八仙草化學成分及其抗病毒活性

曾 瑜，黃海寧，蔣 莉，唐炳蘭*，陳 路*

（1.柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545005； 2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程研究中心，廣西道地藥材高品質(zhì)形成與應(yīng)用重點實驗室，廣西 南寧 530023； 3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

八仙草為茜草科拉拉藤屬一年生草本植物，是我國民間常用中草藥，性微寒，味辛、苦，常用于治療脾家濕熱、諸經(jīng)客熱及各種淋證，近代也有醫(yī)家用八仙草治療腫瘤的報道［1-2］。禽流感H5N1 病毒可突破種間障礙，直接感染人類。自我國香港地區(qū)于1997 年首次報道了人感染H5N1 病毒死亡病例，截至2022 年6 月，世界衛(wèi)生組織共報道了全球人感染H5N1 病例865 例，死亡456 例，死亡率高達52.72%［3］。由于H5N1 病毒具有高致病性和高致死率等特點，且目前尚無特效藥，一直以來都受到醫(yī)學界的關(guān)注。從傳統(tǒng)中草藥發(fā)掘治療疾病的活性物質(zhì)是中藥新藥開發(fā)的重要手段，也是關(guān)鍵技術(shù)之一。研究發(fā)現(xiàn)，八仙草60% 乙醇提取物正丁醇部位具有較好的抗H5N1 病毒活性，當藥物濃度為75.5 μg/mL 時，抗病毒作用強度（CPE） 為“＋” （細胞病變程度＜25%）［4］。課題組在已有研究基礎(chǔ)上，對八仙草60%乙醇提取物的正丁醇部位的化學成分進行了更深入的研究，以期尋找到更多抗H5N1 病毒的活性物質(zhì)或先導化合物。

1 材料

1.1 儀器 Varian 600 核磁共振波譜儀 （美國Varian 公司）； LC-QTOF （美國Waters 公司）；XPR10/AC 電子天平、MP90 型熔點測定儀（瑞士梅特勒-托利多公司）； Sephadex LH-20 （瑞典Pharmacia 公司）； GF254 薄層色譜硅膠、柱層析硅膠 （青島海洋化工廠）； C18ODS-A （120 ?，50 μm，日本YMC 公司）； D101 大孔樹脂［西亞化學科技（山東） 有限公司］； RE-1002 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南省艾瑞德儀器設(shè)備有限公司）； KH19A 離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）； CO2孵箱（山東博科干細胞應(yīng)用研究院有限公司）； 101-0ABE 電熱鼓風干燥箱（上海坤天實驗室儀器有限公司）； DMEM 培養(yǎng)基 （美國Invitrogen 公司）；Model 680 酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 試劑與藥物 八仙草采自廣西南寧市郊，經(jīng)廣西藥用植物園藍鳴生教授鑒定為茜草科拉拉藤屬植物GaliumaparineL.的全草。利巴韋林（國藥集團容生制藥有限公司，批號21020520）； 新生胎牛血清 （批號2198245）、EDTA-胰蛋白酶 （批號2062476） （美國Gibco 公司）； 犬腎（MDCK） 細胞、A/Chicken/Hunan/12/2004 （H5N1） 標準病毒株（中國科學院武漢病毒研究所）。石油醚（60～90 ℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、MTT 溶液為分析純； 水為蒸餾水。

2 提取與分離

取八仙草50 kg，粉碎成粗粉，加入10 倍量60%乙醇冷浸提取3 次，每次3 d，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得總提物浸膏，適量水懸浮，分別用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得石油醚部位80 g、氯仿部位160 g、乙酸乙酯部位120 g、正丁醇部位250 g。

取正丁醇部位萃取物200 g，經(jīng)D101 大孔樹脂柱層析，依次用水、25%乙醇、50%乙醇、95%乙醇洗脫，減壓濃縮回收乙醇，得水部位65 g、25%乙醇部位18 g、50%乙醇部位75 g、95%乙醇部位26 g。取25%乙醇部位15 g，經(jīng)200～300 目硅膠柱分離，以氯仿-甲醇 （100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、6 ∶1、3 ∶1、0 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.A ～Fr.R。Fr.A （1.25 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇（100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、6 ∶1、3 ∶1、0 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.A-1 ～Fr.A-8。Fr.A-2 （0.28 g） 經(jīng)氯仿-甲醇（60 ∶1） 洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20柱純化，以氯仿-甲醇（20 ∶1） 洗脫，重結(jié)晶得化合物13（80 mg）。Fr.A-5（0.15 g） 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 柱純化，以氯仿-甲醇（5 ∶1），得化合物4 （28 mg）、6 （19 mg）。Fr.H （2.80 g）經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇 （100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、6 ∶1、3 ∶1、0 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.H-1～Fr.H-6。Fr.H-3 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 柱純化，以氯仿-甲醇（1 ∶1） 洗脫，得化合物1 （43 mg）、2 （25 mg）、5 （12 mg）。

取50%乙醇部位60 g，經(jīng)200 ～300 目硅膠柱分離，以氯仿-甲醇 （100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、6 ∶1、3 ∶1、0 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.Ⅰ～Fr.Ⅻ。Fr.Ⅱ（4.28 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇（100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、6 ∶1、3 ∶1、0 ∶1） 梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.Ⅱ-1～Fr.Ⅱ-9。Fr.Ⅱ-2 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 柱純化，以甲醇-水（4 ∶1）洗脫，得化合物7 （23 mg）、8 （21 mg）、9（15 mg）、14 （40 mg）。Fr.Ⅱ-5 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 柱純化，以甲醇-水（4 ∶1） 洗脫，得化合物3 （36 mg）、10 （18 mg）、11 （22 mg）。Fr.Ⅱ-8 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 柱純化，以甲醇-水（4 ∶1） 洗脫，得化合物12 （17 mg）、15 （29 mg）、16 （35 mg）、17 （13 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 黃色粉末（甲醇），分子式C15H10O7，熔點313 ～314 ℃，ESI-MSm/z： 303.2 ［M ＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz，DMSO-d6）δ： 6.21（1H，d，J＝2.5 Hz，H-6），6.42 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-8），6.91 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-5′），7.55 （1H，dd，J＝8.4，2.1 Hz，H-6′），7.69（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2′），12.51 （1H，brs，5-OH）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 147.9（C-2），136.0 （C-3），176.1 （C-4），160.9 （C-5），98.5 （C-6），164.1 （C-7），93.7 （C-8），156.5 （ C-9），102.8 （ C-10），121.9 （ C-1′），114.9 （ C-2′），147.0 （ C-3′），144.8 （ C-4′），115.9 （C-5′），119.8 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］ 報道基本一致，故鑒定為槲皮素。

化合物2： 黃色粉末（甲醇），分子式C15H10O6，熔點276 ～278 ℃，ESI-MSm/z： 287.2 ［M ＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz，DMSO-d6）δ： 6.22（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），6.47 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.89 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，5′），7.99 （2H，dd，J＝8.5 Hz，H-2′，6′），7.69 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-2′），12.50 （1H，brs，5-OH）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：147.1 （ C-2），135.9 （ C-3），176.2 （ C-4），161.0 （C-5），97.9 （C-6），164.2 （C-7），93.8（C-8），158.9 （C-9），102.9 （C-10），122.0 （C-1′），130.0 （ C-2′，6′），115.8 （ C-3′，5′），155.9 （C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］ 報道基本一致，故鑒定為山柰酚。

化合物3： 黃色粉末（甲醇），分子式C27H30O16，熔點 177 ～178 ℃，ESI-MSm/z： 609.5 ［MH］-。1H-NMR （ 600 MHz，DMSO-d6）δ： 0.97（3H，d，J＝6.5 Hz，Rha-CH3），4.37 （1H，s，Rha-H-1?），5.29 （1H，d，J＝6.5 Hz，H-1″），6.18 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），6.39 （1H，d，J＝1.7 Hz，H-8），6.81 （1H，d，J＝8.6 Hz，H-5′），7.51 （2H，d，J＝8.4 Hz，H-2′，6′）；13CNMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 156.7 （C-2），133.6 （C-3），177.6 （C-4），161.5 （C-5），98.8（C-6），164.3 （C-7），93.7 （C-8），156.8 （C-9），104.2 （C-10），121.7 （C-1′），115.4 （C-2′），144.9 （C-3′），148.9 （C-4′），116.5 （C-5′），121.5 （ C-6′），101.5 （ C-1″），70.8 （ C-2″），76.3 （C-3″），69.7 （C-4″），74.6 （C-5″），67.4 （ C-6″），101.2 （ C-1?），70.5 （ C-2?），69.8 （C-3?），72.1 （C-4?），70.2 （C-5?），17.8（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］ 報道基本一致，故鑒定為蘆丁。

化合物4： 淡黃色針狀結(jié)晶 （二氯甲烷-甲醇），分子式C16H12O7，熔點306～307 ℃，ESI-MSm/z： 315.3 ［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，DMSOd6）δ： 3.89 （3H，s，3′-OCH3），6.37 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-6），6.56 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-8），7.03 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-5′），7.81（1H，dd，J＝8.5，2.2 Hz，H-6′），7.87 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-2′），9.67，9.75，11.05，12.55（4H，brs，4′，3，7，5-OH）；13C-NMR （ 150 MHz，DMSO-d6）δ： 156.8 （C-2），132.5 （C-3），176.7 （ C-4），158.9 （ C-5），100.5 （ C-6），163.5 （C-7），96.7 （C-8），160.9 （C-9），106.7（C-10），123.1 （C-1′），115.0 （C-2′），148.9（C-3′），152.1 （ C-4′），116.7 （ C-5′），120.9（C-6′），56.8 （3′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定為異鼠李素。

化合物5： 黃色粉末（甲醇），分子式C16H12O6，熔點 257 ～258 ℃，ESI-MSm/z： 299.3 ［MH］-。1H-NMR （ 600 MHz，DMSO-d6）δ： 3.83（3H，s，4′-OCH3），6.18 （1H，s，H-6），6.39（1H，s，H-8），6.68 （1H，s，H-3），7.12 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-5′），7.45 （1H，s，H-2′），7.49 （1H，s，H-6′），12.92 （1H，brs，5-OH）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 162.9 （C-2），102.8 （C-3），180.8 （C-4），161.6 （C-5），98.9（C-6），165.6 （C-7），93.8 （C-8），157.5 （C-9），103.6 （C-10），122.8 （C-1′），113.1 （C-2′），147.1 （C-3′），150.8 （C-4′），111.9 （C-5′），118.6 （C-6′），56.2 （4′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］ 報道基本一致，故鑒定為香葉木素。

化合物6： 白色針狀結(jié)晶 （甲醇），分子式C15H14O7，熔點208 ～210 ℃，ESI-MSm/z： 305.3［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 2.77（1H，dd，J＝16.5，4.5 Hz，H-4e），2.89 （1H，dd，J＝16.5，4.5 Hz，H-4a），4.15 （1H，m，H-3），4.71 （1H，brs，H-2），5.89 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-6），5.98 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.55 （2H，s，H-2′，6′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 79.5 （C-2），67.9 （C-3），28.9 （C-4），157.8 （C-5），96.8 （C-6），157.9 （C-7），96.0 （C-8），157.3 （C-9），99.8 （C-10），131.7（C-1′），106.8 （C-2′，6′），146.9 （C-3′，5′），133.8 （C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 報道基本一致，故鑒定為表沒食子兒茶素。

化合物7： 白色粉末（甲醇），分子式C22H18O10，熔點 257 ～258 ℃，ESI-MSm/z： 441.4 ［MH］-。1H-NMR （ 600 MHz，DMSO-d6）δ： 2.69（1H，d，J＝16.3 Hz，H-4e），2.97 （1H，dd，J＝17.5，4.7 Hz，H-4a），5.05 （1H，s，H-2），5.37 （1H，brs，H-3），5.87 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），5.96 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），6.68 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），6.77 （1H，dd，J＝8.3，1.7 Hz，H-6′），6.83 （2H，s，H-2′，6′），6.89 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2′），9.37（1H，s，5-OH）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 76.6 （ C-2），67.7 （ C-3），25.8 （ C-4），155.5 （C-5），95.7 （C-6），156.8 （C-7），93.8（C-8），157.1 （C-9），96.9 （C-10），128.8 （C-1′），113.9 （C-2′），145.1 （C-3′），145.2 （C-4′），114.8 （C-5′），117.7 （C-6′），119.6 （C-1″），109.2 （C-2″），145.7 （C-3″），139.2 （C-4″），145.8 （ C-5″），108.4 （ C-6″），164.8（-COO-）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］ 報道基本一致，故鑒定為表兒茶素沒食子酸酯。

化合物8： 黃色粉末（甲醇），分子式C27H30O14，ESI-MSm/z： 601.2 ［M＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 0.79 （3H，d，J＝5.5 Hz，6?-CH3），4.92 （1H，d，J＝5.0 Hz，H-1″），5.21 （1H，s，H-1?），6.48 （1H，s，H-3），6.59 （1H，s，H-8），7.02 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，5′），7.78（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2′，6′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 165.8 （C-2），104.1 （C-3），183.9 （ C-4），163.2 （ C-5），110.2 （ C-6），164.8 （C-7），96.2 （C-8），159.2 （C-9），105.5（C-10），122.9 （C-1′），129.6 （C-2′），116.8（C-3′），161.7 （ C-4′），114.8 （ C-5′），129.6（C-6′），78.0 （C-1″），70.8 （C-2″），80.9 （C-3″），76.8 （C-4″），82.8 （C-5″），62.6 （C-6″），102.5 （ C-1?），71.9 （ C-2?），71.5 （ C-3?），73.2 （C-4?），70.0 （C-5?），17.9 （C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 報道基本一致，故鑒定為異牡荊素-2″-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物9： 黃色粉末（甲醇），分子式C22H22O11，ESI-MSm/z： 463.4 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 3.90 （ 3H，s，4′-OCH3），5.10（1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″），6.47 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-6），6.78 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-8），6.79 （1H，s，H-3），7.09 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5′），7.48 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-2′），7.62（1H，dd，J＝8.0，2.5 Hz，H-6′），12.95 （1H，brs，5-OH）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：164.0 （ C-2），105.9 （ C-3），182.9 （ C-4），162.1 （C-5），95.8 （C-6），165.0 （C-7），99.8（C-8），158.0 （C-9），104.7 （C-10），123.7 （C-1′），114.0 （C-2′），147.8 （C-3′），151.9 （C-4′），113.0 （C-5′），120.1 （C-6′），100.8 （C-1″），74.0 （C-2″），76.9 （C-3″），69.9 （C-4″），77.9 （C-5″），60.8 （C-6″），56.5 （4′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］ 報道基本一致，故鑒定為香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物10： 淡黃色粉末 （甲醇），分子式C27H30O16，ESI-MSm/z： 611.5 ［M＋H］＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ： 6.18 （1H，brs，H-6），6.39 （1H，brs，H-8），7.79 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-2′），6.88 （1H，dd，J＝8.5，2.2 Hz，H-5′），7.49 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-6′），5.18（1H，d，J＝6.5 Hz，Glu-H-1″），3.00 ～4.30（5H，overlapped，Glu-H-2″～6″），4.69 （1H，d，J＝ 2.2 Hz，Rha-H-1?），3.00 ～ 4.30 （ 4H，overlapped，Rha-H-2?～5?），0.87 （3H，s，Rha-6?-CH3）；13C-NMR （ 150 MHz，DMSO-d6）δ：156.7 （ C-2），132.9 （ C-3），176.8 （ C-4），161.0 （C-5），98.9 （C-6），161.5 （C-7），94.5（C-8），156.1 （C-9），105.8 （C-10），122.0 （C-1′），115.9 （C-2′），145.0 （C-3′），148.7 （C-4′），114.9 （C-5′），121.7 （C-6′），100.6 （C-1″），73.9 （C-2″），76.7 （C-3″），70.0 （C-4″），77.8 （C-5″），61.2 （C-6″），98.6 （C-1?），70.1（C-2?），70.3 （C-3?），71.8 （C-4?），70.5 （C-5?），18.0 （C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］ 報道基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-Oα-L-鼠李糖苷。

化合物11： 黃色粉末（甲醇），分子式C28H32O16，ESI-MSm/z： 647.2 ［M＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 3.87 （ 3H，s，3′-OCH3），4.39（1H，s，H-1?），5.45 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″），6.17 （1H，s，H-6），6.38 （1H，s，H-8），6.89 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′），7.49 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-6′），7.91 （1H，s，H-2′）；13CNMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 156.9 （C-2），133.6 （ C-3），178.1 （ C-4），161.9 （ C-5），100.2 （C-6），163.8 （C-7），94.9 （C-8），157.0（C-9），106.2 （ C-10），121.9 （ C-1′），114.1（C-2′），150.3 （ C-3′），147.8 （ C-4′），115.8（C-5′），122.9 （C-6′），102.0 （C-1″），75.2 （C-2″），77.1 （C-3″），70.7 （C-4″），76.6 （C-5″），67.5 （ C-6″），101.7 （ C-1?），70.8 （ C-2?），72.0 （C-3?），72.8 （C-4?），69.2 （C-5?），17.6（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］ 報道基本一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

化合物12： 淡黃色粉末 （甲醇），分子式C34H42O21，ESI-MSm/z： 785.2 ［M-H］-。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ： 7.96 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-2′），7.72 （1H，dd，J＝8.4，2.1 Hz，H-6′），6.93 （1H，d，J＝2.4 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.55 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.28 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″″），5.09 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1″），4.57（1H，d，J＝1.5 Hz，H-1?），3.96 （3H，s，3′-OCH3），1.09 （3H，d，J＝5.5 Hz，Rha-CH3）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 158.5 （C-2），135.8 （ C-3），179.6 （ C-4），163.2 （ C-5），101.5 （C-6），164.9 （C-7），96.5 （C-8），159.8（C-9），107.9 （ C-10），123.2 （ C-1′），115.2（C-2′），151.4 （ C-3′），148.6 （ C-4′），116.5（C-5′），124.3 （C-6′），56.9 （3′-OCH3），104.8（Glu-C-1″），75.8 （Glu-C-2″），78.6 （Glu-C-3″），72.1 （Glu-C-4″），77.6 （Glu-C-5″），68.9 （Glu-C-6″），102.6 （ Rha-C-1?），72.2 （ Rha-C-2?），72.5 （ Rha-C-3?），74.3 （ Rha-C-4?），69.9（Rha-C-5?），17.9 （Rha-C-6?），101.9 （Glu-C-1″″），75.2 （Glu-C-2″″），77.9 （Glu-C-3″″），71.8（Glu-C-4″″），78.7 （ Glu-C-5″″），62.8 （ Glu-C-6″″）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］ 報道基本一致，故鑒定為異鼠李素-3-O-蕓香糖-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13： 白色針狀結(jié)晶（氯仿），熔點139 ～140 ℃，加入10%硫酸乙醇反應(yīng)顯紫紅色； 與β-谷甾醇對照品點于同一薄層板上，用同一展開劑展開，斑點顏色、形狀、Rf值相同，與對照品混合后熔點無明顯變化，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物14： 白色粉末（甲醇），分子式C35H60O6，ESI-MSm/z： 575.8 ［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 0.63 （3H，s，H-18），0.87 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-29），0.94 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-19），2.91 （1H，m，H-5′），3.05 （1H，q，J＝5.0 Hz，H-2′，3′），3.12 （1H，q，J＝4.2 Hz，H-4′），3.66 （1H，m，H-3），4.25 （1H，d，J＝7.5 Hz，H-1′），5.37 （1H，d，J＝4.5 Hz，H-6）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 36.9 （C-1），29.4 （C-2），77.0 （C-3），39.1 （C-4），140.7 （C-5），121.2 （C-6），31.5 （C-7），31.7（C-8），50.2 （C-9），36.3 （C-10），20.9 （C-11），40.5 （C-12），42.1 （C-13），56.3 （C-14），23.9 （C-15），27.9 （C-16），55.5 （C-17），11.9（C-18），19.0 （C-19），35.7 （C-20），18.9 （C-21），33.5 （C-22），25.7 （C-23），45.5 （C-24），28.9 （C-25），19.2 （C-26），19.9 （C-27），22.8（C-28），11.9 （C-29），100.5 （C-1′），73.5 （C-2′），76.8 （C-3′），69.9 （C-4′），76.9 （C-5′），61.2 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［16］ 報道基本一致，故鑒定為β-胡蘿卜苷。

化合物15： 白色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式C9H10O5，熔點205 ～207 ℃，ESI-MSm/z： 197.2［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 7.25（2H，s，H-2，6），3.83 （6H，s，3，5-OCH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 121.5 （C-1），107.8 （C-2，6），141.5 （C-3，5），147.9 （C-4），167.9 （-COOH），56.6 （3，5-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［17］ 報道基本一致，故鑒定為丁香酸。

化合物16： 白色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式C7H6O4，熔點198 ～200 ℃，ESI-MSm/z： 153.1［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 6.79（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），7.25 （1H，dd，J＝8.4，1.7 Hz，H-6），7.33 （1H，d，J＝1.7 Hz，H-2）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 121.9（C-1），116.8 （C-2，6），145.0 （C-3），149.9（C-4），114.9 （ C-5），122.1 （ C-5），167.5（-COOH）。以上數(shù)據(jù)與文獻［18］ 報道基本一致，故鑒定為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物17： 白色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式C18H22O11，熔點131 ～132 ℃，ESI-MSm/z： 437.1［M＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 2.16（3H，s，-COCH3），4.68 （2H，d，J＝12.5 Hz，H-10），5.54 （1H，d，J＝5.5 Hz，H-6），5.77（1H，brs，H-1），5.95 （1H，brs，H-7），7.28（1H，brs，H-3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 21.2 （-COCH3），36.3 （C-5），44.2 （C-9），61.1 （C-10），61.6 （C-6′），70.7 （C-4′），77.1（C-3′），77.9 （C-5′），84.7 （C-6），99.2 （C-1，1′），105.2 （C-4），127.8 （C-7），143.3 （C-8），149.3 （C-3），170.2 （C-11），170.7 （-COCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］ 報道基本一致，故鑒定為車葉草苷。

4 抗病毒活性研究

4.1 病毒毒力測定 參考文獻［20］ 報道，將H5N1 標準病毒株依次稀釋至密度為1.0×10-8～1.0×10-1后，分別接種于MDCK 細胞中，設(shè)置4 個復孔，于37 ℃下培養(yǎng)72 h，測定細胞培養(yǎng)液上清血凝滴度（HA），采用Reed-Muench 法計算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。結(jié)果，H5N1的HA 效價為1 ∶ 64，經(jīng)Reed-Muench 法測得H5N1 標準病毒株的TCID50值為1.0×108/mL。

4.2 細胞毒性試驗 在96 孔細胞培養(yǎng)板上緊密接種MDCK 細胞，細胞密度為每孔1.0×104個，培養(yǎng)24 h，加入稀釋好的MTT 溶液，每孔50 μL，并設(shè)置空白對照組，僅加入MTT 溶液，每組4 個復孔，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，測定吸光度（A），采用Reed-Muench 法計算半數(shù)毒性濃度（CC50）。

4.3 抗病毒活性試驗 參考文獻［21］ 報道，采用MTT 法測定抗病毒活性。在96 孔細胞培養(yǎng)板上緊密接種MDCK 細胞，細胞密度為每孔1.0×104個，培養(yǎng)24 h。取各化合物適量，稀釋成不同質(zhì)量濃度的含藥溶液。取100 TCID50病毒與50 μL 含藥溶液混合，于37 ℃下培養(yǎng)30 min，加入96 孔細胞培養(yǎng)板的MDCK 細胞中，以利巴韋林為陽性對照，設(shè)置空白組、正常組、病毒組、陽性對照組，于37 ℃下培養(yǎng)48 h。取上清，PBS 緩沖液清洗2 次，每孔滴加50 μL 裂解液，輕搖，靜置40 min。吸取裂解物50 μL 置于白板，加入適量熒光素酶顯色底物，在490 nm 波長處測定吸光度 （A），采用Reed-Muench 法計算半數(shù)有效濃度（EC50）、選擇指數(shù)（SI），公式為SI＝CC50/EC50。

4.4 結(jié)果分析 化合物2、7 具有抗H5N1 病毒活性，選擇指數(shù)均大于2，有效性、安全性較強。其中化合物7 活性較強，但選擇指數(shù)不及利巴韋林，見表1。

表1 各化合物抗H5N1 病毒活性（±s，n＝4）Tab.1 Anti-H5N1 virus activities of various constituents（±s，n＝4）

表1 各化合物抗H5N1 病毒活性（±s，n＝4）Tab.1 Anti-H5N1 virus activities of various constituents（±s，n＝4）

化合物CC50/（mmol·L-1）EC50/（mmol·L-1）SI 2607.08±12.23131.12±7.964.63 7 0.31±0.050.06±0.015.17利巴韋林9.15±0.720.55±0.0916.64

5 討論

本研究通過對八仙草抗H5N1 病毒的活性部位的化學成分進行研究，共分離得到17 個化合物，進一步完善了該植物的基礎(chǔ)研究資料。再對上述化合物進行抗H5N1 病毒活性篩選，發(fā)現(xiàn)僅有2 個顯示出抗病毒活性，其中化合物7 是黃酮類，同時也可以歸屬為多酚類 （茶多酚），具有較強的抗H5N1 病毒活性，甚至超過了利巴韋林，在中藥新藥研究領(lǐng)域具有較好的開發(fā)利用前景。

結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)可能是八仙草發(fā)揮抗病毒作用的活性成分。然而傳統(tǒng)中草藥成分復雜，而且多數(shù)情況下是多種成分協(xié)同發(fā)揮治療作用，所以篩選出來的活性成分并不能全面反應(yīng)藥物的整體治療作用。在研究傳統(tǒng)中藥治療作用機制的時候，不應(yīng)拋開中醫(yī)藥治病的整體觀念，只有在中醫(yī)藥理論指導下的現(xiàn)代中藥研究，才能全面反應(yīng)中藥成分的相互作用機理，才是中藥治病的本質(zhì)體現(xiàn)。

前期報道，八仙草正丁醇部位具有較強的抗H5N1 病毒活性，然而本研究篩選出有活性的化合物較少，還是存在不足和需要完善的地方。本研究所分離鑒定的化合物均存在于正丁醇部位極性較低的組分，下一步將對該部位其余極性較高的組分進行分離，以期得到更多活性化合物或先導化合物。