內(nèi)有機(jī)硒含量達(dá)到0.180 mg/g、富硒率為10.84%,綜合考量,羊肚菌液體發(fā)酵添加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)富硒率達(dá)到最高,為羊肚菌富硒液體發(fā)酵亞硒酸鈉最佳添加量。

綜上,運(yùn)用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)對(duì)羊肚菌進(jìn)行富硒液體發(fā)酵具有便捷高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),所培養(yǎng)的菌絲體中易于人體吸收利用的有機(jī)硒含量豐富,且生物量和可溶性糖含量更高,將食藥性和補(bǔ)硒相結(jié)合,為富硒羊肚菌保健和醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。