基于核心InDel標(biāo)記櫻桃番茄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析與應(yīng)用

張 輝 李 鑫 王志敏 胡俊玲 魯曉曉 潘峰 潘春陽 蘇文悅 徐毛毛 張 敏 高浩冉 劉磊 黃澤軍 王孝宣 杜永臣 李君明 朱文瑩 國艷梅*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266000；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

櫻 桃 番 茄（Lycopersicon esculentumvar.cerasiformeA.Gray）是栽培種番茄的變種，果實風(fēng)味獨特、營養(yǎng)物質(zhì)豐富。我國櫻桃番茄產(chǎn)業(yè)起步較晚，20世紀80年代后隨著人們生活水平的提高和消費觀念的改變才發(fā)展起來，而日本早在1991—1996年報道的30 多個育成番茄品種中就有15 個是櫻桃番茄，且形狀及顏色豐富（唐樹發(fā)和劉寶春，2004）。我國番茄育種資源缺乏，育種技術(shù)較為滯后（李君明 等，2021）。就櫻桃番茄而言，近年來雖然育成了粉貝貝、圣桃T7、粉貝妮等系列新品種，但與國外、跨國公司推廣的釜山88、夏日陽光等相比還存在一定差距，特別是近些年市場對櫻桃番茄品種提出了色澤更鮮艷、形狀更多樣、風(fēng)味品質(zhì)更突出、綜合抗性更強等系列新要求，也對櫻桃番茄育種提出了新的挑戰(zhàn)。種質(zhì)資源遺傳多樣性是育種的基礎(chǔ)，新種質(zhì)的創(chuàng)制是育成優(yōu)良新品種的重要保障。我國在“十三五”期間開展了番茄遺傳資源精準鑒定，但數(shù)量和范圍十分有限，特別對選育出的優(yōu)良品系種質(zhì)了解甚少。因此，有必要開展櫻桃番茄優(yōu)異種質(zhì)遺傳多樣性分析，特別是要加強與國外優(yōu)良新品種的比較分析，了解其異同，為優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制及優(yōu)良新品種選育提供必要的依據(jù)。

到目前為止，番茄已有數(shù)千份資源的重測序數(shù)據(jù)，挖掘了大量變異位點，為番茄遺傳改良提供了有力技術(shù)保障。人們發(fā)現(xiàn)在番茄馴化和遺傳改良過程中，基因組中存在的插入或缺失（InDel）片段分布廣泛、密度大、數(shù)目多。利用InDel 標(biāo)記分析基因組，不僅呈現(xiàn)共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和帶型簡單等優(yōu)點，而且操作簡單、方便、成本低（Jander et al.，2002；申璐 等，2011），已被廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、綠豆、黃瓜和番茄等多種作物的純度檢測、資源遺傳多樣性分析、基因定位以及品種指紋圖譜構(gòu)建等（Choi et al.，2007；Mueller et al.，2009；Wang et al.，2010；蘭青闊 等，2011；張體付 等，2012；Chen et al.，2013；李群三 等，2019；Manni et al.，2021），如Ngan 等（2016）利用6 個SSR 和35 個InDel 標(biāo)記將62 個番茄品種（F1）劃分為鮮食番茄、葡萄型、櫻桃番茄3 個類群。同時，為了進一步規(guī)范市場，保護品種權(quán)，我國還先后出臺了NY/T 2471—2013《番茄品種鑒定技術(shù)規(guī)程-InDel 分子標(biāo)記法》和GB/T 28551—2020《植物品種鑒定-MNP 標(biāo)記法》。雖然MNP標(biāo)記法較InDel 對于實質(zhì)性派生品種鑒定更為準確，但實施較為復(fù)雜，難以廣泛普及，而InDel 標(biāo)記法更為簡便、靈活。

鑒于目前番茄品種鑒定的48 對核心InDel標(biāo)記主要來自鮮食番茄和加工番茄（蘇曉梅，2014），其在櫻桃番茄種質(zhì)資源中的多態(tài)性尚不十分清楚，同時缺乏對選育的大量櫻桃番茄品種遺傳多樣性的深入了解。本試驗利用48 對InDel 標(biāo)記對多年來選育出的110 份櫻桃番茄優(yōu)異種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，同時對市場收集的國內(nèi)外優(yōu)良品種進行了鑒定，旨在為櫻桃番茄品種遺傳改良及品種保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試櫻桃番茄材料122 份，包括中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組多年來選育出的不同來源的櫻桃番茄核心育種自交系110 份和市場上購買的商業(yè)種（F1）12 份，其中千禧、鳳珠購自臺灣農(nóng)友種苗股份有限公司；圣桃T7、靚貝購自中農(nóng)綠亨科技股份有限公司；粉貝貝購自南寧市桂福園農(nóng)業(yè)有限公司；粉貝妮購自青島奧錦生物科技有限公司；香妃12、香妃16 購自寧夏巨豐種苗有限責(zé)任公司；青春之歌購自河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司；釜山88 購自韓國農(nóng)友BIO 株式會社；粉喜購自華美種子有限責(zé)任公司；夏日陽光購自以色列海澤拉種子公司。2022年春季將122 份櫻桃番茄材料統(tǒng)一編號，全部種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南圃場日光溫室，每份材料種植10 株，進行常規(guī)田間管理，并對其主要性狀進行調(diào)查，幼苗期取嫩葉提取DNA。

1.2 試驗方法

分別在不同時期（開花期、坐果期、膨大期、紅熟期）對生長類型、植株生長勢、節(jié)間長度、葉色、葉量、果肩、果色、萼片、花序、果實形狀、果實大小、耐裂性、可溶性固形物含量、風(fēng)味等主要性狀進行調(diào)查，具體參考《番茄種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準》（李錫香和杜永臣，2006）。2021年秋季對110 份自交系采用半輪配法并結(jié)合園藝性狀和抗病基因配制了420 個F1組合，2022年春季種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院壽光蔬菜研發(fā)中心番茄育種基地，單干整枝，根據(jù)植株生長勢、抗病性、坐果率、風(fēng)味等進行篩選鑒定。

待參試122 份材料第3 片真葉完全展開時，選取1 株長勢正常的幼苗，取少量幼嫩葉片，分別裝于2 mL 離心管中，采用改良CTAB 法提取基因組DNA（Bipinchandra et al.，2016）。PCR 反應(yīng)體系為10 μL 體系：1 μL DNA 模板，0.25 μL 正向引物，0.25 μL 反向引物，5 μL 2 × PCR Master Mix，3.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR 反應(yīng)完成后，采用40%聚丙烯酰胺凝膠對PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠的成分包括40%聚丙烯酰胺溶液、10%過硫酸銨（APS）溶液、四甲基乙二胺溶液（TEMED）、10 × TBE 溶液和ddH2O。電泳結(jié)束后，采用0.1% AgNO3溶液對聚丙烯酰胺膠進行染色，然后用氫氧化鈉與甲醛水溶液進行顯色，照膠后統(tǒng)計電泳條帶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)公式PICi=1-∑Pij2計算標(biāo)記多態(tài)性信息量PIC（polymorphism information content），式中i表示標(biāo)記，Pij表示標(biāo)記i的第j個等位基因出現(xiàn)的頻率。根據(jù)基因分型結(jié)果，利用MEGA 7.0 軟件計算遺傳距離，利用MEGA 軟件中的UPGMA 算法進行聚類分析（Kumar et al.，2016），并構(gòu)建DNA指紋圖譜。利用ADMIXTRUE 軟件進行櫻桃番茄群體結(jié)構(gòu)分析，plink 軟件進行櫻桃番茄群體主成分分析。

1.4 DNA 指紋圖譜構(gòu)建

利用48 對InDel 標(biāo)記構(gòu)建了12 份櫻桃番茄商業(yè)種和選出的綜合性狀優(yōu)良組合的親本的DNA指紋圖譜。根據(jù)基因分型結(jié)果，將與參考基因組Heinz1706 基因型相同的記為1，與參考基因組不同的純合基因型記為3，雜合基因型記為2，基因型缺失記為0。將每種材料的基因分型結(jié)果按照48對InDel 標(biāo)記所在染色體和在染色體上物理位置的標(biāo)記組合順序排列，形成一串獨特的編碼，即可形成每種材料的DNA 指紋圖譜。

48 對核心InDel 標(biāo)記主要來自鮮食番茄和加工番茄（表1）（蘇曉梅，2014）。

表1 番茄48 對核心InDel 標(biāo)記信息

2 結(jié)果與分析

2.1 122 份櫻桃番茄的主要性狀特征

參試種質(zhì)的14 個性狀調(diào)查結(jié)果表明（表2），110 份優(yōu)異櫻桃番茄自交系大多數(shù)為無限生長類型，只有10 份為有限生長類型；從市場收集的12個商業(yè)種均為無限生長類型。122 份番茄材料中大多數(shù)植株生長勢強，葉片深綠色，葉量偏多，節(jié)間長度中等，花序以單花序為主，萼片包括基平、上翹、直立、上卷等幾種類型（王晶 等，2020），但未有包被類型；果色多數(shù)粉色，果形包括圓形、短橢圓形、橢圓形、卵圓形、梨形等，均耐裂，可溶性固形物含量為4.8%～10.0%。110 份自交系中，45 份風(fēng)味較好；12 個商業(yè)種中6 個風(fēng)味較好。綜合植株生長勢、果色、果形等表型可以看出，入選材料遺傳多樣性較為豐富。

表2 122 份櫻桃番茄材料的主要性狀特征

2.2 InDel 標(biāo)記多態(tài)性分析

利用從鮮食番茄和加工番茄重測序中篩選出的48 對核心InDel 標(biāo)記，對122 份櫻桃番茄材料進行分析。結(jié)果表明，48 對InDel 標(biāo)記在122 份櫻桃番茄材料中均能擴增出清晰條帶。48 對InDel 標(biāo)記擴增的等位基因數(shù)在2～4 之間，各標(biāo)記多態(tài)性信息量（PIC）在0.048 0～0.608 3 之間（表3），平均多態(tài)性信息量為0.472 3。

2.3 聚類分析

基于48 對核心InDel 標(biāo)記，將122 份櫻桃番茄材料分成3 個明顯的類群（圖1），其中第Ⅰ類群包括17 份材料，包含了粉喜、千禧、靚貝、圣桃T7、鳳珠、香妃12、香妃16、青春之歌、夏日陽光9 個商業(yè)種，而自交系材料較少；第Ⅱ類群包括38 份材料，僅包括釜山88 1 個商業(yè)種；第Ⅲ類群包括67 份材料，包含粉貝貝、粉貝妮2 個商業(yè)種，大多數(shù)自交系位于第Ⅱ和第Ⅲ類群中。

圖1 122 份櫻桃番茄材料的聚類分析結(jié)果

2.4 群體結(jié)構(gòu)與主成分分析

利用ADMIXTRUE 軟件進行最佳K值估算，以確定122 份櫻桃番茄材料的亞群數(shù)目。設(shè)置K值為1～20，CV_error 的值越小說明K值的結(jié)果越可靠，計算結(jié)果表明K為3 時，CV_error 的值最小（圖2-a），122 份櫻桃番茄材料分為3 個亞群。確定亞群數(shù)目后，對所有材料進行群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有材料均具有3 種遺傳背景，部分材料發(fā)生了基因相互滲入（圖2-b）。利用plink 軟件對122 份櫻桃番茄材料的遺傳組成進行主成分分析（圖2-c），結(jié)果表明12 個商業(yè)種中有11 個在48個位點多數(shù)呈現(xiàn)雜合，釜山88 幾乎為純合。

圖2 122 份櫻桃番茄材料的群體結(jié)構(gòu)與主成分分析結(jié)果

2.5 遺傳距離分析

利用48 對InDel 標(biāo)記對122 份櫻桃番茄材料進行遺傳距離分析。結(jié)果表明122 份材料中，C357與C358，C354 與C395 的遺傳距離為0，說明這些種質(zhì)有可能相同或者極其類似；C436 與C458，C436 與C464，C352、C393、C403、C412、C425、C450、C446 與香妃16，C446 與靚貝的遺傳距離最大，為0.886 cM；平均遺傳距離為0.473 cM。僅從遺傳距離來看，12 個商業(yè)種中粉喜與千禧遺傳距離為0.029 cM，說明二者比較相似。

2.6 組合配制與分析

通過田間綜合評價篩選，從420 個F1組合中篩選出綜合性狀優(yōu)良的組合10 個，對這些組合的遺傳距離進行了分析（表4），發(fā)現(xiàn)除組合C360 ×C374、C362 × C389、C362 × C391、C373 × C363外，其余組合的遺傳距離接近或大于平均遺傳距離0.473 cM。進一步分析C360 × C374、C362 ×C389、C362 × C391、C373 × C363 等4 個組合，發(fā)現(xiàn)這些組合入選的突出優(yōu)點是風(fēng)味好，產(chǎn)量較其他組合存在一定差異。

表4 10 個F1 組合的遺傳距離

2.7 DNA 指紋圖譜構(gòu)建

由于試驗所用48 對InDel 標(biāo)記在12 個櫻桃番茄商業(yè)種中都具有良好多態(tài)性，因此這48 對InDel標(biāo)記可以將12 個櫻桃番茄商業(yè)種完全區(qū)分開。同時對選出的綜合性狀優(yōu)良組合的親本進行DNA 指紋圖譜構(gòu)建，結(jié)果可以將這些材料完全區(qū)分開（表5）。利用這套標(biāo)準可以對櫻桃番茄種質(zhì)進行品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建。

表5 基于48 個InDel 分子標(biāo)記的12 個櫻桃番茄商業(yè)種和16 份櫻桃番茄自交系DNA 指紋圖譜

3 結(jié)論與討論

本試驗對中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組多年積累選育出的110 份櫻桃番茄核心育種材料和市場上收集到的12 個典型商業(yè)種，在初步表型評價的基礎(chǔ)上，重點利用從栽培種鮮食番茄和加工番茄重測序中挖掘和篩選鑒定出的48 對核心InDel 標(biāo)記進行遺傳多樣性分析。從生長類型、生長勢、葉量、花序、果形、果色等表型性狀來看，無論是選育出的110 份高代自交系還是12 個商業(yè)種，遺傳多樣性表現(xiàn)較為豐富；48對核心InDel 標(biāo)記在122 份櫻桃番茄材料中也呈現(xiàn)良好的多態(tài)性，與表型結(jié)果吻合。通過48 對核心InDel 標(biāo)記進一步進行聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析，均將122 份櫻桃番茄材料劃分為3 個明顯的類群；而李艷紅等（2021）依據(jù)表型將110 份櫻桃番茄種質(zhì)分為了5 個類群，史建磊等（2019）將21 份櫻桃番茄種質(zhì)分為4 個類群；通過重測序數(shù)據(jù)和馴化位點，Ranc 等（2008）將144 份櫻桃番茄種質(zhì)劃分為兩大類群。由于本試驗表型非精準鑒定，故未用于聚類分析。本試驗和Ranc 等（2008）的全基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果存在一定差異，有可能是分析角度不同所致。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)第Ⅲ類群包含材料最多，這可能與國內(nèi)櫻桃番茄品種仍以粉貝貝、粉貝妮類型種植為主相關(guān)，大多數(shù)品種為粉貝貝、粉貝妮類型，所以收集分離材料與粉貝貝、粉貝妮類似；而第Ⅰ類群中包含多個商業(yè)種，涉及國內(nèi)和國外的品種，國內(nèi)育成的品種與千禧等較為密切，青春之歌與夏日陽光接近，只有少數(shù)育成的高代自交系與這些商業(yè)種遺傳背景接近，說明在今后育種過程中應(yīng)加強對這些商業(yè)種的研究，以便于拓寬現(xiàn)有遺傳資源的背景。同時，對利用高代自交系配制的420 個組合進行綜合評價，篩選出10 個優(yōu)良新組合，其中4 個組合遺傳距離明顯低于平均遺傳距離，這些組合的特點是風(fēng)味較好；而其余6 個組合遺傳距離均接近或者大于平均遺傳距離，所以表現(xiàn)一定的雜種優(yōu)勢，特別是在產(chǎn)量方面表現(xiàn)明顯的優(yōu)勢，說明遺傳距離對于育種具有一定的參考價值。最后，利用48 對核心InDel 標(biāo)記分析了入選10 個組合的親本和12 個商業(yè)種，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記可以構(gòu)建清晰的指紋圖譜，可以很好地區(qū)分上述材料，對于將來品種身份鑒定及雜交種純度鑒定具有較好的效果。