• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    冬凌草甲素類脂囊泡制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

    2023-10-30 06:12:14王美麗方曉東王曉靜豆銀霞
    中成藥 2023年10期
    關(guān)鍵詞:冬凌草甲素水相

    王美麗,唐 靜,方曉東,王曉靜,豆銀霞

    (1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,河南 鄭州 450064; 2.河南大學(xué),河南 開封 475004)

    冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的一種二萜類化合物,具有清熱解毒、心血管保護(hù)、降血壓、抑菌、止痛、增強(qiáng)免疫等活性[1-4],在卵巢癌[5-6]、乳腺癌[6-7]、子宮內(nèi)膜癌[8]等婦科腫瘤方面也具有較好的治療作用,還可用于婦科消炎等[1],具有重大開發(fā)價(jià)值。該成分在37 ℃水中的溶解度為0.64 g/L,容易導(dǎo)致藥物溶出受限; 表觀油水分配系數(shù)lgP為1.66[9],在水中不穩(wěn)定,容易發(fā)生降解[10]; 絕對(duì)口服生物利用度僅約為10%[11],目前已有膠束[12]、自微乳[13]、固體分散體[14]、磷脂復(fù)合物[14]、固體脂質(zhì)納米粒[15]等相關(guān)報(bào)道。

    類脂囊泡一般由非離子表面活性劑在水中自組裝形成,為增加其機(jī)械強(qiáng)度,往往在處方中加入一定量的膽固醇[16-17],可包載脂溶性、水溶性藥物,其結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似,但類脂囊泡處方中不含易氧化的磷脂或磷脂衍生物類物質(zhì),具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性[17-18],并且其囊材廉價(jià)易得。因此,本實(shí)驗(yàn)制備冬凌草甲素類脂囊泡,并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué),以期為該相關(guān)藥物研發(fā)提供一種新型給藥制劑。

    1 材料

    Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);XWD-08T 型超聲儀(深圳市鑫旺達(dá)超聲波自動(dòng)化設(shè)備有限公司); BSA224S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]; JB-4 型恒溫磁力攪拌器(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司); MDS-2008DS 型溶出儀(寧波新芝藥檢科技有限公司); Master-sizer 型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司); Venus-3 型真空凍干機(jī)(杭州富瑞捷科技有限公司)。

    冬凌草甲素對(duì)照品(批號(hào)111721-211127,純度99.1%,中國食品藥品檢定研究院); 冬凌草甲素原料藥(批號(hào)k28473,純度98%,西安開來生物工程有限公司)。司盤-60 (批號(hào)191210,江蘇采薇生物科技有限公司); 海藻糖(批號(hào)190210,南京松冠生物科技有限公司); 膽固醇(批號(hào)20200517,西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)。模擬胃液(含胃蛋白酶,批號(hào)20220816)、模擬腸液(含胰蛋白酶,批號(hào)20220915) (東莞市信恒科技有限公司)。甘露醇(批號(hào)20191105,上??道噬锟萍加邢薰荆?蔗糖(批號(hào)20191008,南京松冠生物科技有限公司)。

    SD 大鼠,雌雄兼具,體質(zhì)量(220±20) g,購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (豫) 2020-0001。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 冬凌草甲素含量測(cè)定 采用HPLC 法。

    2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm),測(cè)定血藥濃度時(shí)串聯(lián)預(yù)柱(4 mm×4 mm,5 μm); 流動(dòng)相甲醇-水(60 ∶40); 體積流量1 mL/min;柱溫35 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm; 進(jìn)樣量10 μL。

    2.1.2 供試品溶液制備 取類脂囊泡混懸液1 mL,置于100 mL 量瓶中,加入50 mL 甲醇超聲處理6 min,甲醇稀釋定容,取5 mL 至10 mL 量瓶中,流動(dòng)相定容,即得。

    2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取冬凌草甲素對(duì)照品12.48 mg,置于50 mL 量瓶中,甲醇溶解,制成249.6 μg/mL貯備液,流動(dòng)相依次稀釋至12.48、6.24、1.248、0.624、0.124 8、0.062 4 μg/mL,即得對(duì)照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=23.117X-0.509(r=0.999 8),在0.062 4 ~12.48 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.1.4 方法學(xué)考察 取同一份類脂囊泡混懸液,按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 為1.40%,表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量,于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 為0.49%,表明溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.062 4、1.248、12.48 μg/mL 對(duì)照品溶液適量,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得冬凌草甲素含量RSD 分別為0.97%、0.28%、0.24%,表明儀器精密度良好。取9 份脂囊泡混懸液,每份0.5 mL,置于100 mL 量瓶中,分為低、中、高3 組,每組3 份,分別加入貯備液0.8、1.6、2.4 mL,按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為101.04% (RSD =1.07%)、100.23% (RSD=0.65%)、99.01% (RSD=0.90%)。

    2.2 類脂囊泡制備 采用薄膜分散法[16-17]。固定冬凌草甲素用量20 mg,稱取處方量膽固醇、司盤至圓底燒瓶中,加入適量二氯甲烷,45 ℃水浴磁力攪拌溶解并減壓旋蒸除去二氯甲烷,在容器內(nèi)壁形成一層均勻薄膜,加入一定pH值磷酸鹽緩沖液25 mL,45 ℃水浴磁力攪拌水化一定時(shí)間,超聲(功率200 W) 處理15 min,0.45 μm 微孔濾膜過濾,即得。

    2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取類脂囊泡混懸液1 mL 至超濾管中 (截留分子量10 000 Da),10 000 r/min 離心20 min,測(cè)定冬凌草甲素游離量(m游離); 另取1 mL,測(cè)定冬凌草甲素總含量(m總); 另取1 mL,在-50 ℃下預(yù)凍2 d 后真空凍干,測(cè)定粉末質(zhì)量(m0),計(jì)算包封率、載藥量,公式分別為包封率= [(m總-m游離) /m總] ×100%、載藥量= [(m總-m游離) /m0] ×100%。

    2.4 粒徑、PDI、Zeta 電位測(cè)定 取類脂囊泡混懸液適量,蒸餾水稀釋50 倍,常溫下采用粒度分析儀測(cè)定(粒徑入射角165°),平行3 份,取平均值。

    2.5 單因素試驗(yàn)

    2.5.1 司盤種類 固定冬凌草甲素用量20 mg,囊材(司盤+膽固醇) 總用量400 mg,司盤與膽固醇用量1 ∶1,水相pH 值6.0,考察司盤種類對(duì)包封率、載藥量的影響,結(jié)果見圖1。由此可知,司盤80 制得的類脂囊泡包封率、載藥量最低,可能是由于它含不飽和長(zhǎng)鏈,可使長(zhǎng)鏈彎曲變性,導(dǎo)致類脂囊泡通透性增加,藥物容易泄露[19]; 司盤20、40、60 均為飽和脂肪鏈,其中司盤60 脂肪鏈最長(zhǎng),可更有效地阻止藥物泄露[19],使得包封率、載藥量最高,故選擇司盤60 制備類脂囊泡。

    圖1 司盤種類對(duì)包封率、載藥量的影響(n=3)

    2.5.2 司盤60 與膽固醇比例 固定冬凌草甲素用量20 mg,囊材總用量400 mg,水相pH 值6.0,考察司盤60與膽固醇比例對(duì)包封率、載藥量的影響,結(jié)果見圖2。由此可知,隨著膽固醇用量增加包封率、載藥量均先升后降,當(dāng)司盤60 與膽固醇比例為1 ∶1.5 時(shí)兩者最高; 雖然膽固醇可賦予囊泡一定的剛性[17],但其比例較小時(shí)囊泡流動(dòng)性較強(qiáng),導(dǎo)致藥物容易泄露,而用量過大時(shí)膜曲率變小,導(dǎo)致囊泡總表面積、容納藥物空間更小,使得兩者均降低,故選擇1 ∶1.5 作為司盤60 與膽固醇比例。

    圖2 司盤60 與膽固醇比例對(duì)包封率、載藥量的影響(n=3)

    2.5.3 囊材用量 固定冬凌草甲素用量20 mg,司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5,水相pH 值6.0,考察囊材用量對(duì)包封率、載藥量的影響,結(jié)果見圖3。由此可知,隨著囊材用量增加包封率先升后趨穩(wěn),載藥量先升后降,為400 mg 時(shí)兩者最高,故選擇400 mg 作為囊材用量。

    圖3 囊材用量對(duì)包封率、載藥量的影響(n=3)

    2.5.4 水相pH 值 固定冬凌草甲素用量20 mg,司盤60與膽固醇比例1 ∶1.5,囊材用量400 mg,考察水相pH 值對(duì)包封率、載藥量的影響,結(jié)果見圖4。由此可知,水相pH 值較低時(shí)包封率、載藥量均較低,為7.4 時(shí)兩者均較高,可能是由于水相pH 值較低時(shí)原料藥溶解度更大[9],更容易進(jìn)入水相[19],故選擇7.4 作為水相pH 值。

    圖4 水相pH 值對(duì)包封率、載藥量的影響(n=3)

    2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) “2.5” 項(xiàng)下結(jié)果顯示,最優(yōu)處方為冬凌草甲素用量20 mg,司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5,囊材用量400 mg,水相pH 值7.4。按上述優(yōu)化處方制備3 批樣品,測(cè)得平均包封率為82.94%,載藥量為3.96%,粒徑為243.87 nm,PDI 為0.145 (圖5),Zeta 電位為-34.80 mV(圖6),表明類脂囊泡表面帶負(fù)電荷,并且絕對(duì)值大于30 mV,即存在較強(qiáng)的靜電排斥力,有利于增加類脂囊泡穩(wěn)定性。

    圖5 冬凌草甲素類脂囊泡粒徑分布

    圖6 冬凌草甲素類脂囊泡Zeta 電位

    2.7 凍干粉制備 將海藻糖與甘露醇按1 ∶1 比例混勻,作為凍干保護(hù)劑。取類脂囊泡混懸液20 mL,加入3%凍干保護(hù)劑振蕩溶解,分成若干份后置于西林瓶中,在-50 ℃下預(yù)凍2 d,置于-40 ℃冷凍干燥機(jī)中凍干1 d,取出,即得。另外,類脂囊泡混懸液加入蒸餾水稀釋30 倍后可見藍(lán)色乳光,而其凍干粉外觀飽滿,無色差。

    2.8 穩(wěn)定性研究 取類脂囊泡凍干粉適量,密封后置于溫度30 ℃、相對(duì)濕度65% 的恒溫恒濕箱中,于0、10、15、30、60 d取樣,測(cè)定包封率、粒徑,平行3 次,結(jié)果見圖7。由此可知,凍干粉包封率、粒徑分別為80.41%、276.13 nm;放置60 d后前者降至78.02%,后者升至290.38 nm,即變化程度不明顯,表明其穩(wěn)定性良好。

    圖7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

    2.9 體外釋藥研究 取類脂囊泡凍干粉適量(冬凌草甲素含量均為20 mg),加入5 mL 模擬胃液,置于活化透析袋(平均截留分子量10 000 Da) 中扎緊,設(shè)定釋放介質(zhì)為900 mL 模擬胃液,轉(zhuǎn)速為100 r/min,待介質(zhì)溫度恒定至(37±1)℃后于0、10、15、30、45、60、75、90、120 min各取樣3 mL,并補(bǔ)加3 mL 模擬胃液,而原料藥粉末直接置于釋藥介質(zhì)中,6 000 r/min 離心15 min,測(cè)定冬凌草甲素含量; 同法測(cè)定素類脂囊泡凍干粉在模擬腸液中的釋藥情況,取樣時(shí)間點(diǎn)為0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h,結(jié)果見圖8~9。由此可知,類脂囊泡在模擬胃液、模擬腸液中的累積釋放度均高于原料藥[20],可能是由于后者在酸性、堿性介質(zhì)中容易降解所致[10]。

    圖8 模擬胃液中冬凌草甲素體外釋藥曲線(n=6)

    圖9 模擬腸液中冬凌草甲素體外釋藥曲線(n=6)

    2.10 溶解度測(cè)定 取過量冬凌草甲素、物理混合物(配比同類脂囊泡凍干粉)、類脂囊泡凍干粉適量,置于蒸餾水中,超聲(功率200 W) 處理30 min 得混懸液,37 ℃水浴中磁力攪拌2 d,取混懸液,12 500 r/min 離心20 min[21],取上清液,測(cè)定溶解度,結(jié)果分別為0.64、0.78、4.06 g/L,即原料藥在類脂囊泡中的溶解度增加至6.34 倍。

    2.11 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

    2.11.1 分組、給藥與采血 12 只大鼠隨機(jī)分為2 組,每組6 只,分別灌胃給予冬凌草甲素(0.5%CMC-Na 溶液制備,3 mg/mL) 及其類脂囊泡(蒸餾水制備,3 mg/mL),劑量均為20 mg/kg,于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、4、6、8、12 h 眼眶取血各約250 μL,置于肝素化離心管中,立即振蕩混勻以防止溶血,3 500 r/min 離心2 min,密封后冷凍保存。

    2.11.2 血漿樣品處理 將血漿樣品在37 ℃水浴中復(fù)溶,取100 μL,加入2 mL 甲醇密封,渦旋5 min,10 000 r/min離心5 min 沉淀蛋白,取上層有機(jī)相,40 ℃氮?dú)獯蹈?,?00 μL 甲醇渦旋復(fù)溶。

    2.11.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液適量,甲醇制成1 600、800、400、200、100、50 ng/mL,分別取100 μL,40 ℃氮?dú)獯蹈?,?00 μL 空白血漿渦旋復(fù)溶,即得血漿對(duì)照品溶液,按“2.11.2” 項(xiàng)下方法處理,在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積(Y) 對(duì)其質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=1.161X+141.7 (r=0.994 6),在50~1 600 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.11.4 方法學(xué)考察 取100 μL 空白血漿,按“2.11.2”項(xiàng)下方法處理,另取灌胃給藥12 h 后血漿樣品、血漿對(duì)照品溶液(50 ng/mL) 適量,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖10,可知雜質(zhì)未干擾測(cè)定,表明該方法專屬性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量,同一天內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為7.14%、5.32%、6.08%,表明該方法日內(nèi)精密度良好; 同法連續(xù)測(cè)定6 d,每天1次,測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為8.04%、5.17%、7.44%,表明該方法日間精密度良好。取400 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量,于0、2、4、8、12、18 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得冬凌草甲素峰面積RSD 為6.69%,表明樣品在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定3 次,測(cè)得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為91.60% (RSD =7.67%)、96.07% (RSD =6.98%)、93.94% (RSD=7.67%)。

    圖10 冬凌草甲素HPLC 色譜圖

    2.11.5 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見圖11,主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。由此可知,與原料藥比較,納米囊泡tmax、t1/2延長(zhǎng) (P<0.01),Cmax、AUC0~t、AUC0~∞升高 (P<0.01),相對(duì)生物利用度增加至5.38 倍。

    表1 冬凌草甲素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s,n=6)

    表1 冬凌草甲素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s,n=6)

    注: 與冬凌草甲素比較,**P<0.01。

    參數(shù)單位冬凌草甲素冬凌草甲素類脂囊泡tmaxh0.77±0.342.07±0.64**Cmaxng·mL-1337.28±71.691 216.41±337.83**t1/2h2.30±0.595.78±0.94**AUC0~tng·mL-1·h 975.16±109.53 5 241.83±712.06**AUC0~∞ng·mL-1·h 1 013.27±115.90 5 460.22±811.74**

    圖11 冬凌草甲素血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)

    3 討論與結(jié)論

    體外釋藥研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素在模擬胃腸液中的累積釋放度均出現(xiàn)不同程度的降低情況[10,15],表明其穩(wěn)定性存在問題; 制成類脂囊泡后,隨著時(shí)間延長(zhǎng)其累積釋放度均呈現(xiàn)升高趨勢(shì),故推測(cè)該劑型將原料藥包裹于內(nèi)部時(shí),可降低水相對(duì)其穩(wěn)定性的影響,而且在不同條件下的藥物累積釋放度均明顯更高,從而增加了藥物溶出。前期報(bào)道,冬凌草甲素類脂囊泡在普通緩沖液中的釋藥情況與在模擬胃腸液中存在一定差別,這可能是由于后者中的胰蛋白酶脂解會(huì)對(duì)脂類囊泡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[22],加速了藥物釋放,可更好地反映體內(nèi)實(shí)際情況[23]。

    體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素類脂囊泡tmax延后,可能是由于原料藥從類脂囊泡中釋放出去時(shí)需克服較大的阻力,從而表現(xiàn)出一定的緩釋作用;t1/2延長(zhǎng),除了與該制劑緩釋作用有關(guān)外[24],可能還由于類脂囊泡增加了原料藥在胃腸道的穩(wěn)定性[20],降低了降解率,增加了后期進(jìn)入血液循環(huán)的量;Cmax、相對(duì)生物利用度分別增加至3.58、5.38 倍,可能是由于類脂囊泡增加了原料藥溶解度、溶出度,降低了后者降解率,解決了其口服吸收的缺陷[17,20,23]。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)制備了冬凌草甲素類脂囊泡,可為充分發(fā)揮該成分藥理活性奠定了基礎(chǔ),今后將對(duì)其安全性、藥效等方面展開研究。

    猜你喜歡
    冬凌草甲素水相
    海上中高滲透率砂巖油藏油水相滲曲線合理性綜合分析技術(shù)
    更 正
    燈盞甲素在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的PK-PD結(jié)合模型研究
    地下水流速與介質(zhì)非均質(zhì)性對(duì)于重非水相流體運(yùn)移的影響
    冬凌草甲素納米結(jié)晶的制備及其體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響
    分析漢防己甲素治療塵肺的療效及對(duì)免疫功能的影響
    冬凌草茶中多糖、總黃酮及冬凌草甲素浸出特性研究
    冬凌草適宜采收期的研究△
    連續(xù)4周口服雷公藤甲素對(duì)大鼠血紅素加氧酶的影響
    冬凌草活性部位逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR細(xì)胞多藥耐藥性的體外研究
    国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| av天堂久久9| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久人人人人人| 欧美成人午夜免费资源| 精品视频人人做人人爽| 日本-黄色视频高清免费观看| 少妇人妻 视频| 久久久国产一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲精品日本国产第一区| av黄色大香蕉| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩大片免费观看网站| 日日爽夜夜爽网站| 国产乱人偷精品视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 国产成人精品在线电影| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久国产一区二区| videosex国产| 欧美激情 高清一区二区三区| 九九在线视频观看精品| www.色视频.com| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费黄网站久久成人精品| 成年动漫av网址| 丝袜美足系列| 国内精品宾馆在线| 99热网站在线观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲国产精品一区三区| 精品国产国语对白av| 成年av动漫网址| 新久久久久国产一级毛片| 热99久久久久精品小说推荐| av在线老鸭窝| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 一级毛片电影观看| 一级毛片我不卡| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产看品久久| freevideosex欧美| 国产精品三级大全| 国产男女内射视频| 青春草国产在线视频| 自线自在国产av| 蜜桃在线观看..| 高清视频免费观看一区二区| 中文天堂在线官网| 精品第一国产精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲精品乱久久久久久| 最近手机中文字幕大全| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 成人国产麻豆网| xxx大片免费视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美国产精品一级二级三级| 九色成人免费人妻av| 综合色丁香网| 久久精品夜色国产| 成人无遮挡网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久久久人妻| 少妇精品久久久久久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成人影院久久| 丰满少妇做爰视频| 亚洲国产精品国产精品| 国产毛片在线视频| 亚洲精品自拍成人| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品嫩草影院av在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 丝瓜视频免费看黄片| 热re99久久精品国产66热6| 青春草视频在线免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 美女大奶头黄色视频| av福利片在线| 中国国产av一级| 国产精品国产三级专区第一集| 成人国语在线视频| 天美传媒精品一区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产亚洲精品久久久com| tube8黄色片| av电影中文网址| 青春草国产在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产 精品1| 久久久久久久大尺度免费视频| 两个人免费观看高清视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 成年女人在线观看亚洲视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美日韩成人在线一区二区| 精品少妇内射三级| 日韩一区二区视频免费看| 国产探花极品一区二区| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品视频人人做人人爽| 国产xxxxx性猛交| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久99精品国语久久久| 欧美日韩视频精品一区| 搡老乐熟女国产| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产1区2区3区精品| av线在线观看网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 麻豆乱淫一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 热99久久久久精品小说推荐| 成人二区视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线天堂最新版资源| 18+在线观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 在线观看免费高清a一片| 国产在视频线精品| 飞空精品影院首页| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成77777在线视频| 中国三级夫妇交换| 国产福利在线免费观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 精品久久久精品久久久| 热99久久久久精品小说推荐| av.在线天堂| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲中文av在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 18在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产精品免费大片| 丝袜脚勾引网站| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久精品94久久精品| 久久午夜福利片| 免费看av在线观看网站| 内地一区二区视频在线| 国产精品 国内视频| 美女主播在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕制服av| 高清毛片免费看| 男人添女人高潮全过程视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 天堂8中文在线网| 91在线精品国自产拍蜜月| 青春草国产在线视频| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最近中文字幕高清免费大全6| 在线 av 中文字幕| 一级爰片在线观看| 日本色播在线视频| 久久久久精品性色| 久热这里只有精品99| 久久精品人人爽人人爽视色| 激情五月婷婷亚洲| 伊人久久国产一区二区| 97在线人人人人妻| 少妇高潮的动态图| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品无大码| 精品久久久精品久久久| 日韩视频在线欧美| 日本色播在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 伦精品一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美+日韩+精品| 99久久人妻综合| 亚洲精品一二三| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 免费看光身美女| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产视频首页在线观看| 婷婷色av中文字幕| 男的添女的下面高潮视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 观看美女的网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 丝袜脚勾引网站| 老司机影院成人| 免费看光身美女| 在线看a的网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 熟女电影av网| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 毛片一级片免费看久久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 色网站视频免费| 亚洲精品视频女| 夫妻午夜视频| 热re99久久精品国产66热6| 妹子高潮喷水视频| 色94色欧美一区二区| 九九在线视频观看精品| 黑人高潮一二区| 亚洲欧洲日产国产| 欧美丝袜亚洲另类| 伊人亚洲综合成人网| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 精品午夜福利在线看| 黄片无遮挡物在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美精品av麻豆av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产亚洲最大av| 亚洲伊人色综图| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美97在线视频| 国产精品不卡视频一区二区| av免费观看日本| 色视频在线一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品一,二区| 国产免费福利视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 丝袜脚勾引网站| 国产成人aa在线观看| 日韩视频在线欧美| 亚洲综合色惰| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 2018国产大陆天天弄谢| av在线app专区| 欧美精品一区二区大全| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲成色77777| 女人精品久久久久毛片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 免费看光身美女| av有码第一页| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美日韩av久久| 性色av一级| 99国产精品免费福利视频| 少妇人妻久久综合中文| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产精品999| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 人妻系列 视频| 日本91视频免费播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 五月伊人婷婷丁香| 一区二区av电影网| 亚洲国产色片| 久久精品国产亚洲av天美| 岛国毛片在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 最后的刺客免费高清国语| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 永久网站在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一级毛片我不卡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 男女下面插进去视频免费观看 | 久久精品夜色国产| 少妇高潮的动态图| 欧美最新免费一区二区三区| 大码成人一级视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产毛片在线视频| 草草在线视频免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 在线观看一区二区三区激情| 波多野结衣一区麻豆| 性色avwww在线观看| 国产淫语在线视频| 国产精品人妻久久久久久| 久久这里只有精品19| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男人添女人高潮全过程视频| 少妇高潮的动态图| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 伊人久久国产一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美性感艳星| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩av免费高清视频| 天天影视国产精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 一区二区三区四区激情视频| 青春草视频在线免费观看| 香蕉国产在线看| 美国免费a级毛片| 18+在线观看网站| 国产xxxxx性猛交| 久久久久久伊人网av| 少妇 在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 在线观看免费高清a一片| 精品一区二区三卡| 人人妻人人澡人人看| 春色校园在线视频观看| 国产伦理片在线播放av一区| 街头女战士在线观看网站| 久久 成人 亚洲| 成年女人在线观看亚洲视频| av在线app专区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品久久久久久久性| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产高清国产精品国产三级| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 色94色欧美一区二区| 97在线视频观看| 亚洲av免费高清在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看人妻少妇| 国产有黄有色有爽视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 成人二区视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产又爽黄色视频| 少妇人妻 视频| av国产久精品久网站免费入址| 国产xxxxx性猛交| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美国产精品一级二级三级| 精品亚洲成国产av| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最后的刺客免费高清国语| 久久久欧美国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩一区二区视频免费看| www.av在线官网国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品一区蜜桃| 18在线观看网站| 国产免费视频播放在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 26uuu在线亚洲综合色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美+日韩+精品| 国产男人的电影天堂91| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产在线视频一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 2021少妇久久久久久久久久久| 伦精品一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久久久久久久免费av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男女午夜视频在线观看 | 超碰97精品在线观看| 免费看不卡的av| 夜夜爽夜夜爽视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国精品久久久久久国模美| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲成人av在线免费| 国产一区二区在线观看日韩| 精品久久蜜臀av无| 国产一区二区在线观看日韩| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大香蕉久久网| 亚洲av国产av综合av卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人aa在线观看| 日韩电影二区| 午夜福利,免费看| 中文欧美无线码| www.熟女人妻精品国产 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜免费鲁丝| 国产精品蜜桃在线观看| 一个人免费看片子| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲国产精品专区欧美| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品一区www在线观看| 久久狼人影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲欧美精品永久| av不卡在线播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲av成人精品一二三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 蜜桃在线观看..| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久午夜综合久久蜜桃| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久精品94久久精品| 午夜91福利影院| 久久av网站| 一级a做视频免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久ye,这里只有精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品视频女| 一本久久精品| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区三区乱码不卡18| 女人久久www免费人成看片| 成人漫画全彩无遮挡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄色一级大片看看| 97在线视频观看| 亚洲av免费高清在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美最新免费一区二区三区| 午夜福利视频精品| 不卡视频在线观看欧美| 中文字幕最新亚洲高清| 国产不卡av网站在线观看| 久久99精品国语久久久| 久久人人爽人人片av| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久青草综合色| 人妻少妇偷人精品九色| 一级爰片在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品一区www在线观看| 少妇的逼水好多| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 少妇精品久久久久久久| 亚洲国产精品专区欧美| 中文字幕免费在线视频6| 一区二区三区精品91| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品人妻偷拍中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 九九爱精品视频在线观看| 日本免费在线观看一区| 美女国产高潮福利片在线看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 午夜福利影视在线免费观看| 国产有黄有色有爽视频| 9191精品国产免费久久| 1024视频免费在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 一区二区av电影网| 欧美成人午夜免费资源| 夫妻午夜视频| 免费人成在线观看视频色| xxxhd国产人妻xxx| 免费看光身美女| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| a 毛片基地| 日韩中字成人| 老熟女久久久| www.熟女人妻精品国产 | 精品一区在线观看国产| 日韩电影二区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 久久久久久久精品精品| 亚洲性久久影院| 成人国产麻豆网| 中文字幕制服av| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久久久久久免费av| www.色视频.com| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一二三四在线观看免费中文在 | 亚洲第一av免费看| 欧美精品一区二区大全| 下体分泌物呈黄色| 制服丝袜香蕉在线| 成人国语在线视频| 晚上一个人看的免费电影| 午夜av观看不卡| 在线观看三级黄色| 日本欧美视频一区| 伦理电影大哥的女人| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲高清免费不卡视频| 伦理电影大哥的女人| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲久久久国产精品| 精品少妇久久久久久888优播| 日本黄色日本黄色录像| 天堂8中文在线网| 十八禁网站网址无遮挡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 老熟女久久久| 极品人妻少妇av视频| a级毛色黄片| 日本午夜av视频| 韩国av在线不卡| 91国产中文字幕| 久久精品久久久久久久性| 2022亚洲国产成人精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 黄色毛片三级朝国网站| 国产成人精品福利久久| 久久影院123| 久久av网站| 9色porny在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久久人人人人人| 一区二区av电影网| 亚洲少妇的诱惑av| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产老妇伦熟女老妇高清| 丝瓜视频免费看黄片| 大香蕉久久成人网| 久久久久网色| av有码第一页| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品一二三区在线看| 国产极品天堂在线| 18禁动态无遮挡网站| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 高清毛片免费看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲,欧美精品.| 观看美女的网站| 国产精品.久久久| 亚洲天堂av无毛| 欧美 日韩 精品 国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| av女优亚洲男人天堂| 日韩视频在线欧美| 久久青草综合色| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品国产国语对白av| 亚洲成人av在线免费| 一本色道久久久久久精品综合| 一个人免费看片子| 18在线观看网站| 国产精品久久久久久久久免| 草草在线视频免费看| 天堂俺去俺来也www色官网| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久成人av| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美日韩av久久| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲精品第二区| 全区人妻精品视频| 亚洲国产色片| 只有这里有精品99| 久久午夜福利片| 国产精品无大码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最新中文字幕久久久久| 亚洲图色成人|