熱水解污泥酸化液碳氮磷對PHA合成的影響

賀 赟,李魁曉*,姜大偉,常 菁,郝 姍,王 剛,王佳偉

熱水解污泥酸化液碳氮磷對PHA合成的影響

賀 赟1,2,李魁曉1,2*,姜大偉1,2,常 菁1,郝 姍1,王 剛1,2,王佳偉1,2

(1.北京城市排水集團(tuán)有限責(zé)任公司,北京 100044；2.北京市污水資源化工程技術(shù)研究中心,北京 100124)

基于熱水解污泥酸化液定向馴化得到了穩(wěn)定的PHA合成混合菌體系,分析了菌群特征與結(jié)構(gòu),研究了限制氮、磷、非揮發(fā)性脂肪酸(non-VFAs)物質(zhì)和補(bǔ)料方式對PHA合成率以及相關(guān)組分對菌群活性的影響.結(jié)果表明,利用熱水解污泥酸化液合成PHA的特有混合菌體系中優(yōu)勢菌屬短枝單胞菌屬()占45%.限制酸化液中NH+ 4-N濃度PHA合成率從22wt%提高至25wt%,限制non-VFAs不僅PHA合成率可提升27%同時(shí)合成速率也提升了25%.酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P和non-VFAs未對PHA合成菌群活性造成顯著影響,但是高濃度揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)會對菌群活性造成抑制.為降低高濃度VFAs的抑制采取分批補(bǔ)料策略可提高PHA合成率,分批補(bǔ)料(5次)PHA最大合成率較一次補(bǔ)料的28wt%提升至34wt%.因此,通過提高酸化液中VFAs占比及優(yōu)化補(bǔ)料方式均可提升PHA合成率,熱水解污泥酸化液生物合成PHA在未來工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)具有很大發(fā)展前景.

混合菌群；熱水解污泥；聚羥基脂肪酸酯；揮發(fā)性脂肪酸

聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種可由微生物合成的性能良好、用途廣泛的生物全降解塑料[1],降解后最終產(chǎn)物為水和CO2,可作為石油基塑料的替代品[2].當(dāng)生長環(huán)境中碳源充足而必要的營養(yǎng)物質(zhì)如氮、磷、鎂等缺乏時(shí),可促進(jìn)細(xì)菌對PHA的合成[3-4].目前,PHA的工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)主要基于純培養(yǎng),純培養(yǎng)過程主要利用葡萄糖、油類、有機(jī)酸等為原料,生產(chǎn)工藝中的原料及無菌過程大大增加了PHA生產(chǎn)成本從而制約其大規(guī)模應(yīng)用[5～7].為了解決PHA生產(chǎn)原料與滅菌過程增加成本的問題,研究者利用各種廢棄有機(jī)物及其水解產(chǎn)物代替精制原料作為碳源[7-8]降低生產(chǎn)原料費(fèi)用、采用活性污泥中混合菌群代替純菌種降低滅菌費(fèi)用,從而消減PHA生產(chǎn)成本[9].

我國污水處理過程產(chǎn)生的剩余污泥體量巨大,其“污染”與“資源”屬性共存,剩余污泥中有機(jī)質(zhì)豐富,從剩余污泥中發(fā)酵獲得揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)是合成PHA的優(yōu)良碳源[10-11],利用剩余污泥生產(chǎn)PHA可同時(shí)解決原料費(fèi)用高和污泥資源化問題,具有較高的經(jīng)濟(jì)及環(huán)境效益[12].目前混合菌種利用污泥為基質(zhì)的PHA合成率僅為20wt%～60wt%[10,12-13],而工業(yè)化生產(chǎn)中純菌利用精制原料的PHA合成率>75wt%[14],PHA合成率低會增加后續(xù)提取廢物及提取費(fèi)用[15].為提高以污泥為基質(zhì)的PHA合成率需提高污泥中有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為VFAs的效率,相比堿性、超聲、微波等預(yù)處理方式熱水解是目前商業(yè)化最成熟的預(yù)處理方式[16-17].熱水解預(yù)處理將污泥在160～ 180℃加熱30～60min可通過破碎污泥絮體將胞內(nèi)有機(jī)質(zhì)溶解到液體中從而促進(jìn)后續(xù)的污泥產(chǎn)酸[17-18].污泥熱水解后發(fā)酵產(chǎn)酸的VFAs產(chǎn)量比原污泥提高44%～100%[16,19],因此利用熱水解污泥酸化液合成PHA具有很好的應(yīng)用前景.

熱水解預(yù)處理提高酸化液中VFAs濃度的同時(shí)也提高了體系中氨氮、正磷酸鹽及其他non- VFAs物質(zhì)的濃度,這些non-VFAs由生物可降解有機(jī)物(如蛋白質(zhì)和碳水化合物)和不易降解物質(zhì)(如類黑素)組成,已被證明可用于細(xì)胞生長不利于PHA合成[20-21].現(xiàn)有研究缺乏對酸化液底物組分與生物合成PHA之間具體關(guān)聯(lián)性的分析,相關(guān)組分對PHA合成的影響不明確.本研究以熱水解污泥酸化液為底物,定向馴化PHA合成混合菌體系并分析其菌群特征,探討不同組分濃度酸化液合成PHA的特征及其碳氮磷濃度對PHA合成及菌群活性的影響,并提出優(yōu)化措施以提高PHA的合成率,旨在為熱水解污泥合成PHA提出技術(shù)優(yōu)化策略和理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污泥來源 試驗(yàn)所需熱水解污泥、活性污泥和厭氧消化污泥均取自北京某市政污水處理廠.

1.1.2 熱水解污泥酸化液 在500L厭氧發(fā)酵罐參照Zhang等[16]的方法在35℃開展熱水解污泥厭氧酸化,酸化污泥通過0.45μm陶瓷膜過濾后得到熱水解污泥酸化液.

1.1.3 不同組分濃度熱水解污泥酸化液 活性污泥在好氧條件對碳氮磷的需求C:N:P為100:5:1[22],研究者通過調(diào)控CNP比例(C:N為125～3333,C:P為250～66667)提升PHA合成率[19,22-23].調(diào)節(jié)熱水解污泥酸化液pH值至11,在30℃用空氣吹脫氨得到限制氮的酸化液(化學(xué)需氧量(COD):NH+ 4-N為187);調(diào)節(jié)pH值至9添加一定量MgCl2攪拌后離心得到限制磷的酸化液(COD:PO43--P為1873);配置與酸化液中VFAs比例一致的配水添加到酸化液中得到限制non-VFAs的酸化液(VFAs配水與酸化液體積比為3:1)[21].調(diào)節(jié)不同酸化液pH值至7備用.不同酸化液基本指標(biāo)見表1.

表1 不同酸化液基本信息

1.2 方法

1.2.1 PHA合成菌群馴化方法 以熱水解污泥酸化液為底物,以污水處理廠活性污泥為接種污泥,逐步提升底物濃度,參照Zhang等[16]以豐盛-饑餓模式(豐盛期碳源充足,饑餓期碳源匱乏)進(jìn)行PHA合成菌群馴化,其中豐盛-饑餓期的時(shí)間比為1:3.

1.2.2 PHA合成方法 反應(yīng)器為4個(gè)有效容積為5L的序批式反應(yīng)器,底物為1.1.2所制備的酸化液,接種污泥為1.2.1馴化得到的合成菌群.控制接種量使初始污泥質(zhì)量濃度為2000mg/L,豐盛期溶解氧控制在0.5～2mg/L,反應(yīng)溫度為30℃,一個(gè)PHA合成周期約1d(其中豐盛期約5h).

底物利用與PHA合成試驗(yàn):底物為4種酸化液(表1)每天定時(shí)補(bǔ)料1次.定時(shí)取樣測定VFAs、PHA、細(xì)胞干重(DCW)和三磷酸腺苷(ATP)等指標(biāo),其中ATP測定對照組為未添加酸化液的污泥質(zhì)量濃度為2000mg/L的混合污泥.

分批補(bǔ)料PHA合成試驗(yàn):底物為V組濾液,每天在豐盛期每隔1h補(bǔ)料1次共補(bǔ)料5次.定時(shí)取樣測定VFAs、PHA和SCOD等指標(biāo).

1.2.3 VFAs濃度對菌群活性影響的測評方法 配置與酸化液中VFAs比例一致的配水,在4個(gè)2L燒杯(反應(yīng)體積1L)中分別加入VFAs為250mg COD、625mg COD、1250mg COD、2500mg COD的配水,參照原始酸化液中碳氮磷比例以COD為250mg/L計(jì)算添加NH4Cl和KH2PO4至各燒杯中并調(diào)節(jié)pH值至7,加入混合菌群及蒸餾水調(diào)節(jié)初始污泥質(zhì)量濃度為2000mg/L,定時(shí)取樣測定體系A(chǔ)TP,其中ATP測定對照組參見1.2.2.

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 常規(guī)理化指標(biāo)檢測 COD測定使用快速消解分光光度法(DR3900,HACH,美國), TN、TP和正磷酸鹽(PO3- 4-P)的測定參見[GB/T 11893-1989],氨氮(NH+ 4-N)的測定參見[HJ 535-2009].

1.3.2 VFAs及PHA檢測 VFAs、PHA和DCW檢測方法參見Jia等[11],其中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的COD當(dāng)量轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為:1.07、1.51、1.82和2.04.

1.3.3 ATP檢測 ATP濃度可用于微生物受不同環(huán)境影響的活性評估[24],使用 Luminultra Technologies公司的 QuenchGone21 Wastewater (QG21W?)試劑包檢測體系總ATP和胞外ATP,并計(jì)算胞內(nèi)ATP質(zhì)量濃度和生物威脅指數(shù)(BSI)[25].

1.3.4 混合菌群高通量測序 采用引物對338F(5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GG- ACTACHVGGGTWTCTAAT-3')通過Illumina Miseq測序平臺完成樣品細(xì)菌16S rRNA高通量測序[26].

2 結(jié)果與討論

2.1 PHA合成菌群特征

馴化前后細(xì)菌群落α多樣性如表2所示.馴化前后樣品中代表物種覆蓋度的細(xì)菌群落Coverage均為0.99,表明本次測序結(jié)果代表了樣本中細(xì)菌的真實(shí)情況.Observed OUTs(實(shí)際觀察到的OUT數(shù))和Chao指數(shù)與細(xì)菌的豐富度呈正相關(guān),Shannon指數(shù)與微生物的多樣性呈正相關(guān).馴化后檢測到的OUT數(shù)目較馴化前的1132減少到815,降低28.0%;馴化后細(xì)菌的Chao與Shannon指數(shù)也表現(xiàn)出相似的規(guī)律,分別下降29.6%和38.8%,表明通過定向馴化后混合菌群的細(xì)菌群落豐富度和多樣性顯著下降.馴化過程適應(yīng)熱水解污泥酸化液為底物而且能合成PHA的菌群得到大量增殖,而不適應(yīng)底物及培養(yǎng)模式的微生物會被限制或逐漸淘汰[27].

表2 細(xì)菌群落α多樣性

注:各列中字母表示統(tǒng)計(jì)分析的顯著性,相同字母表示不顯著,不同字母表示在=0.05水平上顯著.

圖1 馴化前后菌群結(jié)構(gòu)

馴化前、后的混合菌群在門和屬水平上的優(yōu)勢菌屬相對豐度見圖1(a)(b),馴化后優(yōu)勢菌門變形菌門(Proteobacteria)由29.16%增加到65.03%,馴化后優(yōu)勢菌屬短枝單胞菌屬()由0.82%增加到45.40%占據(jù)主導(dǎo)地位,屬于Proteobacteria下的-變形菌綱(-proteobacteria);馴化前后樣本中共有菌屬占比40.06%,經(jīng)過馴化混合菌群中還新增了23.66%的特有菌屬(圖1(c)).是典型的PHA合成菌屬,在利用含VFAs的廢水合成PHA的混合菌群中占優(yōu)勢地位[16,27-28].結(jié)果表明通過特定底物、培養(yǎng)方式可以馴化得到利用熱水解污泥酸化液合成PHA以為優(yōu)勢菌屬的混合菌群.

2.2 酸化液各組分濃度對PHA合成的影響

PHA在微生物體內(nèi)的合成通常認(rèn)為是由于生長不平衡導(dǎo)致的溢出代謝[3-4],為考察限制氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)對混合菌群合成PHA的影響,開展利用不同條件熱水解污泥酸化液(限制NH+ 4-N、限制PO3- 4-P、限制non-VFAs)合成PHA研究,相關(guān)PHA合成情況見圖2.

限制non-VFAs組的VFAs在4h內(nèi)消耗完,其他組在5h內(nèi)消耗完(圖2(a)),表明non-VFAs的存在會影響體系對VFAs的利用,與Tu等[21]研究結(jié)果一致.4組試驗(yàn)NH+ 4-N和PO3- 4-P的利用情況如圖2(b)(c)所示,高濃度NH+ 4-N組(原液與限制磷)在6h內(nèi)對NH+ 4-N利用規(guī)律相似,去除約65mg/L NH+ 4-N,低濃度NH+ 4-N組(限制氮與限制non-VFAs)對NH+ 4-N利用不顯著;高濃度PO3- 4-P組(原液與限制磷)在6h內(nèi)對PO3- 4-P利用規(guī)律相似,去除約4mg/L PO3- 4-P,低濃度PO3- 4-P組(限制磷與限制non-VFAs)對PO3- 4-P利用不顯著.這一結(jié)果與Tu等[29]研究結(jié)果類似,氮磷濃度較低時(shí)微生物合成PHA過程幾乎不利于氮磷,低氮磷條件下(在本文中低NH+ 4-N為55mg/L及以下,低PO3- 4-P條件為4.5mg/L及以下)與之對應(yīng)的微生物對氮磷的利用速率很緩慢.圖2(d)展示了利用不同底物的PHA合成率,限氮組相比對照組將COD: NH+ 4-N由14提升至187與之對應(yīng)的PHA最高合成率由22wt%提升至25wt%,限磷組的PHA最高合成率與對照組不存在顯著性差異.許多研究表明,限制氮磷會促進(jìn)PHA的合成[22,30],限磷組的PHA合成率未顯著提升是因?yàn)閷φ战M的磷已經(jīng)較低COD:PO3- 4-P為239(為保障出水穩(wěn)定達(dá)標(biāo),污水廠在生物池增加化學(xué)除磷,化學(xué)沉析產(chǎn)生的磷酸鹽沉淀使污泥中微生物胞內(nèi)磷濃度較生物除磷低),進(jìn)一步限制磷并不能再提升PHA合成率[29].限制non-VFAs組的PHA合成率在3h達(dá)到峰值為28wt%顯著高于其他3組且較對照組提升27%、合成速率較其他組縮短25%,本研究中限制non-VFAs組VFAs占COD的74%、其他3組僅占47%,占比超過30%的non-VFAs會降低PHA合成率,此結(jié)果與Jia等[20]研究一致,因?yàn)樘穷惡偷鞍踪|(zhì)等non-VFAs會促進(jìn)細(xì)胞自身生長而不是合成PHA.在VFAs充足即碳源豐盛期細(xì)菌吸收VFAs合成PHA并在豐盛期末達(dá)到峰值,在VFAs匱乏即饑餓期細(xì)菌降解體內(nèi)PHA維持生命活動(dòng)(圖2(a)(d)),PHA合成量達(dá)到峰值又下降的現(xiàn)象與多數(shù)研究一致[11,16,21,31].結(jié)果表明通過限制熱水解污泥酸化液中NH+ 4-N濃度可提升PHA合成率,限制non-VFAs不僅可提升PHA合成率同時(shí)也能提升合成速率.

2.3 酸化液各組分濃度對菌群活性的影響

2.3.1 碳氮磷濃度對菌群活性的影響 為探究熱水解污泥酸化液中高濃度營養(yǎng)元素(VFAs、non- VFAs、氮和磷等)是否影響菌群活性從而影響PHA合成,在PHA合成過程監(jiān)測混合菌群ATP并計(jì)算得到體系胞內(nèi)ATP及BSI見圖3.

補(bǔ)料后體系胞內(nèi)ATP由1200ng/mL降至約900ng/mL表明混合菌群活性變差,體系BSI由15%上升至21%表明混合菌群受到生物威脅指數(shù)變大,4組酸化液均對混合菌群造成了瞬時(shí)沖擊、微生物受到抑制或死亡[24,32].4組酸化液對混合菌群胞內(nèi)ATP及BSI的影響規(guī)律無顯著性差異,4組體系的混合菌群活性均在1.5h恢復(fù)至補(bǔ)料前水平且活性持續(xù)上升至1400ng/mL、生物威脅對應(yīng)下降至13%,表明在本研究中酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs組分未對混合菌群造成顯著的毒性抑制(本研究中NH+ 4-N濃度為240mg/L及以下,PO3- 4-P濃度為15mg/L及以下,non-VFAs/COD為48%及以上),有研究表明1500mg/L 氨氮會使厭氧消化系統(tǒng)微生物代謝受到抑制[33],本研究熱水解污泥酸化液的氮磷濃度適于微生物代謝.

2.3.2 VFAs濃度對菌群活性的影響 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn),本研究酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs組分未對混合菌群活性造成顯著的影響,因此開展不同濃度VFAs對菌群活性影響的測評,結(jié)果如圖4所示.

補(bǔ)料250和625mg COD/L VFAs后體系胞內(nèi)ATP和BSI無顯著變化,表明此質(zhì)量濃度的VFAs未對混合菌群造成抑制影響.補(bǔ)料1250和2500mg COD/L VFAs后體系胞內(nèi)ATP由1322ng/mL分別降至963ng/mL和650ng/mL,體系BSI由18%分別上升至21%和23%.結(jié)果表明高濃度的VFAs會使混合菌群活性受到抑制,有研究表明高濃度VFAs會抑制厭氧消化的微生物[34]且高濃度底物易使PHA合成菌群性能變差[35-36],后期可通過分批補(bǔ)料方式減少底物對體系的抑制以促進(jìn)混合菌群活性[9].

2.4 補(bǔ)料方式對PHA合成的影響

Serafim等[9]研究表明,一次性補(bǔ)入高濃度底物會對微生物活性造成抑制,因此可通過分批補(bǔ)料的方式克服底物抑制.采用限制non-VFAs的熱水解污泥酸化液作為底物,通過改變補(bǔ)料方式研究其對PHA合成的影響.在一個(gè)PHA合成周期內(nèi),酸化液經(jīng)過5批次補(bǔ)料加入體系,結(jié)果如圖5所示,酸化液中不易利用的COD逐漸累積,在6h VFAs被消耗完時(shí)仍有500mg 的累積,后續(xù)可通過在每一周期末排水以減少難利用COD的影響[31].經(jīng)過5次補(bǔ)料后PHA合成率在5h達(dá)到峰值為34wt%(其中PHB:PHV為2.1),停止補(bǔ)料1h后菌體PHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降(圖5(b)).停止補(bǔ)料1h后底物中可利用碳源匱乏,菌群會消耗體內(nèi)PHA維持生命活動(dòng)導(dǎo)致菌體PHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降,與2.2節(jié)結(jié)果及先前報(bào)道結(jié)果一致[11,16,21,31].分5次補(bǔ)料PHA最大合成率可達(dá)34wt%,結(jié)果表明采取分批補(bǔ)料可以提升體系PHA的最高合成率,此結(jié)果與Tu等[21]和Serafim等[9]的研究類似,通過分批次補(bǔ)料PHA合成率可提升20%～30%.

3 結(jié)論

3.1 基于熱水解污泥酸化液定向馴化得到穩(wěn)定的PHA合成混合菌體系,其中優(yōu)勢菌屬短枝單胞菌屬()占45%,此混菌體系中限制和淘汰了不能合成PHA的微生物因此細(xì)菌群落的豐富度和多樣性相比馴化前顯著下降.

3.2 利用不同條件熱水解污泥酸化液(限制NH+ 4-N、限制PO3- 4-P、限制non-VFAs)合成PHA,限制酸化液中NH+ 4-N濃度PHA合成率從22wt%提高到25wt%,限制non-VFAs不僅PHA合成率可提升27%同時(shí)合成速率也提升了25%.

3.3 高濃度熱水解污泥酸化液補(bǔ)料后會對體系造成瞬時(shí)沖擊,本研究酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs組分未對混合菌群活性造成顯著的影響,但高濃度VFAs會對菌群活性造成抑制.

3.4 采取分批補(bǔ)料可提高體系PHA合成率,分批補(bǔ)料(5次)PHA最大合成率較一次補(bǔ)料的28wt%可提升至34wt%.

3.5 熱水解污泥酸化液生物合成PHA工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)可通過提高酸化液中VFAs占比及優(yōu)化補(bǔ)料方式提升PHA合成率.

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Effects of carbon, nitrogen and phosphorus in fermented thermal-hydrolyzed sludge on polyhydroxyalkanoates production.

HE Yun1,2, LI Kui-xiao1,2*, JIANG Da-wei1,2, CHANG Jing1, HAO Shan1, WANG Gang1,2, WANG Jia-wei1,2

(1.Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100044, China；2.Beijing Engineering Research Center of Wastewater Resource, Beijing 100124, China)., 2023,43(10)：5181～5187

Based on the domestication of the acid liquor of fermented thermal-hydrolyzed sludge, the mixed microbial cultures for producing PHA were obtained and its characteristics were explored. The influence mechanism of feeding method and composition (i.e., N, P, non-VFAs) of the acid liquor on the PHA yield and microbial activity were also investigated. Specifically, the predominant Brachymonas accounted for 45% of the unique mixed microbial cultures that yield PHA. The PHA productivity was improved from 22wt% to 25wt% by limiting the concentration of NH+ 4-N in the acid liquor. By limiting the concentration of non-VFAs, not only the PHA productivity was improved 27% but also the production efficiency was improved 25%. Microbial activity was not effected significantly by non-VFAs、NH+ 4-N and PO3- 4-P in acid liquor while was obviously restrained by volatile fatty acids (VFAs) with high concentration. To mitigate inhibition of VFAs and improve the PHA yield, intermittent feeding (5times) strategy was used. The PHA yield was effectively improved to 34wt% compared with 28wt% in disposable feeding. Furthermore, the PHA yield was improved by increasing the VFAs proportion in the acid liquor and optimizing the feeding method. The production of PHA by microorganism from fermented thermal-hydrolyzed sludge will be great promise in future industrialization.

mixed microbial cultures；thermal-hydrolyzed sludge；polyhydroxyalkanoates (PHA)；volatile fatty acids (VFAs)

X705

A

1000-6923(2023)10-5181-07

2023-02-24

* 責(zé)任作者, 教授級高級工程師, kuixiao_li@163.com

賀 赟(1992-),女,陜西西安人,工程師,碩士,主要從事污水治理與資源化研究.發(fā)表論文5篇.heyun1116@163.com.

賀 赟,李魁曉,姜大偉,等.熱水解污泥酸化液碳氮磷對PHA合成的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2023,43(10):5181-5187.

He Y, Li K X, Jiang D W, et al. Effects of carbon, nitrogen and phosphorus in fermented thermal-hydrolyzed sludge on polyhydroxyalkanoates production [J]. China Environmental Science, 2023,43(10):5181-5187.