冬凌草甲素類脂囊泡制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

王美麗，唐 靜，方曉東，王曉靜，豆銀霞

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064； 2.河南大學(xué)，河南 開封 475004）

冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的一種二萜類化合物，具有清熱解毒、心血管保護(hù)、降血壓、抑菌、止痛、增強(qiáng)免疫等活性［1-4］，在卵巢癌［5-6］、乳腺癌［6-7］、子宮內(nèi)膜癌［8］等婦科腫瘤方面也具有較好的治療作用，還可用于婦科消炎等［1］，具有重大開發(fā)價(jià)值。該成分在37 ℃水中的溶解度為0.64 g/L，容易導(dǎo)致藥物溶出受限； 表觀油水分配系數(shù)lgP為1.66［9］，在水中不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解［10］； 絕對(duì)口服生物利用度僅約為10%［11］，目前已有膠束［12］、自微乳［13］、固體分散體［14］、磷脂復(fù)合物［14］、固體脂質(zhì)納米粒［15］等相關(guān)報(bào)道。

類脂囊泡一般由非離子表面活性劑在水中自組裝形成，為增加其機(jī)械強(qiáng)度，往往在處方中加入一定量的膽固醇［16-17］，可包載脂溶性、水溶性藥物，其結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似，但類脂囊泡處方中不含易氧化的磷脂或磷脂衍生物類物質(zhì)，具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性［17-18］，并且其囊材廉價(jià)易得。因此，本實(shí)驗(yàn)制備冬凌草甲素類脂囊泡，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該相關(guān)藥物研發(fā)提供一種新型給藥制劑。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XWD-08T 型超聲儀（深圳市鑫旺達(dá)超聲波自動(dòng)化設(shè)備有限公司）； BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］； JB-4 型恒溫磁力攪拌器（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）； MDS-2008DS 型溶出儀（寧波新芝藥檢科技有限公司）； Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）； Venus-3 型真空凍干機(jī)（杭州富瑞捷科技有限公司）。

冬凌草甲素對(duì)照品（批號(hào)111721-211127，純度99.1%，中國食品藥品檢定研究院）； 冬凌草甲素原料藥（批號(hào)k28473，純度98%，西安開來生物工程有限公司）。司盤-60 （批號(hào)191210，江蘇采薇生物科技有限公司）； 海藻糖（批號(hào)190210，南京松冠生物科技有限公司）； 膽固醇（批號(hào)20200517，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司）。模擬胃液（含胃蛋白酶，批號(hào)20220816）、模擬腸液（含胰蛋白酶，批號(hào)20220915） （東莞市信恒科技有限公司）。甘露醇（批號(hào)20191105，上?？道噬锟萍加邢薰荆?蔗糖（批號(hào)20191008，南京松冠生物科技有限公司）。

SD 大鼠，雌雄兼具，體質(zhì)量（220±20） g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 冬凌草甲素含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），測(cè)定血藥濃度時(shí)串聯(lián)預(yù)柱（4 mm×4 mm，5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-水（60 ∶40）； 體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取類脂囊泡混懸液1 mL，置于100 mL 量瓶中，加入50 mL 甲醇超聲處理6 min，甲醇稀釋定容，取5 mL 至10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取冬凌草甲素對(duì)照品12.48 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解，制成249.6 μg/mL貯備液，流動(dòng)相依次稀釋至12.48、6.24、1.248、0.624、0.124 8、0.062 4 μg/mL，即得對(duì)照品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝23.117X-0.509（r＝0.999 8），在0.062 4 ～12.48 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察 取同一份類脂囊泡混懸液，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 為1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 為0.49%，表明溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.062 4、1.248、12.48 μg/mL 對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 分別為0.97%、0.28%、0.24%，表明儀器精密度良好。取9 份脂囊泡混懸液，每份0.5 mL，置于100 mL 量瓶中，分為低、中、高3 組，每組3 份，分別加入貯備液0.8、1.6、2.4 mL，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為101.04% （RSD ＝1.07%）、100.23% （RSD＝0.65%）、99.01% （RSD＝0.90%）。

2.2 類脂囊泡制備 采用薄膜分散法［16-17］。固定冬凌草甲素用量20 mg，稱取處方量膽固醇、司盤至圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷，45 ℃水浴磁力攪拌溶解并減壓旋蒸除去二氯甲烷，在容器內(nèi)壁形成一層均勻薄膜，加入一定pH值磷酸鹽緩沖液25 mL，45 ℃水浴磁力攪拌水化一定時(shí)間，超聲（功率200 W） 處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取類脂囊泡混懸液1 mL 至超濾管中 （截留分子量10 000 Da），10 000 r/min 離心20 min，測(cè)定冬凌草甲素游離量（m游離）； 另取1 mL，測(cè)定冬凌草甲素總含量（m總）； 另取1 mL，在-50 ℃下預(yù)凍2 d 后真空凍干，測(cè)定粉末質(zhì)量（m0），計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率＝ ［（m總-m游離） /m總］ ×100%、載藥量＝ ［（m總-m游離） /m0］ ×100%。

2.4 粒徑、PDI、Zeta 電位測(cè)定 取類脂囊泡混懸液適量，蒸餾水稀釋50 倍，常溫下采用粒度分析儀測(cè)定（粒徑入射角165°），平行3 份，取平均值。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 司盤種類 固定冬凌草甲素用量20 mg，囊材（司盤＋膽固醇） 總用量400 mg，司盤與膽固醇用量1 ∶1，水相pH 值6.0，考察司盤種類對(duì)包封率、載藥量的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，司盤80 制得的類脂囊泡包封率、載藥量最低，可能是由于它含不飽和長(zhǎng)鏈，可使長(zhǎng)鏈彎曲變性，導(dǎo)致類脂囊泡通透性增加，藥物容易泄露［19］； 司盤20、40、60 均為飽和脂肪鏈，其中司盤60 脂肪鏈最長(zhǎng)，可更有效地阻止藥物泄露［19］，使得包封率、載藥量最高，故選擇司盤60 制備類脂囊泡。

圖1 司盤種類對(duì)包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.2 司盤60 與膽固醇比例 固定冬凌草甲素用量20 mg，囊材總用量400 mg，水相pH 值6.0，考察司盤60與膽固醇比例對(duì)包封率、載藥量的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著膽固醇用量增加包封率、載藥量均先升后降，當(dāng)司盤60 與膽固醇比例為1 ∶1.5 時(shí)兩者最高； 雖然膽固醇可賦予囊泡一定的剛性［17］，但其比例較小時(shí)囊泡流動(dòng)性較強(qiáng)，導(dǎo)致藥物容易泄露，而用量過大時(shí)膜曲率變小，導(dǎo)致囊泡總表面積、容納藥物空間更小，使得兩者均降低，故選擇1 ∶1.5 作為司盤60 與膽固醇比例。

圖2 司盤60 與膽固醇比例對(duì)包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.3 囊材用量 固定冬凌草甲素用量20 mg，司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5，水相pH 值6.0，考察囊材用量對(duì)包封率、載藥量的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，隨著囊材用量增加包封率先升后趨穩(wěn)，載藥量先升后降，為400 mg 時(shí)兩者最高，故選擇400 mg 作為囊材用量。

圖3 囊材用量對(duì)包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.4 水相pH 值 固定冬凌草甲素用量20 mg，司盤60與膽固醇比例1 ∶1.5，囊材用量400 mg，考察水相pH 值對(duì)包封率、載藥量的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，水相pH 值較低時(shí)包封率、載藥量均較低，為7.4 時(shí)兩者均較高，可能是由于水相pH 值較低時(shí)原料藥溶解度更大［9］，更容易進(jìn)入水相［19］，故選擇7.4 作為水相pH 值。

圖4 水相pH 值對(duì)包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) “2.5” 項(xiàng)下結(jié)果顯示，最優(yōu)處方為冬凌草甲素用量20 mg，司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5，囊材用量400 mg，水相pH 值7.4。按上述優(yōu)化處方制備3 批樣品，測(cè)得平均包封率為82.94%，載藥量為3.96%，粒徑為243.87 nm，PDI 為0.145 （圖5），Zeta 電位為-34.80 mV（圖6），表明類脂囊泡表面帶負(fù)電荷，并且絕對(duì)值大于30 mV，即存在較強(qiáng)的靜電排斥力，有利于增加類脂囊泡穩(wěn)定性。

圖5 冬凌草甲素類脂囊泡粒徑分布

圖6 冬凌草甲素類脂囊泡Zeta 電位

2.7 凍干粉制備 將海藻糖與甘露醇按1 ∶1 比例混勻，作為凍干保護(hù)劑。取類脂囊泡混懸液20 mL，加入3%凍干保護(hù)劑振蕩溶解，分成若干份后置于西林瓶中，在-50 ℃下預(yù)凍2 d，置于-40 ℃冷凍干燥機(jī)中凍干1 d，取出，即得。另外，類脂囊泡混懸液加入蒸餾水稀釋30 倍后可見藍(lán)色乳光，而其凍干粉外觀飽滿，無色差。

2.8 穩(wěn)定性研究 取類脂囊泡凍干粉適量，密封后置于溫度30 ℃、相對(duì)濕度65% 的恒溫恒濕箱中，于0、10、15、30、60 d取樣，測(cè)定包封率、粒徑，平行3 次，結(jié)果見圖7。由此可知，凍干粉包封率、粒徑分別為80.41%、276.13 nm；放置60 d后前者降至78.02%，后者升至290.38 nm，即變化程度不明顯，表明其穩(wěn)定性良好。

圖7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.9 體外釋藥研究 取類脂囊泡凍干粉適量（冬凌草甲素含量均為20 mg），加入5 mL 模擬胃液，置于活化透析袋（平均截留分子量10 000 Da） 中扎緊，設(shè)定釋放介質(zhì)為900 mL 模擬胃液，轉(zhuǎn)速為100 r/min，待介質(zhì)溫度恒定至（37±1）℃后于0、10、15、30、45、60、75、90、120 min各取樣3 mL，并補(bǔ)加3 mL 模擬胃液，而原料藥粉末直接置于釋藥介質(zhì)中，6 000 r/min 離心15 min，測(cè)定冬凌草甲素含量； 同法測(cè)定素類脂囊泡凍干粉在模擬腸液中的釋藥情況，取樣時(shí)間點(diǎn)為0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h，結(jié)果見圖8～9。由此可知，類脂囊泡在模擬胃液、模擬腸液中的累積釋放度均高于原料藥［20］，可能是由于后者在酸性、堿性介質(zhì)中容易降解所致［10］。

圖8 模擬胃液中冬凌草甲素體外釋藥曲線（n＝6）

圖9 模擬腸液中冬凌草甲素體外釋藥曲線（n＝6）

2.10 溶解度測(cè)定 取過量冬凌草甲素、物理混合物（配比同類脂囊泡凍干粉）、類脂囊泡凍干粉適量，置于蒸餾水中，超聲（功率200 W） 處理30 min 得混懸液，37 ℃水浴中磁力攪拌2 d，取混懸液，12 500 r/min 離心20 min［21］，取上清液，測(cè)定溶解度，結(jié)果分別為0.64、0.78、4.06 g/L，即原料藥在類脂囊泡中的溶解度增加至6.34 倍。

2.11 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.11.1 分組、給藥與采血 12 只大鼠隨機(jī)分為2 組，每組6 只，分別灌胃給予冬凌草甲素（0.5%CMC-Na 溶液制備，3 mg/mL） 及其類脂囊泡（蒸餾水制備，3 mg/mL），劑量均為20 mg/kg，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、4、6、8、12 h 眼眶取血各約250 μL，置于肝素化離心管中，立即振蕩混勻以防止溶血，3 500 r/min 離心2 min，密封后冷凍保存。

2.11.2 血漿樣品處理 將血漿樣品在37 ℃水浴中復(fù)溶，取100 μL，加入2 mL 甲醇密封，渦旋5 min，10 000 r/min離心5 min 沉淀蛋白，取上層有機(jī)相，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL 甲醇渦旋復(fù)溶。

2.11.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液適量，甲醇制成1 600、800、400、200、100、50 ng/mL，分別取100 μL，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL 空白血漿渦旋復(fù)溶，即得血漿對(duì)照品溶液，按“2.11.2” 項(xiàng)下方法處理，在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.161X＋141.7 （r＝0.994 6），在50～1 600 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.11.4 方法學(xué)考察 取100 μL 空白血漿，按“2.11.2”項(xiàng)下方法處理，另取灌胃給藥12 h 后血漿樣品、血漿對(duì)照品溶液（50 ng/mL） 適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖10，可知雜質(zhì)未干擾測(cè)定，表明該方法專屬性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為7.14%、5.32%、6.08%，表明該方法日內(nèi)精密度良好； 同法連續(xù)測(cè)定6 d，每天1次，測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為8.04%、5.17%、7.44%，表明該方法日間精密度良好。取400 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量，于0、2、4、8、12、18 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 為6.69%，表明樣品在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定3 次，測(cè)得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為91.60% （RSD ＝7.67%）、96.07% （RSD ＝6.98%）、93.94% （RSD＝7.67%）。

圖10 冬凌草甲素HPLC 色譜圖

2.11.5 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見圖11，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。由此可知，與原料藥比較，納米囊泡tmax、t1/2延長(zhǎng) （P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高 （P＜0.01），相對(duì)生物利用度增加至5.38 倍。

表1 冬凌草甲素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

表1 冬凌草甲素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

注： 與冬凌草甲素比較，**P＜0.01。

參數(shù)單位冬凌草甲素冬凌草甲素類脂囊泡tmaxh0.77±0.342.07±0.64**Cmaxng·mL-1337.28±71.691 216.41±337.83**t1/2h2.30±0.595.78±0.94**AUC0～tng·mL-1·h 975.16±109.53 5 241.83±712.06**AUC0～∞ng·mL-1·h 1 013.27±115.90 5 460.22±811.74**

圖11 冬凌草甲素血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）

3 討論與結(jié)論

體外釋藥研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素在模擬胃腸液中的累積釋放度均出現(xiàn)不同程度的降低情況［10，15］，表明其穩(wěn)定性存在問題； 制成類脂囊泡后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其累積釋放度均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，故推測(cè)該劑型將原料藥包裹于內(nèi)部時(shí)，可降低水相對(duì)其穩(wěn)定性的影響，而且在不同條件下的藥物累積釋放度均明顯更高，從而增加了藥物溶出。前期報(bào)道，冬凌草甲素類脂囊泡在普通緩沖液中的釋藥情況與在模擬胃腸液中存在一定差別，這可能是由于后者中的胰蛋白酶脂解會(huì)對(duì)脂類囊泡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［22］，加速了藥物釋放，可更好地反映體內(nèi)實(shí)際情況［23］。

體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素類脂囊泡tmax延后，可能是由于原料藥從類脂囊泡中釋放出去時(shí)需克服較大的阻力，從而表現(xiàn)出一定的緩釋作用；t1/2延長(zhǎng)，除了與該制劑緩釋作用有關(guān)外［24］，可能還由于類脂囊泡增加了原料藥在胃腸道的穩(wěn)定性［20］，降低了降解率，增加了后期進(jìn)入血液循環(huán)的量；Cmax、相對(duì)生物利用度分別增加至3.58、5.38 倍，可能是由于類脂囊泡增加了原料藥溶解度、溶出度，降低了后者降解率，解決了其口服吸收的缺陷［17，20，23］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備了冬凌草甲素類脂囊泡，可為充分發(fā)揮該成分藥理活性奠定了基礎(chǔ)，今后將對(duì)其安全性、藥效等方面展開研究。