銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 高脂血癥合并糖尿病的改善作用

甘海寧，鄭柳怡，黃雪君，彭 莎，黎樂怡，陳玉興*

［1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院），廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095； 3.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510275］

隨著我國人口老齡化與生活方式的變化，國內(nèi)人群的血脂水平逐漸上升，血脂異常的患病率亦顯著增大。我國35 歲以上總人群血脂異常的患病率約為34.7%［1］，而血脂異常將導致心血管疾病事件（冠心病和中風） 的增加［2］。此外，糖尿病的流行亦帶來了嚴重的公共健康問題，2017年糖尿病占全球死因的10.7%，在中國就有超過84 萬患者死于糖尿?。?］。血脂、血糖的異常升高是糖脂代謝紊亂性疾病的主要特征。臨床觀察顯示，高血脂癥和糖尿病關系密切，高脂血癥合并有糖尿病的患者占高脂血癥總患者的21.20%［4］。因此，開發(fā)一種可有效地調(diào)節(jié)糖、脂代謝，并有可能降低糖脂代謝紊亂所引起的心腦血管疾病及并發(fā)癥的中藥制劑顯得尤為重要。

銀藍調(diào)脂膠囊由絞股藍、蜂膠、銀杏葉、化橘紅4 味中藥組成，為廣東省第二中醫(yī)院自主研發(fā)的中藥新制劑，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，用于氣滯瘀血型高脂血癥的治療。前期實驗發(fā)現(xiàn)銀藍調(diào)脂膠囊具有較好的降脂作用［5］，在此基礎上，本實驗通過高脂飲食誘導ZDF 大鼠（fa/fa） 建立高脂血癥合并糖尿病模型，觀察銀藍調(diào)脂膠囊對該模型大鼠血脂、血糖、炎癥相關指標、肝臟脂質(zhì)合成代謝關鍵酶乙酰輔酶A 羧化酶1 （ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS） 及轉錄因子肝X 受體α （LXRα） 蛋白表達的影響，為探討銀藍調(diào)脂膠囊調(diào)脂、降糖的作用及機制提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 24 只ZDF 模型大鼠（fa/fa），6 只ZDF 對照大鼠（fa/＋），雄性，SPF 級，體質(zhì)量180 ～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2016-0006。

1.2 藥物 銀藍調(diào)脂膠囊（批號J1911005） 由廣東省第二中醫(yī)院中藥制劑研究室提供。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號AAW6062，0.5 g/片）； 非諾貝特膠囊（美國雅培公司，批號27232，規(guī)格200 mg/粒）。

1.3 試劑 葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c） 檢測試劑盒 （批號20190831、20191018、20191018、20190714、20190714，南京建成生物工程研究所）； 大鼠腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-6 （IL-6）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、脂聯(lián)素（ADPN）、瘦素（Leptin）、胰島素（INS） 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號569180611、385180619、603190419、118180619、396180619、358180619，天津安諾瑞康生物技術有限公司）； 乙酰輔酶A 羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS）、轉錄因子肝X 受體α（LXRα）、β 肌動蛋白 （β-actin） 抗體 （貨號AF6421、BF0557、DF6864、AF7018，美國Affinity 公司）。

1.4 儀器 JJ500 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；BSA2245 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； 5450 型小型高速離心機 （德國Eppendorf 公司）；PowerPac 基礎電泳儀（美國Bio-Rad 公司）； 7020 型全自動生化分析儀（日本日立公司）； Varsoskan Flash 多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； TP1020 型全密封自動脫水機、RM2235 型輪式切片機、ST5020 型自動染色機（德國徠卡公司）； YD62 型石蠟包埋機、YD-6L 型智能冰凍包埋機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）； DP2-BSW 型病理圖像采集系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 ZDF 模型大鼠 （fa/fa） 飼喂Purina＃5008 誘導飼料（含粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%），ZDF 對照大鼠 （fa/＋） 飼喂正常大鼠維持飼料，每只50 g［6］。飼喂1 個月后，將ZDF 大鼠（fa/fa） 隨機分成模型組、非諾貝特＋二甲雙胍組（二甲雙胍0.180 g/kg＋非諾貝特0.018 g/kg） 和銀藍調(diào)脂膠囊高、低劑量組（5.148、2.574 g/kg），每組6 只； ZDF 大鼠（fa/＋） 作為正常組。各給藥組灌胃相應劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予蒸餾水（10 mL/kg），每天1 次，連續(xù)12 周。其間除正常組外，其余各組持續(xù)飼喂誘導飼料。

2.2 血清糖脂代謝和炎癥相關指標檢測 末次給藥1 h后，各組大鼠禁食不禁水，麻醉后腹主動脈取血，全血3 000 r/min 離心10 min，收集血清，按相應試劑盒說明書檢測血清TC、TG、HDL-c、LDL-c、GLU、INS、HbA1c、ADP、TNF-α、Leptin 水平。

2.3 HE 染色觀察肝組織病理形態(tài) 大鼠處死后取肝臟，一部分于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡實驗； 另一部分固定于多聚甲醛中，用于HE 染色。取固定于多聚甲醛的肝組織，行脫水、包埋、切片、脫蠟等操作后，常規(guī)HE染色，脫水后封片，于顯微鏡下觀察，并采用Image J 軟件定量分析脂滴空泡的相對面積比例。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達 取大鼠肝組織約100 mg，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液進行研磨，4 ℃放置10 min 后12 000 r/min 離心5 min，采用BCA 蛋白試劑盒測定上清液的蛋白濃度，加5×上樣緩沖液后進行蛋白變性。蛋白上樣后經(jīng)電泳、轉膜、封閉，孵育一抗、二抗，添加ECL 化學發(fā)光液后于成像系統(tǒng)中顯影成像，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算ACC1、FAS、LXRα 蛋白相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時用SNK 法，方差不齊時用Dunnett’s T3法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血脂水平的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組大鼠血清HDL-c水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比較（mmol/L，±s，n＝6）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比較（mmol/L，±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別TCTGHDL-cLDL-c正常組4.078±0.3681.590±0.2301.588±0.1970.807±0.112模型組10.184±1.493**4.821±0.478**0.676±0.322**1.982±0.359**非諾貝特＋二甲雙胍組5.454±1.489＃＃2.911±0.385＃＃0.763±0.3930.984±0.103＃＃銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組6.758±0.813＃＃3.483±0.707＃＃1.247±0.394＃1.132±0.146＃＃銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組7.013±0.850＃＃3.862±0.461＃＃1.031±0.4091.314±0.088＃

3.2 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血清Leptin、ADPN水平的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組大鼠Leptin 水平升高（P＜0.01），ADPN 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組Leptin 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），ADPN 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清Leptin、ADPN 水平比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠血清Leptin、ADPN 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，** P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別Leptin/（pg·mL-1）ADPN/（ng·mL-1）正常組298.633±81.56418.845±1.337模型組597.745±102.819**8.684±1.332**非諾貝特＋二甲雙胍組376.387±59.401＃＃15.031±1.675＃＃銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組389.915±104.981＃＃12.738±3.099＃＃銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組475.113±108.958＃11.297±2.471＃

3.3 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血糖的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清GLU、HbA1c水平升高（P＜0.01），INS 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組大鼠血清GLU、HbA1c 水平降低 （P＜0.01），INS 水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別GLU/（mmol·L-1）HbA1c/（mmol·L-1）INS/（pg·mL-1）正常組5.970±0.4721.854±0.925588.144±14.234模型組35.372±2.742**5.253±0.465**344.743±26.685**非諾貝特＋二甲雙胍組21.449±1.700＃＃2.561±0.395＃＃480.453±73.970＃銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組22.545±2.259＃＃2.814±0.479＃＃437.778±41.780＃銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組26.783±2.204＃＃3.147±0.316＃＃404.373±29.458＃

3.4 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血清TNF-α、IL-6水平的影響 如表4 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組、銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組大鼠血清TNFα、IL-6 水平降低（P＜0.01）。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TNF-α/（pg·mL-1）IL-6/（ng·mL-1）正常組67.904±4.08311.369±1.491模型組115.539±4.993**24.303±3.808**非諾貝特＋二甲雙胍組83.328±12.444＃＃14.733±1.821＃＃銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組80.952±8.489＃＃17.851±2.116＃＃銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組93.667±10.709＃＃18.807±3.071＃＃

3.5 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 肝組織病理形態(tài)的影響 如圖1 所示，正常組肝細胞肝小葉結構清晰，胞漿紅染均勻一致，肝竇清晰可見，肝索排列整齊； 模型組可見肝索排列紊亂，肝細胞腫脹、氣球樣變，見有大量大小不等的圓形脂滴空泡； 與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊各劑量大鼠肝組織肝竇較為清晰且肝索的排列相對整齊，脂滴空泡的數(shù)量也明顯減少，非諾貝特＋二甲雙胍組大鼠肝組織脂滴空泡明顯減少、變小，肝細胞腫脹較輕，肝竇較清晰，肝索排列較整齊。如表5 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調(diào)脂膠囊各劑量組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

表5 各組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例比較（±s，n＝6）

表5 各組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，** P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別脂滴空泡面積比例/%正常組0.239±0.189模型組44.232±9.356**非諾貝特＋二甲雙胍組14.836±3.760＃＃銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組16.686±2.895＃＃銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組25.552±4.009＃

3.6 銀藍調(diào)脂膠囊對ZDF 大鼠 （fa/fa） 肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織ACC1 蛋白表達有升高趨勢，LXRα蛋白表達有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），F(xiàn)AS 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組大鼠肝組織ACC1、FAS 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），LXRα 蛋白表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），銀藍調(diào)脂膠囊低劑量組大鼠肝組織FAS 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達（±s，n＝3）

4 討論

高脂血癥和2 型糖尿病均是我國乃至全球范圍內(nèi)的常見病、多發(fā)病，而且大多數(shù)糖尿病患者除了表現(xiàn)出血糖的異常升高之外，往往還伴隨有脂質(zhì)代謝異常的癥狀［7］。臨床上對高脂血癥合并糖尿病的治療主要以降脂藥和降糖藥聯(lián)用為主，口服降脂藥主要有貝特類、他汀類、煙酸及其衍生物等； 口服降糖藥主要有雙胍類、DPP-4 抑制劑類、磺脲類、噻唑烷二酮類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等［8］。多種藥物聯(lián)用雖然達到一定的降糖降脂效果，但也大大地增加了用藥風險。因此，開發(fā)同時具有降脂、降糖作用，且毒副作用相對更少、更小的中成藥，具有很高的研究與應用價值。

銀藍調(diào)脂膠囊由絞股藍、蜂膠、銀杏葉、化橘紅組成，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，適用于氣虛痰瘀阻痹型高脂血癥的治療。ZDF 大鼠（fa/fa） 是來源于高血糖Zucker 肥胖大鼠的近親繁殖，由于瘦素受體基因突變，在高脂飼料誘導下，極易引起肥胖、糖尿病，并伴隨有胰島素抵抗及高脂血癥［9］，更適合模擬人類糖脂代謝異常。因此，本實驗選擇ZDF 大鼠（fa/fa） 研究銀藍調(diào)脂膠囊對糖脂代謝異常的作用及機制。本實驗結果顯示，銀藍調(diào)脂膠囊能降低ZDF 大鼠血清TG、TC、LDL-c、GLU、HbA1c 水平，升高HDL-C、胰島素水平，證明其有較好的調(diào)血脂、降血糖作用，與臨床效果基本相符。

Leptin 由脂肪組織分泌，其在血清中的水平與動物脂肪組織大小成正比，對脂肪分解與運用有著重要的作用［10］。ADPN 由脂肪細胞分泌，是一種胰島素增敏激素，具有促進骨骼肌細胞脂肪酸氧化和糖吸收的作用，被認為是維持機體脂質(zhì)及血糖穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子［11-12］。本實驗結果顯示，銀藍調(diào)脂膠囊能降低ZDF 大鼠血清Leptin 水平，升高ADPN 水平，有助于改善ZDF 大鼠糖脂代謝紊亂狀態(tài)，這可能是銀藍調(diào)脂膠囊調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用機制之一。

糖脂代謝紊亂被認為是一種以慢性高血脂、高血糖和細胞因子水平升高為特征的代謝性炎性疾病，提示炎癥在其病因學中起著因果作用。有研究表明，高脂血癥、糖尿病與IL-6、Leptin、CRP 和TNF-α 水平的升高密切相關［13-14］。IL-6 可對B 淋巴細胞分化起促進作用，也可通過與其他細胞因子及效應分子產(chǎn)生細胞毒作用，導致胰島β細胞死亡； TNF-α 參與慢性炎癥和多種代謝紊亂，TNF-α的過度表達可造成胰島素抵抗［15］。本實驗表明，銀藍調(diào)脂膠囊可降低ZDF 大鼠血清IL-6、TNF-α 水平，提示銀藍調(diào)脂膠囊可能通過降低炎癥因子水平而起到改善胰島素抵抗作用，進而調(diào)節(jié)機體糖脂代謝。

ACC1 和FAS 均是脂肪酸合成的關鍵酶，而LXRα 是調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)的固醇敏感轉錄因子，調(diào)控多個組織（如肝臟、小腸、外周血細胞、腦等） 中與脂質(zhì)合成、運輸和排泄相關基因的表達［16］； LXRα 亦是膽固醇逆向轉運途徑的重要調(diào)節(jié)因子［17-18］，是決定全身膽固醇水平的重要因素。本實驗結果顯示，銀藍調(diào)脂膠囊有升高肝組織LXRα 蛋白表達的趨勢，可降低ACCI 及FAS 蛋白表達，提示銀藍調(diào)脂膠囊可通過抑制肝臟脂肪生成相關蛋白，從而減少肝臟中的脂質(zhì)積累。

綜上所述，銀藍調(diào)脂膠囊具有一定的降血脂、降血糖作用，能有效改善糖脂代謝紊亂狀態(tài)，其作用機制可能與改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝與炎癥反應，調(diào)控肝組織ACC1、FAS 蛋白表達進而減少肝臟脂質(zhì)的堆積有關。