三氟氯氰菊酯對雞胚的發(fā)育毒性及雛雞生長發(fā)育的評價(jià)

姜錦鵬, 陳佳瑞, 許 昊, 儲名鳳, 卜祥榮, 沈 陽

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;2.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100)

三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalothrin,LCT),又稱高效氯氟氰菊酯,是新一代Ⅱ型廣譜高效擬除蟲菊酯類殺蟲劑。LCT具有殺蟲譜廣、生物活性高、藥效迅速等特點(diǎn),因而被廣泛使用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲的防治[1-2]。LCT雖被認(rèn)為是高效低毒的殺蟲藥,但LCT具有利用率較低、吸附性強(qiáng)、抗藥性和蓄積性較高等特點(diǎn),長期過量施用容易大量殘留在作物[1-2]、水體[3]、土壤[4]等環(huán)境中,可通過食物鏈進(jìn)入動物甚至人體內(nèi),給人類與動物的健康安全帶來潛在危害[5-6]。研究表明,LCT對水生生物、家蠶和蜜蜂具有較高的毒性,可產(chǎn)生神經(jīng)、發(fā)育及生殖毒性以及癌變、致畸、內(nèi)分泌干擾等多方面的毒理學(xué)效應(yīng)[7-9],但一般認(rèn)為LCT對成年鳥類的毒性較低。而史夢竹等[5]發(fā)現(xiàn)LCT對鵪鶉的經(jīng)口毒性LD50為54.476 2 mg/kg,屬中毒,因此LCT殘留對禽類的毒性,特別是雞胚、幼禽的發(fā)育毒性,亦不容忽視。目前尚未見LCT對鳥類胚胎發(fā)育毒性及其早期生長影響等方面的有關(guān)研究。因此,本試驗(yàn)擬通過雞胚蛋注射LCT測定死胎數(shù)、生存率以及孵化率、弱雛率、出殼質(zhì)量與第18天胚蛋質(zhì)量的比值等指標(biāo),研究LCT對雞胚的發(fā)育毒性,并測定出殼后21 d雛雞的體質(zhì)量、部分內(nèi)臟器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)以及肝腎氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化,研究LCT蓄積對雞早期生長的毒性效應(yīng),旨在為評估LCT的殘留風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)鳥類安全性提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥品與試劑 三氟氯氰菊酯購自廣西壯族自治區(qū)田園生化股份有限公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、肌酐(Creatinine,CREA)、尿素氮(Urea Nitrogen,UREA-N)、總蛋白、總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動物 試驗(yàn)用受精草雞蛋來自安徽科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 主要儀器 FT-2-12Q型孵化機(jī)(江西方通實(shí)業(yè)有限公司孵化機(jī)械廠);SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);LDZM-60KCS型滅菌鍋(上海申安醫(yī)療機(jī)械廠);DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);1510型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);L500型臺式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);Vortex-2型旋渦混勻儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司);FA2004N型電子天平(上海菁海儀器有限公司);OSE-Y50型高速組織研磨器(天根生化科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孵化管理 入孵前種蛋挑選、消毒、分組、稱重、編號。入孵時(shí),各組胚蛋隨機(jī)放置于孵化器各層孵化盤中,蛋鈍端朝上。1～18 d孵化溫度為37.8 ℃,相對濕度為56%～58%,2 h翻蛋1次;19～21 d出雛溫度為37.2 ℃,相對濕度為70%。

1.2.2 胚蛋染毒 選擇已孵化7胚齡、質(zhì)量相近的草雞胚蛋160枚,隨機(jī)分為5組,每組32枚。Ⅰ組(對照組)向每枚雞胚的卵黃囊注射0.1 mL生理鹽水,Ⅱ～Ⅴ組(處理組)分別向每枚雞胚的卵黃囊注射0.1 mL 2.5、25、250、2 500 μg/mL LCT,注射后及時(shí)用滅菌石蠟封空,繼續(xù)孵化至雛雞出殼。卵黃囊注射參照唐瑋琦等[10]方法進(jìn)行。

1.2.3 雛雞飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)前清掃雞舍,清洗消毒雞籠、食槽和飲水器。將Ⅰ～Ⅳ組(因?yàn)棰踅M僅出殼1只弱雛,且不久死亡,故不設(shè)Ⅴ組)出殼后雛雞飼養(yǎng)于單層平置式雞籠內(nèi),自由采食和飲水。室溫、相對濕度和光照等條件按照雞常規(guī)飼養(yǎng)程序操作。試驗(yàn)期間觀察雞的飲水、采食及精神狀態(tài),保持雞舍衛(wèi)生。

1.3 測定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 雞胚發(fā)育指標(biāo) 分別于孵化第10天和第18天進(jìn)行照蛋,檢測死胚數(shù),計(jì)算死胚率,同時(shí)測定孵化第18天的胚蛋質(zhì)量。出殼時(shí),統(tǒng)計(jì)出雛數(shù)、弱雛數(shù),并測量出殼質(zhì)量,計(jì)算孵化率、弱雛率、出殼質(zhì)量與第18天胚蛋質(zhì)量的比值等。

1.3.2 雛雞體質(zhì)量和內(nèi)臟器官指數(shù) 雛雞飼養(yǎng)至21日齡,稱量空腹(前1天晚上開始斷料)時(shí)的體質(zhì)量,頸部放血處死并采集血樣。取血后雛雞按常規(guī)方法宰殺,分離胸肌、腿肌、心臟、肝臟和腎臟,稱量后肝、腎組織立即置于液氮冷凍,再置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?jì)算心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)。

1.3.3 血清生化指標(biāo) 將上述血樣于4 ℃靜置4 h后,3 000 r/min離心10 min,收集血清于-20 ℃保存。每組取6個(gè)血清樣品,按照試劑盒說明書測定ALT、AST活性以及CREA和UREA-N含量。

1.3.4 肝腎抗氧化指標(biāo) 取肝臟、腎臟組織樣品約100 mg,準(zhǔn)確稱重,加入900 mL 0.9% NaCl溶液,冰浴條件下充分研磨,勻漿液以2 500 r/min離心10 min,吸取上清液按試劑盒說明書測定總蛋白(考馬斯亮藍(lán)法)、GSH(微板法)、MDA(TBARS法)的含量和SOD活性(WST-1法),并以樣品蛋白濃度校正各組的GSH、MDA含量和SOD活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氟氯氰菊酯對雞胚發(fā)育的影響

由表1～2可知,Ⅱ～Ⅳ組雞胚的死胚率、孵化率、弱雛率及出殼質(zhì)量與第18天胚蛋質(zhì)量的比值,與對照組(Ⅰ組)相比無明顯差異,但Ⅴ組的死胚數(shù)、死胚率、弱雛率明顯高于對照組和Ⅱ～Ⅳ組,其出雛數(shù)、孵化率顯著低于對照組和Ⅱ～Ⅳ組,特別是染毒3 d(孵化第10天)時(shí),死胚數(shù)與死胚率明顯高于對照組和Ⅱ～Ⅳ組。

表1 三氟氯氰菊酯對雞胚死胚率、孵化率和弱雛率的影響

2.2 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞生長發(fā)育的影響

由表3可以看出,胚蛋注射LCT明顯抑制雛雞的生長發(fā)育,與對照組(Ⅰ組)相比,Ⅱ～Ⅳ組雛雞21日齡的體質(zhì)量分別降低了36.30%(P<0.01)、21.02%(P<0.01)和12.73%(P<0.05),胸肌質(zhì)量分別降低了18.16%(P>0.05)、36.46%(P<0.05)和34.70%(P<0.05),腿肌質(zhì)量分別降低了29.31%(P<0.05)、21.10%(P>0.05)和35.10%(P<0.05),心臟指數(shù)分別降低了16.89%(P<0.05)、12.26%(P<0.05)和5.05%(P>0.05),而各組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無明顯變化。

表2 三氟氯氰菊酯對雞胚出殼質(zhì)量的影響

表3 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞體質(zhì)量及部分內(nèi)臟器官指數(shù)的影響

2.3 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞血清生化指標(biāo)的影響

由表4可見,21日齡時(shí),Ⅱ～Ⅳ組雛雞血清CREA與UREA-N含量、AST和ALT活性,與對照組相比無顯著變化。

表4 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞血清生化指標(biāo)的影響

2.4 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞肝腎組織脂質(zhì)過氧化的影響

如表5所示,21日齡時(shí),Ⅲ組肝組織和Ⅱ組腎組織的GSH含量明顯升高,與對照組相比差異顯著(P<0.01或P<0.05);胚蛋注射LCT對雛雞肝腎組織MDA含量有增加的趨勢,其中Ⅲ組肝組織的MDA含量顯著增加(P<0.05);各試驗(yàn)組肝腎組織的SOD活性有增加趨勢,但與對照組相比無顯著變化(P>0.05)。

表5 三氟氯氰菊酯對21日齡雛雞肝腎組織GSH、MDA含量和SOD活性的影響

3 結(jié)論與討論

一般認(rèn)為,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生生物毒性大,而對哺乳動物和鳥類的毒性較低。但相關(guān)研究表明,長期暴露于擬除蟲菊酯環(huán)境中能干擾哺乳動物和鳥類的正常功能[5,11],特別是孕婦、孕畜、胚蛋、嬰幼兒、幼畜、幼禽等特殊群體對農(nóng)藥等有害物質(zhì)的抵抗力和易感性較低,可致其發(fā)生嚴(yán)重的發(fā)育障礙[12-13]。羅蓀琳等[9]研究發(fā)現(xiàn),高劑量(2 500 μg/mL)LCT暴露可引起受精后48 h斑馬魚仔魚心包水腫和卵黃囊水腫,表明高劑量LCT對斑馬魚胚胎發(fā)育有毒性作用。張彎彎等[14]結(jié)果表明,隨著LCT處理濃度增加和暴露時(shí)間延長,黃河鯉胚胎各個(gè)發(fā)育期的孵化率降低,而畸形率則呈漸增趨勢。雞胚12胚齡前主要營養(yǎng)物質(zhì)來自卵黃囊,因此注射到卵黃囊內(nèi)的外源物質(zhì)也能夠被胚胎較好地吸收,而且卵黃囊遠(yuǎn)離胚胎,注射后的應(yīng)激反應(yīng)較小[10]。Ohta等[15]研究表明,在孵化的第7 天注射外源性物質(zhì)到卵黃囊中對雞胚的孵化率影響較小。本試驗(yàn)依據(jù)雞胚發(fā)育特性及前人研究結(jié)果,選擇7胚齡時(shí)卵黃囊注射LCT對雞胚進(jìn)行染毒,結(jié)果表明,中低劑量(2.5～250 μg/mL)LCT處理對雞胚的死亡率、出雛率和弱雛率無顯著影響,但高劑量(2 500 μg/mL)LCT處理顯著增加了雞胚的死亡率和弱雛率,尤其對發(fā)育早期(孵化第10天)的雞胚影響更大,顯示高劑量LCT暴露對雞胚發(fā)育有明顯毒性作用。

LCT對哺乳動物和鳥類不僅具有急性毒性作用[5],還包括體質(zhì)量減輕等諸多慢性危害。李玖營[16]研究表明,LCT蓄積毒性處理組小鼠的體質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.01)。秦珩等[17]研究發(fā)現(xiàn),吸入高劑量(18.98 mg/m3)氟氯氰菊酯可使雄性大鼠體質(zhì)量及飼料轉(zhuǎn)化率降低。本試驗(yàn)表明,胚蛋注射一定劑量(2.5～250 μg/mL)LCT顯著降低出殼后21 d雛雞的體質(zhì)量、胸肌和腿肌質(zhì)量,說明LCT還能抑制出殼后雛雞的生長發(fā)育。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有高度的脂溶性,能分布于肝臟、腎臟等組織,對肝臟、腎臟產(chǎn)生潛在的毒性作用[18]。李玖營[16]在試驗(yàn)中觀察到LCT蓄積毒性處理組小鼠的肝腎切片局灶性壞死程度嚴(yán)重。秦珩等[17]研究發(fā)現(xiàn),吸入中高質(zhì)量濃度(9.05～18.98 mg/m3)氟氯氰菊酯可使雄性大鼠腎臟質(zhì)量降低,血液AST活性升高。張穎[18]在評價(jià)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥潛在毒性試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯菊酯的暴露并未引起小鼠肝臟質(zhì)量與嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)變化,血清ALT和AST活性亦未出現(xiàn)明顯的改變,但可引起肝細(xì)胞氧化損傷及凋亡,從而導(dǎo)致肝臟損傷。本試驗(yàn)中,胚蛋注射2.5～250 μg/mL LCT對出殼后21 d雛雞的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、血清AST和ALT活性、CREA與UREA-N含量均無明顯影響,這與張穎[18]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致,這可能由于檢測時(shí)間距染毒時(shí)間較長,血清AST、ALT活性以及CREA、UREA-N含量等常用的生化指標(biāo)可能已經(jīng)改善,或者血清AST、ALT活性以及CREA、UREA-N含量等常用的生化指標(biāo)并非評價(jià)LCT引起的肝腎毒性的最佳指標(biāo),其影響機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上,高劑量LCT暴露對雞胚具有明顯的發(fā)育毒性,胚胎期中低劑量LCT暴露抑制出殼后雛雞的早期生長發(fā)育,氧化應(yīng)激損傷是其毒性機(jī)制之一。