水產(chǎn)暫養(yǎng)環(huán)境中副溶血性弧菌對(duì)重金屬與抗生素的抗性研究

＊謝家瑩 張紅敏,2,3 潘迎捷,2,3 趙勇,2,3 謝慶超,2,3*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海） 上海 201306 3.上海海洋大學(xué)食品質(zhì)量安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306）

隨著消費(fèi)者物質(zhì)生活水平的不斷提高，水產(chǎn)品的鮮活程度在消費(fèi)環(huán)節(jié)起到越來(lái)越重要的作用。因此提高水產(chǎn)品在暫養(yǎng)環(huán)節(jié)的成活率及品相是傳統(tǒng)批發(fā)市場(chǎng)、商超以及新型的網(wǎng)絡(luò)電商都要重點(diǎn)關(guān)注的。但是目前國(guó)家對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布于1989年，對(duì)于現(xiàn)在的鮮活水產(chǎn)?；钍侄螣o(wú)法做到有效防控[1-2]。副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）作為一種定殖腸道的病原菌，時(shí)常存在于蝦、蟹等海產(chǎn)品中，其所攜帶的耐藥基因隨可移動(dòng)遺傳元件（Mobile Genetic Element，MGE）在人體腸道菌群中傳播所造成的危害引起高度重視[3]。現(xiàn)在對(duì)副溶血性弧菌的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，其具有的耐藥譜非常豐富，對(duì)多種常見(jiàn)漁用藥具有抗生素抗性，包括常規(guī)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的例如喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)漁用藥[4-5]，以及氯霉素等禁用藥。葉靈瓊等[6]對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥研究中發(fā)現(xiàn)其在環(huán)境源和臨床源兩種不同來(lái)源的菌株中的耐藥譜很接近，有可能副溶血性弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)產(chǎn)生了抗生素抗性并通過(guò)MGE傳播給了致病性的副溶血性弧菌。本研究將評(píng)估水產(chǎn)品暫養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)及生物危害物污染情況，并通過(guò)分析分離得到的副溶血型弧菌的16 rDNA分型，以期找到二者的關(guān)聯(lián)性以及相互影響規(guī)律。

1.材料與方法

(1)材料與試劑

①材料

暫養(yǎng)水樣取自上海市江陽(yáng)水產(chǎn)市場(chǎng)和東方國(guó)際水產(chǎn)中心，共計(jì)取樣40份，命名為T(mén)WA1至TWA40。

②試劑

HPLC級(jí)濃硝酸與HPLC級(jí)乙酸（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），TSB（3% NaCl）培養(yǎng)基與TCBS培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），HPLC級(jí)乙腈（德國(guó)Merck公司）。

(2)儀器與設(shè)備

iCAP Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）和TSQ Quantum液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS-MS）（美國(guó)Thermo Scientific公司）；GG17旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；5331 PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）。

(3)方法

①暫養(yǎng)水中六種重金屬測(cè)定

參考《GB/T 5750.6—2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法金屬指標(biāo)》中水樣的檢測(cè)方法：水樣用濃硝酸配制成1%硝酸溶液后，由ICP-MS測(cè)定鉛、鎘、汞、砷、鈉、硼六種元素含量。

②暫養(yǎng)水中氨芐西林測(cè)定

A.暫養(yǎng)水中氨芐西林測(cè)定前處理

取水樣5mL置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，使用均質(zhì)器均質(zhì)1min后再用離心機(jī)在10000r/min，4℃離心10min，把上層提取液移至另一離心管中。再用10mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次的提取液，并向離心管中加入10mL乙腈飽和的正己烷，旋渦振蕩1min，棄掉上層。把下層提取液移至150mL雞心瓶中，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。加入2mL超純水溶解殘?jiān)暬靹?min后，過(guò)0.22μm濾膜，供LC-MS-MS測(cè)定。

③暫養(yǎng)水中副溶血性弧菌測(cè)定、毒力基因及16S rDNA測(cè)序

參考《GB 4789.7—2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》中的方法，對(duì)樣品中副溶血性弧菌進(jìn)行分離并富集培養(yǎng)，將分離得到的菌株進(jìn)行甘油管保藏。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取陽(yáng)性樣品菌株DNA，并用PCR進(jìn)行16S rDNA和毒力基因tdh、trh、tlh擴(kuò)增。得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，經(jīng)過(guò)blast比對(duì)確認(rèn)其是目的片段。

(4)統(tǒng)計(jì)分析

使用Oringin 9.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析做圖。

2.結(jié)果與分析

(1)暫養(yǎng)水中六種重金屬測(cè)定結(jié)果

從圖1可以看出，暫養(yǎng)水中鉛、鎘、汞、砷含量均低于標(biāo)準(zhǔn)限量值，而鈉的含量最高達(dá)到1224mg/mL，總計(jì)有27個(gè)（67.5%）樣品高于飲用水標(biāo)準(zhǔn)中200mg/mL的限量。而硼含量則有兩個(gè)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)中500ng/mL的限量值，其中TWA5達(dá)到850.6ng/mL，TWA7達(dá)到857.5ng/mL，濃度排第三的TWA31則只有372.7ng/mL，說(shuō)明前兩個(gè)硼含量遠(yuǎn)高于其他樣品。

圖1 暫養(yǎng)水中六種重金屬濃度(a)Pb, Cd, Hg, As; (b)Na, BFig.1 Concentration of six heavy metals in temporary water

(2)暫養(yǎng)水中氨芐西林測(cè)定結(jié)果

①質(zhì)譜條件優(yōu)化及離子對(duì)選擇

在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）下優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，提高其響應(yīng)值（見(jiàn)圖2）。其中定性離子對(duì)（m/z）為：350/192；定量離子對(duì)（m/z）為：350/114，350/118，350/173.5。

圖2 氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖Fig.2 Ampicillin standard ion chromatogram

②暫養(yǎng)水上機(jī)檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果表明：40個(gè)暫養(yǎng)水樣品中只有一個(gè)樣品TWA18（鯽魚(yú)暫養(yǎng)水）檢出氨芐西林，濃度為0.323 ng/mL，見(jiàn)圖3。

圖3 樣品TWA18色譜信息(a)chromatogram; (b)standard curveFig.3 Chromatographic information of sample TWA18

(3)暫養(yǎng)水中副溶血性弧菌污染情況測(cè)定

經(jīng)生化及分子生物學(xué)鑒定，40個(gè)樣品中有8個(gè)樣品副溶血性弧菌陽(yáng)性。共涉及四種水產(chǎn)品的8份暫養(yǎng)水，檢出率為20%。其中：2份烏鱧暫養(yǎng)水檢出副溶血性弧菌，占烏鱧暫養(yǎng)水的100%；3份鯽魚(yú)暫養(yǎng)水檢出副溶血性弧菌，占鯽魚(yú)暫養(yǎng)水的37.5%；2份大菱鲆暫養(yǎng)水檢出副溶血性弧菌，占大菱鲆暫養(yǎng)水的25%；1份鱖魚(yú)暫養(yǎng)水檢出副溶血性弧菌，占鱖魚(yú)暫養(yǎng)水的25%。

3.討論

從暫養(yǎng)水重金屬與抗生素本底調(diào)查來(lái)看：首先，鉛、鎘、汞、砷含量符合《GB 11607—1989漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》[7]中的規(guī)定。鈉含量偏高則是由于商戶(hù)會(huì)向暫養(yǎng)水中施加海水晶以起到凈水?；畹哪康模c含量過(guò)高（本研究中最高是飲用水標(biāo)準(zhǔn)的6.12倍）對(duì)魚(yú)體本身有多大影響，以及對(duì)魚(yú)體內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而是否會(huì)影響到抗性基因的轉(zhuǎn)移傳播，值得進(jìn)一步進(jìn)行研究；其次，暫養(yǎng)水中硼含量略高于飲用水中限量值，可能是有商戶(hù)向暫養(yǎng)水中添加硼砂以起到殺菌、清潔的作用[8]，中國(guó)《食品衛(wèi)生法》[9]和《食品添加劑衛(wèi)生管理辦法》[10]，明令禁止將硼砂作為食品添加劑使用，然而漁業(yè)水質(zhì)國(guó)標(biāo)中沒(méi)有做相關(guān)規(guī)定，這給了一些商販鉆法律漏洞的可乘之機(jī)，而且此國(guó)標(biāo)距今已30年整，有一定修訂的必要；最后，氨芐西林檢測(cè)結(jié)果中有一個(gè)樣品檢出氨芐西林說(shuō)明人用抗生素有向水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)，但目前還不是普遍現(xiàn)象。封永輝等[11]對(duì)漁用藥物使用中的亂象做了調(diào)研，也發(fā)現(xiàn)有的漁藥或獸藥企業(yè)直接將人用抗生素作為新品漁藥使用的現(xiàn)象。而如果水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)長(zhǎng)期使用人用抗生素進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)化出超級(jí)耐藥細(xì)菌并通過(guò)某種途徑感染人類(lèi)，會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成非常大的威脅[11]。