中藥杜仲皮總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

陸梅元，李 杉，楊夢霞，盧新麗，曾海生

（1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評查驗(yàn)中心，南寧 530029；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；3.廣西嘉路人力資源顧問有限責(zé)任公司，南寧 530031）

杜仲皮為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）的干燥樹皮，是臨床上常用的中藥材，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、安胎等作用，常與其他中藥組成經(jīng)驗(yàn)方，多用于治療腎虛腰痛、高血壓、筋骨無力、胎動(dòng)不安等癥［1］。中藥材產(chǎn)地及加工方法是控制藥材質(zhì)量的關(guān)鍵，查閱《本草經(jīng)集注》及相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，中藥杜仲有采皮陰干、去粗皮曬干和去粗皮“發(fā)汗”后曬干等加工方法［1，2］，但加工標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，臨床療效參差不齊?？傸S酮具有抗氧化、降血壓、降血脂和抗腫瘤等藥理作用［3-5］，是杜仲重要的活性成分。

鮮見有關(guān)杜仲皮總黃酮含量測定的研究。為保障中藥杜仲的質(zhì)量及臨床療效，本研究以杜仲皮總黃酮含量為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察提取方法、提取溶劑、提取溶劑體積、提取時(shí)間對杜仲皮總黃酮含量的影響，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，以期建立中藥杜仲皮總黃酮含量的測定方法，為全面建立和評價(jià)中藥杜仲加工方法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

EnVisionXcite 型全波長多功能酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer 公司；EL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；A-S082 型多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司。

1.2 試藥

總抗氧化（T-AOC）測定試劑盒、羥基自由基（-OH）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

蘆?。ㄅ?00080-202012），購于中國食品藥品檢定研究院，其余試劑均為分析純。中藥材購于南寧市老百姓大藥房，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部曾超主任中藥師鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品12.85 mg，加60%乙醇溶解，定容至25 mL 的容量瓶中，輕輕搖勻溶解，配制成濃度為0.514 mg/mL 的對照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試品的制備 精密稱取杜仲皮粉末適量，加樣品10 倍體積60%乙醇加熱回流進(jìn)行提取，提取時(shí)間1.5 h，提取液過濾、合并、濃縮至無乙醇味，備用。取樣品適量加熱水，超聲溶解，冷卻后抽濾，得到杜仲皮濾液。濾液經(jīng)預(yù)處理好的大孔吸附樹脂HPD-100 吸附后，先以2 倍柱體積的純水洗去雜質(zhì)，再用3 倍柱體積的60%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇味，冷凍干燥后即得杜仲皮藥材總黃酮供試品。測定杜仲皮總黃酮的吸光值，使用回歸方程得出杜仲皮供試品溶液中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

精密量取按照“1.3.1”方法制備的對照品溶液2 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，輕輕搖勻，靜置7 min，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，輕輕搖勻，靜置7 min，再加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，加純水至刻度，輕輕搖勻，靜置12 min。用對應(yīng)試劑（除對照品不放，其他試劑同前）作空白對照試驗(yàn)，在波長400～800 nm 下測定蘆丁對照品的吸光度（圖1）。由圖1 可知，其最大吸收波長為510 nm。

圖1 蘆丁對照品吸收光譜

2.2 線性關(guān)系的考察

精密量取按照“1.3.1”方法制備的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分別置于25 mL 的容量瓶中，加入1 mL 的5% 亞硝酸鈉，輕輕搖勻，放置7 min，再加入1 mL 的10%硝酸鋁，輕輕搖勻，放置7 min，再加入10 mL 的4%的氫氧化鈉，加純水至刻度，輕輕搖勻，放置12 min，然后在波長510 nm 處進(jìn)行測定［6］。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，線性方程為y=12.198 0x-0.028 4，R2=0.999 2，說明線性方程在0.010 4～0.083 2 mg/mL 水平上線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm 處連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定供試品吸光度。RSD為2.04%，小于3%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，分別于0、10、20、30、40、50、60 min，連續(xù)進(jìn)樣7 次，于波長510 nm 處測定樣品吸光度。

計(jì)算得到杜仲皮總黃酮含量RSD為1.91%，小于3%，表明樣品在60 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取杜仲皮粉末樣品6份，每份1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，于510 nm波長處平行測定樣品吸光度。計(jì)算得到杜仲皮總黃酮平均含量為15.08 mg/g，RSD為2.36%，RSD小于3%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批已知總黃酮含量的杜仲皮粉末0.5 g，共9 份，分成3 個(gè)組，即低、中、高加樣組，按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm 處平行測定樣品吸光度，計(jì)算杜仲皮總黃酮的含量。由表1 可知，杜仲皮低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為100.36%、100.93%、99.29%，RSD分別為2.33%、1.71%、2.81%（n＝3），表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.4 單因素考察試驗(yàn)

2.4.1 提取方法考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，以60%乙醇為提取劑，提取時(shí)間為1 h，提取體積25 mL，分別采用溶劑浸漬法、超聲提取法和回流提取法對杜仲皮進(jìn)行總黃酮提取（圖2），按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm處進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，回流提取法的提取效率最高，因此本研究選擇回流提取法。

圖2 提取方法考察

2.4.2 提取溶劑濃度考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，提取時(shí)間為1.0 h，溶劑提取體積為25 mL，采用回流提取法，設(shè)置提取溶劑乙醇的濃度分別為30%、50%、60%、70%、80%和95%，按照“1.3.2”方法制備供試品，進(jìn)樣測定。由圖3 可知，50%乙醇回流提取的杜仲皮總黃酮提取率最高，因此本研究乙醇溶劑提取濃度選擇50%。

圖3 提取溶劑濃度考察

2.4.3 提取時(shí)間考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，以25 mL 50%乙醇為提取條件，采用回流提取法，設(shè)置提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按照“1.3.2”方法制備供試品，進(jìn)樣測定。由圖4 可知，提取時(shí)間為1.5 h 時(shí)總黃酮提取率最高，因此本研究提取時(shí)間為1.5 h。

圖4 提取時(shí)間考察

2.4.4 提取溶劑體積考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，提取時(shí)間為1.5 h，提取劑為50%乙醇，采用回流提取法，50%乙醇溶劑設(shè)置不同體積，分別為20、30、40、50、60、70 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品，進(jìn)樣測定。由圖5 可知，提取劑提取體積為40 mL 時(shí)的總黃酮提取率最高，因此本研究選擇提取溶劑體積為40 mL。

圖5 提取溶劑體積考察

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)前期試驗(yàn)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選用L9（34）正交試驗(yàn)［7，8］，以乙醇為提取溶劑，試驗(yàn)各因素水平詳見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析表明，乙醇濃度和提取時(shí)間對杜仲皮總黃酮提取工藝有顯著影響，料液比對杜仲皮總黃酮提取工藝無顯著影響，且各影響因素的強(qiáng)弱為乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B），所以乙醇濃度和提取時(shí)間對杜仲皮總黃酮提取效果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最佳提取方式為A2B2C2，即杜仲皮總黃酮效率最佳提取方式為乙醇濃度50%，料液比1∶40 g/mL，提取時(shí)間1.5 h。

2.6 杜仲皮總黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.6.1 總黃酮含量測定 稱取杜仲皮藥材粉末6份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，按照最佳提取工藝制備供試品，測定杜仲皮總黃酮的含量，結(jié)果見表5。由表5 可知，本研究建立的方法可以在體外進(jìn)行總黃酮抗氧化能力測定。

表5 杜仲皮總黃酮含量測定結(jié)果

2.6.2 總黃酮總抗氧化能力測定 杜仲皮總黃酮總抗氧化能力測定使用總抗氧化（T-AOC）能力試劑盒進(jìn)行測定?？偪寡趸芰y試盒（T-AOC）試驗(yàn)原理是在酸性條件下，具有抗氧化的藥物或化學(xué)成分能使Ferric-tripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）還原成Fe2+-TPTZ，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，于紫外波長593 nm 處進(jìn)行測定，即得杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力。

由圖6 可知，杜仲皮總黃酮和維生素C 對照品對鐵離子均具有較強(qiáng)的還原能力，并且隨著總黃酮樣品和維生素C 濃度的增加而增強(qiáng)。杜仲皮總黃酮濃度為3.0 mg/mL 時(shí)，總抗氧化能力為132.2 U/mL。相同溶液濃度下，杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力強(qiáng)于維生素C。

圖6 杜仲皮總黃酮、維生素C 總抗氧化能力

2.6.3 總黃酮羥基自由基（-OH）清除能力測定 杜仲皮總黃酮清除羥基自由基能力，使用羥基自由基試劑盒方法進(jìn)行測定。羥基自由基為一種活性氧，其清除能力可作為抗氧化能力的重要指標(biāo)。Fenton是最常見的產(chǎn)生羥基自由基反應(yīng)，其原理是H2O2在Fe2+的催化下產(chǎn)生-OH，當(dāng)給予電子受體后，用Griess 試劑顯色，生成紅色化合物，在波長550 nm 處測定，可反映樣品對羥基自由基的清除能力。

由圖7 可知，總黃酮和維生素C 對羥基自由基具有較好的清除效果，并且清除率隨濃度的增加而增大。當(dāng)濃度在0.4～1.2 mg/mL 時(shí)，總黃酮對羥基自由基的清除率略低于維生素C，當(dāng)濃度大于1.2 mg/mL后，總黃酮對羥基自由基的清除率高于維生素C，當(dāng)濃度等于3.0 mg/mL 時(shí)，總黃酮羥基自由基清除率為90%。

圖7 杜仲皮總黃酮、維生素C 對羥基自由基的清除能力

3 小結(jié)與討論

以杜仲皮為研究對象，考察了不同濃度的乙醇、料液比和提取時(shí)間3 個(gè)影響試驗(yàn)的因素，采用回流提取的方法提取中藥杜仲皮總黃酮，利用三因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)方法來優(yōu)選杜仲皮總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，中藥杜仲皮總黃酮的最佳提取工藝為采用回流提取法，乙醇濃度為50%，料液比1∶40 g/mL，提取時(shí)間1.5 h，此提取杜仲皮總黃酮的效果最佳。

對杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力和清除羥基自由基進(jìn)行測定，結(jié)果表明，杜仲皮總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用。總黃酮濃度為3.0 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力為132.2 U/mL，羥基自由基清除率為90%，并且其清除能力隨濃度的增加而增大。