8種復方中藥液對畜禽常見致病菌的抑菌活性研究

張紅艷,韓姍姍,冉淦僑,胡云紅,殷 紅,張 強

(1.陜西省生物農業(yè)研究所,陜西 西安 710043;2.陜西省酶工程技術研究中心,陜西 西安 710043)

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；a業(yè)化的發(fā)展,我國畜禽養(yǎng)殖行業(yè)存在著疫病頻發(fā)、濫用抗生素、養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化等諸多問題。我國農業(yè)農村部第194號公告明確要求,退出除中藥外所有促生長類藥物飼料添加劑品種。隨著飼料禁抗令的正式出臺,以替代抗生素為核心優(yōu)勢與特點,如中草藥、生物發(fā)酵飼料、益生菌、酶制劑、酸化劑、植物提取物等一大批綠色、健康、安全的無抗飼料添加劑產品受到業(yè)界的高度關注。

天然植物中草藥具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小、無抗藥性等優(yōu)勢,可在飼料中長期添加使用。我國《飼料原料目錄》收錄的中草藥包括黃柏、黃芩、苦參、金銀花、連翹、板藍根、魚腥草、紫蘇、蒲公英、柴胡、白芷等清熱解毒、抗菌消炎類中藥,也包括黃芪、山藥、當歸、杜仲、甘草、白術、黨參、仙茅等補虛扶正、調節(jié)陰陽類中藥,此外還有神曲、麥芽、谷芽、山楂、大蒜等理氣消食、健脾益胃類中藥。

中草藥富含的黃酮、多糖、苷類、生物堿以及揮發(fā)油等活性成分,具有抑菌殺菌、提高畜禽機體免疫力和抗氧化能力,且毒副作用小,在防治動物疾病方面具有十分理想的作用,在一定程度上能代替抗生素的使用。李秀富等[1]探究了復方中藥(CCM)對肉仔雞免疫性能的影響,結果表明:日糧中添加復方中藥(CCM)能提高肉雞的免疫器官指數和新城疫抗體效價,且添加1%CCM的試驗組效果最優(yōu)。劉玉華等[2]選用6種中藥對雞白痢沙門氏菌進行體外抑菌實驗,結果發(fā)現:雞白痢沙門氏菌對黃芩、連翹、黃連3種藥物高度敏感,對夏枯草中度敏感。曹春雷等[3]研究發(fā)現復方中藥提取物能顯著提高凌云烏雞的產蛋性能。夏軍[4]研究發(fā)現飼喂添加60 g/L的復方中藥制劑人工乳可治療豬流行性腹瀉。矯松君等[5]研究表明,發(fā)酵富鍺中藥對育肥豬的日糧養(yǎng)分消化率、生長性能和屠宰率均有顯著提高。隋鵬飛[6]觀察和研究了中藥代替抗生素治療豬氣喘病的作用,結果顯示采用復合中藥治療的病豬病情控制效果要優(yōu)于對照組,恢復速度快且精神狀態(tài)也較好。

中藥提取物是目前國際天然醫(yī)藥保健品市場上一種新的產品形態(tài),是采用先進的工藝技術對中藥材或中藥復方進行提取分離加工得到的一種藥效相對明確的中藥產品。大量研究表明,中藥提取物有效成分有生物堿、多糖、黃酮、皂甙、揮發(fā)油和有機酸等,添加在飼料中無毒、無公害、無殘留,大多還能促進動物免疫功能提高,表現良好的防病促生長性能,可成為抗生素或激素的替代品[7]。中藥提取物有著嚴格的質量標準,又因其抗菌抗病毒作用強大、易控制、無毒副作用,日益被畜禽養(yǎng)殖領域高度重視。

本研究采用中藥提取物組配制成的復方中藥液對畜禽常見致病菌∶金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、產氣莢膜梭菌進行抑菌研究,對比其抑菌敏感性,為下一步開發(fā)畜禽專用無抗生物飼料提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1中藥提取物

黃連提取物、薄荷提取物、桔梗提取物、黃芩提取物、蒲公英提取物、金銀花提取物、黃柏提取物、梔子提取物、連翹提取物、荊芥提取物、半夏提取物、甘草提取物、當歸提取物、杜仲提取物、茯苓提取物、懷牛膝提取物、白頭翁提取物、秦皮提取物、野菊花提取物、黃芪提取物、黨參提取物(10∶1)、魚腥草提取物、板藍根提取物、大蒜提取物、五倍子提取物、大青葉提取物、杏仁提取物,均為10∶1比例提取物,由西安天葉植物原料技術有限公司提供。

1.1.2畜禽4種致病菌

金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)CMCC(B) 10104、沙門氏菌CMCC(B) 50094、產氣莢膜梭菌ATCC 13124,由廣州市微生物研究所有限公司保藏提供。

1.1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基,購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1復方中藥液的制備

按藥方比例分別稱取8種復方的中藥提取物,充分混合后,按1∶2(W/W)加入純凈水浸泡混勻,超聲震蕩20～30 min后,4℃靜置過夜。次日取出超聲震蕩10 min后放入45℃保溫1 h,7 000 r/min離心8 min,取上清液備用。

1.2.2菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌4種致病菌培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為1×108～9×108CFU/mL的試驗菌懸液。隨后將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)18～24 h后做活菌計數;將產氣莢膜梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基上,37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h后做活菌計數。

1.2.3中藥液抑菌效果測定

采用牛津杯瓊脂擴散法測定中藥液的抑菌效果。取20 mL溫度不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基,注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中,凝固,制成平板,作為底層。分別接種0.1 mL菌懸液至100 mL溫度不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基中,搖勻,制成接種菌培養(yǎng)基。在每一底層培養(yǎng)基中加入5 mL接種菌培養(yǎng)基,使在底層上均勻攤布,作為菌層。放置在水平臺上冷卻后,制成接種菌培養(yǎng)基平板。用鑷子將無菌牛津杯均勻地放入接種菌培養(yǎng)基平板上,每塊平板等距離放入4只牛津杯。往其中3只牛津杯中分別注入0.25 mL液體樣品,同時往第4只牛津杯中注入0.25 mL液體培養(yǎng)基作為空白對照。操作完畢后,將接種金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌的平板平放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,將接種產氣莢膜梭菌的平板平放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)結束后,測量各個抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 8種復方中藥液對畜禽常見致病菌的抑菌結果對比

實驗中藥復方依據中獸藥古方、化裁已有成方,由若干種中藥提取物組配而成,HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、YJL、QWT、SBZ、PHBQC主要成分詳見表1。

表1 8種中藥復方的提取物成分

按照1.2.1節(jié)的方法制備得到生藥濃度為0.5 g/mL的8種復方中藥液,對比藥液在同一濃度下對畜禽常見致病菌∶金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的抑菌結果,詳見表2。抑菌結果判定方法按《中藥藥理學》中的標準判定,抑菌直徑達到20 mm及以上的為極敏記為“++++”;15～19 mm為高敏,記為“+++”;10～14 mm為中敏,記為“++”;10 mm及以下為低敏,記為“+”;“-”表示無抑菌作用。

表2 不同復方中藥液對畜禽四種致病菌的抑菌結果

由表2可知,8種復方中藥液對4種致病菌試驗株呈現出不同的抑菌效果。中藥液對金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌的抑菌作用要明顯優(yōu)于綠膿桿菌和沙門氏菌。可以看出,HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、QWT、SBZ、PHBQC藥液對產氣莢膜梭菌試驗菌株表現出極敏的抑菌活性,YJL藥液對產氣莢膜梭菌抑菌活性為高敏;HLJDS藥液對金黃色葡萄球菌抑菌活性為極敏,YJL藥液對金黃色葡萄球菌試驗菌株無抑菌活性,其余6種均對金黃色葡萄球菌表現出中敏抑菌活性;HLJDS對綠膿桿菌試驗菌株有一定的抑菌作用,其余7種藥液均無抑制作用;除了HLJDS、QWT對沙門氏菌試驗菌株有中敏的抑菌活性之外,其余6種均無抑制作用。

從結果上來看,對試驗菌株有廣泛抑菌作用的是HLJDS,其對4種致病菌均有較好的抑菌效果,其次是QWT,對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌有一定的抑菌作用。HLJDS、QWT平板抑菌圈具體如圖1和圖2所示。

圖1 HLJDS中藥液的平板抑菌圈

圖2 QWT中藥液的平板抑菌圈

2.2 8種復方中藥液對單一致病菌的抑菌作用分析

金黃色葡萄球菌作為革蘭陽性菌的代表,它可引起動物的皮膚軟組織感染、敗血癥、心內膜炎、肺炎、腸炎等疾病,且易傳染,治愈率低,給畜禽養(yǎng)殖造成極大的經濟損失[8]。綠膿桿菌,也稱銅綠假單胞桿菌,是一種條件性致病菌,常分布于潮濕環(huán)境中,也可存在于人和動物的皮膚、呼吸道和腸道等部位,是引起創(chuàng)傷感染最常見的病原,現已有能引起羊化膿性肺炎、雞急性敗血死亡等的報道,嚴重危害養(yǎng)殖場經濟效益[9]。沙門氏菌是人獸共患病原菌,是一種常寄居于人類和動物腸道中的革蘭氏陰性胞內兼性厭氧菌,它不僅能夠引起畜禽的各種疾病,還能夠通過污染的畜禽產品,威脅人類健康[10]。產氣莢膜梭菌是一種廣泛存在于動物腸道中的革蘭氏陽性菌,易引起畜禽壞死性腸炎。當畜禽受到外源性產氣莢膜梭菌感染后,產氣莢膜梭菌能在腸道快速繁殖,導致組織腫脹壞死,并產生大量可致畜禽死亡的外毒素[11]。8種復方中藥液對4種致病菌的抑菌效果詳見圖3。

圖3 不同復方中藥液對畜禽主要致病菌的抑菌作用

實驗所選致病菌:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌是畜禽養(yǎng)殖上危害較大的致病菌。

由圖3可以看出,8種中藥液對產氣莢膜梭菌的抑菌作用大小依次為:HLJDS>BTWS>WWXDY=SBZ=PHBQC>YQH=QWT>YJL,抑菌直徑范圍為17～32 mm,均達到高敏以上,其中HLJDS抑菌效果最好,YJL抑菌作用略弱;對金黃色葡萄球菌的抑菌結果為:YQH和YJL沒有呈現出抑菌效果,其余6種中藥液的抑菌作用大小順序依次為:HLJDS>WWXDY>BTWS=SBZ>QWT>PHBQC,HLJDS抑菌直徑為極敏22.3 mm,抑菌略弱的PHBQC直徑為中敏11.0 mm。除此之外,對綠膿桿菌有一定抑菌效果僅有HLJDS,抑菌直徑為12.0 mm,對沙門氏菌有一定抑菌效果的是QWT和HLJDS,抑菌直徑分別為12.6 mm和12.0 mm。

分析HLJDS的廣譜抗菌性跟其主要成分黃芩、黃連、黃柏有關。黃芩、黃連、黃柏是中醫(yī)臨床常用的清熱解毒燥濕藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。三者常相互配合,以提高清熱解毒的力度,因此被稱為三黃。而QWT中的魚腥草、黃芩、金銀花、連翹、板藍根、甘草具有清熱解毒、疏散風熱作用,常用作抗病毒、抗炎藥物。組方抑菌效果跟提取物的質量、復合比例以及制劑形態(tài)也有一定的關系,下一步還將開展中藥復方對畜禽常見病毒(雞新城疫、禽流感、豬腹瀉病毒)的抗病毒研究。

3 結論

中草藥是一個健康綠色食品、安全可靠、無環(huán)境污染的飼料生產營養(yǎng)添加劑,已被人們廣泛地關注與研究,在獸醫(yī)學中具有極高的應用價值和廣闊的應用前景[12]。

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌為畜禽養(yǎng)殖常見致病菌,研究中藥提取物構成的中藥復方對致病菌的體外抑菌活性具有重要意義。結果顯示,8種復方藥液對產氣莢膜梭菌均表現極敏或高敏的抑菌活性,抑菌直徑范圍為17～32 mm;HLJDS、WWXDY、BTWS、SBZ、QWT、PHBQS對金黃色葡萄球菌表現出中敏以上的抑菌活性,抑菌直徑范圍為11～22.3 mm;HLJDS對綠膿桿菌試驗菌株有一定的抑菌作用,抑菌直徑為12.0 mm;HLJDS、QWT對沙門氏菌試驗菌株有中敏的抑菌活性,抑菌直徑分別為12.6 mm和12.0 mm。

從抑菌廣譜性來說,HLJDS的抑菌效果最好,其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌均有抑菌活性;其次QWT對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌也有抑菌活性。

中國國家飼料研究所在《21世紀中國飼料工業(yè)可持續(xù)發(fā)展與飼料工業(yè)科技》及中國飼料工業(yè)協會在《加入WTO對我國飼料工業(yè)的影響及對策》中均指出,中國應該大力發(fā)展以中藥提取物為原料的飼料添加劑、預混料、保健品等。在下一步飼用抗生素替代品的研發(fā)中,可根據畜禽具體致病菌來選擇需要的中藥或者中藥提取物復方與益生菌、酶制劑共同研發(fā)畜禽無抗飼料添加劑產品。