桂枝茯苓膠囊聯合戈舍瑞林對子宮肌瘤大鼠卵巢儲備的影響

趙娜 周靈雪 楊向榮

子宮平滑肌瘤,是女性中最常見的盆腔腫瘤,通常會引起嚴重的不規(guī)則的長期經期出血,導致不育和流產[1];非手術治療主要是使用GnRH激動劑來抑制E2和孕酮的循環(huán)水平[2]。在選擇治療方案時,重要的是要考慮該程序對卵巢儲備的潛在影響,因為卵巢功能障礙可導致更年期發(fā)作加快和生育能力下降[3]。評估卵巢儲備的方法包括超聲檢查基質血流和竇性卵泡計數以及測量血清FSH、E2和AMH的水平[4]。桂枝茯苓方的主要作用是補血,化瘀和消腫[5]。該配方的常用制劑是丸劑,膠囊劑,片劑和湯劑。對現代文獻進行的文獻計量學研究分析了桂枝茯苓靈丸治療的疾病名稱,發(fā)現中藥發(fā)病率最高的是腹部腫塊,西藥疾病的最高發(fā)病率是子宮肌瘤[6]。舍瑞林是黃體生成素釋放激素的合成十肽類似物,起激動劑的作用,刺激垂體[7]。臨床上戈舍瑞林用于治療患有前列腺癌,乳腺癌和各種良性婦科疾病(子宮內膜異位,子宮肌瘤,子宮內膜變薄和輔助生殖)的患者[8]。本項研究通過建立子宮肌瘤大鼠模型,探討桂枝茯苓膠囊聯合戈舍瑞林對大鼠卵巢儲備的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗大鼠:從河北北方學院實驗動物研究所(土耳其馬拉蒂亞)獲得的40只健康成年雌性Wistar品系大鼠(3～4月齡)用于實驗。大鼠飼養(yǎng)在標準實驗室條件下[室溫為(22±2)℃;光照/黑暗周期為12 h,上午7∶00點亮]。隨意提供自來水和食物顆粒。實驗程序和實驗方案已獲得地方動物倫理委員會的批準。

1.1.2 子宮肌瘤模型和分組:實驗大鼠正常喂養(yǎng)1周。適應后,根據建立模型的隨機數表分組,對照組(n=10)標準條件下飼養(yǎng)的實驗大鼠,模型組(n=20)腹腔注射苯甲酸E2(0.5 mg/kg),1次/d,連續(xù)25 d,腹腔注射黃體酮(4 mg/kg),1次/d,連續(xù)5 d。治療組(n=10)在模型大鼠的基礎上,用桂枝茯苓膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)用蒸餾水溶解,配制成0.10 g/ml的溶液,動物劑量為0.70 g·kg-1·d-1;戈舍瑞林(英國,阿斯利康),用蒸餾水溶解,制成0.5 mg/ml的溶液,劑量為1.25 mg·kg-1·d-1,對大鼠進行聯合膠囊溶劑治療,持續(xù)6周。正常組和模型對照組每天0.9%氯化鈉溶液灌胃4周。給藥后,將大鼠禁食12 h,過夜,不限制飲水量,稱重。用30%(V/V)水合氯醛(3 ml/kg)進行腹腔麻醉,取出每只大鼠的子宮進行測試。所有實驗方案按照美國國家衛(wèi)生與醫(yī)學研究委員會的實驗動物護理指南進行。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本采集與稱重:實驗結束時,將所有大鼠麻醉(2.5 mg/kg Alfazyne和12.5 mg/kg Ketalar),稱重,并通過心臟穿刺獲得血樣。立即分離血清和血漿,并保持在20℃進行后續(xù)分析。采集血液樣本后,迅速將大鼠的2個卵巢取出并清洗和稱重。左卵巢固定在10%中性甲醛緩沖液中以進行光學顯微組織處理,而右卵巢的一半固定在2.5%戊二醛中以通過電子顯微鏡進行超微結構評估。將右卵巢的另一半迅速冷凍在40℃進行生化分析。用組織勻漿器在PBS(1/10;重量/體積)中將組織勻漿。將樣品離心并收集上清液以進行分析。

1.2.2 激素測定:使用酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒定量測定大鼠血清樣品中的E2,FSH,黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)和AMH (中國浙江)。

1.2.3 組織學和卵泡計數:為了評估卵巢結構和卵泡數量,蘇木精-伊紅染色在卵巢的第10個部分進行,以使每個部分與下一個第10個部分相隔約50～60 μm的距離。根據以下定義對卵泡進行計數:原始卵泡;被薄層,單層的所謂濾泡上皮細胞包圍。初級卵泡;卵母細胞周圍的單層或多層濾泡上皮變成等棱形或高度棱柱形。次級卵泡;卵泡中卵母細胞被兩層以上的顆粒細胞覆蓋,并且開始形成胃竇。Graafian(第三級)卵泡;卵泡,卵泡具有充滿卵泡液的單個大竇腔,其中顆粒細胞圍繞竇腔,卵母細胞被一些顆粒細胞(卵丘細胞)包圍。卵泡濾泡顆粒細胞中的退化性透明帶或卵母細胞以及融合。竇腔內有顆粒細胞和細胞碎片。所有切片均用光學顯微鏡(Leica DM 1000)進行評估,并用連接的數碼相機(Leica DMC 2900)進行監(jiān)控。

1.2.4 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)分析:TUNEL測定法用于檢測DNA損傷。按照制造商的說明進行測定程序(S7101;Apoptag Plus過氧化物酶原位細胞凋亡試劑盒,默克密理博,德國達姆施塔特,德國)。將取自每組卵巢中央水平的切片在甲苯中脫蠟,并通過一系列分級的乙醇和雙蒸餾水進行復水。載玻片用PBS沖洗并保存在蛋白酶K(圣路易斯,密蘇里州)中進行抗原回收。將切片與3%H2O2(默克公司,德國達姆施塔特,德國)一起孵育5 min,漂洗,在室溫下與1×平衡緩沖液一起孵育10 min。將TdT(末端脫氧核苷酸轉移酶)反應溶液在37℃下應用1 h,不同的是使用蒸餾水代替TdT酶作為陰性對照。將切片在室溫下置于停止/洗滌緩沖液中10 min。將抗洋地黃毒苷-過氧化物酶綴合物應用于切片。將DAB用作色原后,將切片用甲基綠(Trevigen的TM)復染。在所有類型的卵泡中,TUNEL(+)細胞占總細胞數的百分比均記錄為凋亡指數。

1.2.5 生化分析氧化應激:使用Teflon玻璃勻漿器在150 mmol/L KCl(pH 7.4)中以整個勻漿的1∶10(w/v)稀釋液對組織進行勻漿。將勻漿液在18 000×g和4℃下離心30 min,以確定MDA和GSH濃度以及SOD和CAT活性。

1.2.6 蛋白質印跡分析:通過Bradford試劑測定均質樣品中的蛋白質濃度。之后,將40 μg蛋白質在12%SDS-PAGE上分離并轉移至硝酸纖維素膜(sc-3718,圣克魯斯生物技術)。用在Tris緩沖鹽水(TBS)中的5%脫脂脫脂奶粉(Sigma,70166)封閉膜。將膜在TBST(含0.1%Tween-20的TBS)中洗滌2次,并與一抗(1∶500單克隆大鼠抗caspase-3,sc-7148,caspase-1,sc-47778,Santa Cruz)孵育過夜生物技術)。將膜與結合了HRP的二抗(1∶1 000山羊抗小鼠IgG1-HRP)一起溫育2 h。用試劑盒試劑(sc-2048,圣克魯斯生物技術試劑盒)顯影印跡。使用Image J OD分析軟件分析數據。關于β-肌動蛋白將信號標準化。

1.2.7 組織病理學檢查:固定后,將樣品包埋在石蠟中。使用Leica RM2125RTS從5 μm的石蠟塊上切下切片,并用蘇木精和曙紅染色。在光學顯微鏡(東京,日本)下檢查所有載玻片。卵巢損傷的標準是間質性水腫,擴張,出血,多形核白細胞浸潤(PNL)和濾泡細胞變性(顆粒細胞)。對于每個樣本,標準的評分為0～3分(0 =無;1 =輕度;2 =中等;3 =嚴重)。卵泡根據平均直徑分為幾類:原始的(<20 μm),竇前的(20～220 μm),小肛門的(221～310 μm)和大肛門的(311～370 μm)。卵巢切片由同一位病理學家檢查,他們對測試組不知情。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,采用單向方差分析和事后Tukey的顯著差異檢驗對生化值進行分析,采用Kruskal-Wallis方差分析比較組織學結果,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療干預降低體重和卵巢的重量 模型組較對照組的身重和器官卵巢重量升高(P<0.05),治療組較模型組降低(P<0.05),說明桂枝茯苓膠囊聯合戈舍瑞林治療降低子宮肌瘤大鼠的體重。見表1。

表1 大鼠體重和器官稱重 g,

2.2 激素水平檢測 使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒對各實驗組大鼠進行血清激素水平檢測,模型組較對照組E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高(P<0.05),治療組較模型組E2和AMH水平升高,FSH和LH水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠血清激素水平檢測

2.3 大鼠卵泡計數分析 通過組織學分析大鼠卵巢卵泡的發(fā)育情況,模型組較對照組原始卵泡、Graafian卵泡及黃體數量減少,次級卵泡和卵泡濾泡增多(P<0.05),治療組較模型組原始卵泡、Graafian卵泡及黃體數量增多,次級卵泡和卵泡濾泡減少(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠卵泡計數分析

2.4 TUNEL方法評估顆粒細胞 在電鏡下觀察發(fā)現,與對照組相比,PCOS組卵泡顆粒細胞凋亡(黑色箭頭表示)指數增加(P<0.05)。模型組的凋亡主要出現在Graafian卵泡顆粒細胞中。與模型組相比,治療組TUNEL(+)顆粒細胞數量減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 TUNEL方法評估顆粒細胞凋亡(蘇木精染色×200)

2.5 大鼠卵巢氧化應激水平分析 對大鼠卵巢勻漿稀釋液進行氧化應激水平分析,模型組較對照組MDA和CAT水平升高,GSH和SOD水平降低(P<0.05),治療組較模型組MDA和CAT水平降低,GSH和SOD水平升高(P<0.05),數據表明干預治療后能降低子宮肌瘤大鼠卵巢中的氧化應激水平。見表4。

表4 大鼠卵巢氧化應激水平分析

2.6 干預治療抑制凋亡蛋白的表達 通過蛋白印跡分析大鼠卵巢Caspase-3和Caspase-1的表達,模型組較對照組Caspase-3和Caspase-1的表達升高(P<0.05),治療組較模型組Caspase-3和Caspase-1的表達降低(P<0.05)。見圖2,表5。

圖2 Caspase-3和Caspase-1蛋白印跡分析

表5 Caspase-3和Caspase-1蛋白質表達水平

2.7 卵巢組織損傷評分 模型組較對照組的水腫、擴張、出血和白細胞浸潤評分升高(P<0.05),治療組較模型組降低(P<0.05),說明桂枝茯苓膠囊聯合戈舍瑞林保護子宮肌瘤大鼠的卵巢損傷。在對照組中觀察到正常的卵泡和黃體,模型組顯示血管擴張(粗箭頭),出血(細箭頭),濾泡變性(箭頭頸)和多形核淋巴細胞浸潤(星形)。治療組中觀察到輕度出血(細箭頭),血管擴張(粗箭頭),濾泡變性(箭頭頸)和多形核淋巴細胞浸潤(星形),較模型組損傷減輕(P<0.05)。見表6,圖3。

圖3 大鼠卵巢顯微鏡外觀(HE×100)

表6 大鼠卵巢組織病理學評估 分,

3 討論

子宮肌瘤的發(fā)生隨著年齡增加而增加,在絕經年齡左右最高,此后會減少,癥狀取決于腫瘤的大小和位置[9]。然而,絕大多數的腫瘤無癥狀,并且是常規(guī)婦科檢查(雙手或超聲檢查)中偶然發(fā)現的[10]。肌瘤最常見的體征和癥狀包括月經周期紊亂大出血和月經疼痛,與盆腔疼痛相關的盆腔腫塊,泌尿問題或便秘[10]。子宮肌瘤,尤其是黏膜下和壁內肌瘤也可能引起不孕和復發(fā)性流產[11]。對于肌瘤的治療,有多種治療選擇,包括手術治療,非手術替代方法和藥物治療[12]。最初,子宮切除術被認為是有癥狀肌瘤的一種治療選擇[13]。如今,由于人們越來越關注患者的生活質量和個性化的治療期望,治療的選擇取決于患者的年齡以及意愿。

卵巢儲備是個體生殖潛能的量度,理解為剩余卵母細胞的數量和質量[14]。卵巢儲備主要用于預測對卵巢刺激的反應。降低的卵巢儲備有時被稱為原發(fā)性卵巢功能不全,不同于更年期和卵巢早衰[15]。據認為,卵巢儲備降低導致卵巢反應差(卵泡數量減少,胚胎數量減少和消除率增加)以及受精能力降低。但是,筆者發(fā)現目前尚無統(tǒng)一的卵巢儲備降低定義。生化和超聲檢查可以間接評估卵巢儲備。生化測試包括FSH、E2、抑制素B和AMH以及克羅米芬檸檬酸鹽激發(fā)試驗。竇卵泡計數和卵巢體積是用于評估卵巢儲備的超聲檢查[16]。根據目前的指南,FSH是降低卵巢儲備的最常用篩查方法,但卵泡計數和AMH是最有前途的預測指標。許多因素,例如化學療法或放射療法子宮肌瘤以及吸煙可能會對卵巢儲備產生負面影響。

研究對卵巢功能的影響依賴于血清激素水平,特別是FSH,E2和AMH的分析[17]。FSH從垂體釋放,刺激未成熟卵泡的生長[18]。當卵巢儲備(以剩余卵泡的數量來衡量)減少或減少時,由于抑制素B(垂體卵泡釋放的激素)對垂體的負反饋減少,FSH升高[19]。因此,在月經周期第3天測得的FSH水平升高(410 mU/ml),表明卵巢儲備下降。E2從竇狀卵泡釋放;因此,在較高的FSH水平的影響下較低的E2水平表明卵巢儲備減少。AMH也從竇腔卵泡中釋放,因此較低的AMH水平是卵巢儲備減少的標志[20]。超聲檢查也可用于測量卵巢體積,竇房卵泡計數,卵巢間質血流量,卵巢動脈灌注和卵巢動脈抵抗指數。血清激素測試可提供有關剩余卵巢儲備的信息,并且可以用來推斷卵巢的功能。

在這項研究發(fā)現,藥物誘導子宮肌瘤會導致卵巢儲備減少,這與組織氧化應激增加,荷爾蒙變化受損和組織學損害增加有關。模型誘導后,大鼠的體重和卵巢重量增加,E2和AMH水平降低,而FSH和LH水平升高,這對卵巢功能尤其是儲備特別不利,并且卵巢組織具有超出對照組的氧化應激。相比之下,接受桂枝茯苓膠囊和戈舍瑞林藥物治療的大鼠的組織氧化應激參數,卵巢儲備標志物和組織病理學變化得到了明顯改善。MDA是脂質過氧化作用的最終產物,含量增加反映了氧化應激。相反,谷胱甘肽水平的升高以及SOD,CAT和GPx的活性表明氧化損傷后組織的愈合。氧化應激通過抑制卵母細胞的核和細胞質成熟并誘導凋亡而導致卵巢衰竭。本研究結果還表明,子宮肌瘤病變誘導的卵巢功能不全后,桂枝茯苓膠囊和戈舍瑞林可以改善卵巢儲備標志物。與模型組相比,治療組的AMH和E2水平增加,而FSH和LH水平則下降。同時表明聯合治療可改善子宮肌瘤卵巢組織中的組織學參數,例如出血,血管充血和單核細胞浸潤。另一方面,Caspase-3和Caspase-1是caspase級聯反應的重要組成部分,已與細胞凋亡依賴性信號通路相關。在本研究中,通過免疫印跡法檢測Caspase-3和Caspase-1蛋白的表達,聯合治療抵消卵巢細胞的凋亡,還通過測量卵泡計數評估了聯合治療對卵巢儲備的保護作用,觀察到竇前和較小的肛門卵泡的損失較小。

綜上所述,桂枝茯苓膠囊聯合戈舍瑞林可降低子宮肌瘤大鼠卵巢組織氧化應激和組織病理參數,改善激素水平,提高卵巢儲備。