DNA條形碼在浙江省蜉蝣目稚蟲(chóng)昆蟲(chóng)多樣性中的應(yīng)用

高亞杰, 張立華, 陳 敏, 樂(lè)傅凱麗, 張加勇

(1.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 新疆 阿克蘇 843000; 2.泰順縣自然資源和規(guī)劃局, 浙江 溫州 325500; 3.永康市野生動(dòng)植物保護(hù)管理站, 浙江 永康 321300; 4.浙江師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004)

0 引言

【研究意義】蜉蝣目(Ephemeroptera)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、六足總綱(Hexapoda)、昆蟲(chóng)綱(Insecta)?，F(xiàn)今世界已報(bào)道的蜉蝣目昆蟲(chóng)有37科376屬3 085種[1-3]。截止2022年10月,中國(guó)報(bào)道了21科307種蜉蝣,其中,臺(tái)灣地區(qū)特有的58種,除去臺(tái)灣特有種,大陸蜉蝣種類249種。浙江省蜉蝣種共有13科34屬62種,其中,22種蜉蝣只報(bào)道了成蟲(chóng)單一階段[4-17]。蜉蝣目昆蟲(chóng)是對(duì)水質(zhì)最為敏感的三大水生昆蟲(chóng)(蜉蝣目、毛翅目、襀翅目)之一[18],同時(shí)蜉蝣是公認(rèn)的可以應(yīng)用于生態(tài)研究與生物監(jiān)測(cè)研究的昆蟲(chóng)[19],在EPT法和全生物法等監(jiān)測(cè)水質(zhì)的主要方法中起重要作用。這類昆蟲(chóng)一般生活于未污染水體中[20],其稚蟲(chóng)是流動(dòng)清潔水體的主要底棲昆蟲(chóng),對(duì)水質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)鹽、重金屬、溫度、pH和溶解氧等極為敏感[21]。此外,不同種類的蜉蝣對(duì)水體耐污值不同,如細(xì)蜉科(Caenidae)突唇蜉屬(Clypeocaenis)的蜉蝣耐污值較高;小蜉科(Ephemerellidae)天角蜉屬(Uracanthella)、鱟蜉科(Prosopistomatidae)鱟蜉屬(Prosopistoma)等蜉蝣耐污值較低。在水體質(zhì)量的生物學(xué)評(píng)價(jià)工作中,蜉蝣目種類和數(shù)量的變動(dòng)能準(zhǔn)確反映水質(zhì)的變化和污染程度,對(duì)蜉蝣目生物多樣性的研究有利于水質(zhì)監(jiān)控的研究[22]。然而,蜉蝣種類的形態(tài)鑒定由于稚蟲(chóng)和成蟲(chóng)發(fā)育階段差異、雌雄差別等難題,造成蜉蝣分類困難,需要大量的樣本材料并經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的人員才能完成分類,從而制約了利用蜉蝣在水質(zhì)監(jiān)控中的應(yīng)用。因此,在蜉蝣目昆蟲(chóng)多樣性研究中應(yīng)用分子手段將有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DNA條形碼技術(shù)可以作為生物鑒別的一種快速補(bǔ)充工具,有效解決形態(tài)學(xué)鑒定的難題[23]。在昆蟲(chóng)分類中,DNA條形碼技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[24]。這種以序列為基礎(chǔ)的鑒定方法可使研究者客觀地獲取數(shù)據(jù),不受生物體發(fā)育階段的影響[25],避免了稚蟲(chóng)和成蟲(chóng)形態(tài)差異大造成鑒定上的爭(zhēng)議,有效彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定方法上的不足[26]。利用DNA條形碼進(jìn)行物種分類研究時(shí),通常選擇線粒體COI基因[27]。因其具母性遺傳、基因重組率低、遺傳差異高、進(jìn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)[28-30]。COI基因在確定隱存物種方面也具有較多的應(yīng)用,如STAHLS等[31]用COI條形碼證明了蜉蝣目中存在的隱存多樣性;張媛等[32]運(yùn)用COI基因?qū)η食崮坷ハx(chóng)探究了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;STIGENBERG[33]通過(guò)28S和COI 2個(gè)分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了繭蜂的隱存種;FREY等[34]以COI序列為手段發(fā)現(xiàn)入侵物種實(shí)蠅中存在隱存復(fù)合體;張明等[35]利用COI基因片段結(jié)合雄性成蟲(chóng)尾器形態(tài)特征,對(duì)雙翅目麻蠅屬54個(gè)種30個(gè)亞屬進(jìn)行分類初步探明,各亞屬的分類地位以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;YAAKOP等[36]探討束蛾物種的生命周期時(shí)借助COI基因發(fā)現(xiàn)束蛾隱存種;FAILLA等[37]綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)與COI條形碼的手段,試圖鑒定幾種未知蚊類幼蟲(chóng)的種類,最終確定這些幼蟲(chóng)是搖蚊科昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)。COI基因已被證明適用于大范圍的生物類群的識(shí)別,并在水生昆蟲(chóng)中大量應(yīng)用[38],特別在物種多樣性研究中能夠快速準(zhǔn)確的鑒定,有效發(fā)現(xiàn)隱種?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】DNA條形碼技術(shù)不受生物體發(fā)育階段的影響,使用標(biāo)準(zhǔn)化的分子標(biāo)記進(jìn)行物種準(zhǔn)確鑒定的技術(shù),利用序列作為標(biāo)記與物種信息建立對(duì)應(yīng)關(guān)系,彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的難題?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用形態(tài)與分子相結(jié)合的方法分析浙江省內(nèi)蜉蝣目稚蟲(chóng)昆蟲(chóng)多樣性,并與之前浙江省已報(bào)道的蜉蝣目昆蟲(chóng)進(jìn)行比較,以系統(tǒng)地了解浙江省蜉蝣目昆蟲(chóng)資源及其多樣性,為開(kāi)展利用蜉蝣監(jiān)控浙江省各地水質(zhì)狀況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在浙江省各縣市共設(shè)102個(gè)樣點(diǎn),含以往采集過(guò)蜉蝣的30樣點(diǎn)。于2016年7月至2022年9月,利用踢網(wǎng)法采集蜉蝣。采集的蜉蝣置于85%酒精中保存,并將各蜉蝣樣本的采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、采集人等詳細(xì)信息記錄在冊(cè),并匯總制表。將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后,保存于-20 ℃冰箱內(nèi),以便后期鑒定使用。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 在體視顯微鏡(Nikon SMZ800)下對(duì)采集到的各樣本進(jìn)行觀察、解剖、形態(tài)鑒定并拍照。將鑒定后的蜉蝣按地點(diǎn)、科、屬、種等分揀入不同的塑料小瓶中,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 DNA提取 取形態(tài)鑒定到種的蜉蝣樣品置于1.5 mL(或2 mL)Eppendorf 管中,使用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)]抽提總DNA(具體提取過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行),提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 PCR反應(yīng)及測(cè)序 參照引物FY-C1-J-1751:GGDGCYCCHGAYATRGCNT TYCC,FY-C1-N-2329:ACDGTAAAYATR TGRTGDGCYCA[39]。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 5 μL,dNTP Mixture 5 μL,模板DNA 1 μL,上下游引物各2 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,無(wú)菌水補(bǔ)至50 μL。在MJ-Mini PCR儀(BIO-RAD)或Eppendorf PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s,48 ℃/46 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工切膠純化、雙向測(cè)序。對(duì)所獲得的核苷酸序列進(jìn)行密碼子各位點(diǎn)堿基替換偏好性分析,排除核基因組中mtDNA假基因的可能。

1.2.4 遺傳距離分析 將測(cè)序結(jié)果在DNAstar的SeqMan中進(jìn)行相應(yīng)序列校對(duì)。采用MAGE5.05對(duì)蜉蝣目不同種的COI序列進(jìn)行比對(duì),計(jì)算變異位點(diǎn)數(shù)、堿基含量,并以Kimura 2-parameter(K2p)為模型[40],計(jì)算各個(gè)已測(cè)序蜉蝣目樣本間遺傳距離。結(jié)合形態(tài)與分子的鑒定結(jié)果,統(tǒng)計(jì)浙江省蜉蝣的遺傳多樣性,分析形態(tài)學(xué)上鑒定的種類與分子(遺傳距離)上鑒定種類是否存在差別以及產(chǎn)生這些差別的原因。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)生分析 選用石蛃昆蟲(chóng)作為外群,結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已知蜉蝣的COI基因序列,以及在浙江省采集樣本的COI基因序列(以FASTE格式保存),獲得相應(yīng)的數(shù)據(jù)集,采用Mega5.05軟件,以Kimura 2-parameter為模型,包含轉(zhuǎn)換和顛換,Gamma分布,其余默認(rèn)參數(shù),數(shù)據(jù)集構(gòu)建鄰接法(NJ)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[41]。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江省蜉蝣形態(tài)種類

基于形態(tài)鑒定后確立的蜉蝣種類44種(2個(gè)蜉蝣種由于分子數(shù)據(jù)不全,未統(tǒng)計(jì)),包括: 1)細(xì)裳蜉科:寬基蜉屬(宜興寬基蜉、安徽寬基蜉、面寬基蜉),柔裳蜉屬(紫金柔裳蜉);2)四節(jié)蜉科:四節(jié)蜉屬(紅柱四節(jié)蜉、小刺四節(jié)蜉、黑斑四節(jié)蜉),麗翅蜉屬(逸仙麗翅蜉、納氏麗翅蜉);花翅蜉屬(三刺花翅蜉)、假二翅蜉屬(黑脈假二翅蜉、紫假二翅蜉),黑四節(jié)蜉屬(紫眼黑四節(jié)蜉); 3)扁蜉科:扁蜉屬(紅背扁蜉、黑扁蜉),似動(dòng)蜉屬(斜紋似動(dòng)蜉、紅斑似動(dòng)蜉、叉似動(dòng)蜉、宜興似動(dòng)蜉),高翔蜉屬(擬高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉),贊蜉屬(桶形贊蜉),扁蚴蜉屬(皮氏扁蚴蜉),擬亞非蜉屬(尤氏擬亞非蜉);4)小蜉科:小蜉屬(天目山銳利蜉),鋸形蜉屬(景洪鋸形蜉),大鰓蜉屬(膨鋏大鰓蜉、大莖大鰓蜉);5)越南蜉科:越南蜉屬(大別山越南蜉、中華越南蜉、慶元越南蜉);6)等蜉科:等蜉屬(江西等蜉);7)蜉蝣科:蜉蝣屬(絹蜉、洪江蜉、長(zhǎng)莖蜉、黑翅蜉);8)細(xì)蜉科:細(xì)蜉屬(黑點(diǎn)細(xì)蜉、中華細(xì)蜉);寬基蜉屬(粗鋏寬基蜉);9)新蜉科:小河蜉屬(埃氏小河蜉);10)古絲蜉科:古絲蜉屬(中國(guó)古絲蜉);11)河花蜉科:河花蜉屬(廣西河花蜉、長(zhǎng)脛河花蜉)。其中,小刺四節(jié)蜉、黑脈假二翅蜉、紫假二翅蜉、紅背扁蜉、叉似動(dòng)蜉、擬高翔蜉、皮氏扁蚴蜉、天目山銳利蜉、洪江蜉、長(zhǎng)莖蜉、大庸高翔蜉、大莖大鰓蜉、黑翅蜉等13種蜉蝣是研究首次采集稚蟲(chóng),國(guó)內(nèi)未曾報(bào)道,有待后期補(bǔ)充相應(yīng)的稚蟲(chóng)特征描述。

2.2 蜉蝣COI基因序列遺傳距離

利用FY-J-1751和FY-N-2329通用引物PCR擴(kuò)增并測(cè)序,共獲得187條COI基因序列。剪去引物端序列,序列最終長(zhǎng)度為600 bp,序列變異位點(diǎn)238個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)230個(gè)。蜉蝣種內(nèi)和種間遺傳距離,去除大別山越南蜉和中華越南蜉蝣種間遺傳距離為1.1%,小于10%外,其余種間遺傳距離最小值為10.9%(長(zhǎng)脛河花蜉和廣西河花蜉之間),最大值為29.1%(紅背扁蜉和紫眼黑四節(jié)蜉之間)。紫眼黑四節(jié)蜉的種內(nèi)遺傳分歧為9.8%,紅柱四節(jié)蜉種內(nèi)為11.0%,逸仙麗翅蜉種內(nèi)為12.0%,其余種內(nèi)的遺傳距離平均值在0%～5.6%,其中,宜興寬基蜉、黑扁蜉、斜紋似動(dòng)蜉、斜紋似動(dòng)蜉、紅斑似動(dòng)蜉、叉似動(dòng)蜉、宜興似動(dòng)蜉、擬高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉、尤氏擬亞非蜉、桶形贊蜉、景洪鋸形蜉、大莖大鰓蜉、天目山銳利蜉、大別山越南蜉、江西等蜉、洪江蜉、長(zhǎng)莖蜉、中華細(xì)蜉、長(zhǎng)脛河花蜉、廣西河花蜉的種內(nèi)遺傳分歧較小,為0%～3%;膨鋏大鰓蜉、紅背扁蜉、面寬基蜉的種內(nèi)遺傳分歧較大,為3.5%～5.6%。

2.3 蜉蝣基于COI基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

如圖1所示,在NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中,除逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節(jié)蜉和紅柱四節(jié)蜉之外的所有物種均為單系群,其中,中華越南蜉和大別山越南蜉具為一支系后再與慶元越南蜉形成姐妹群關(guān)系,而逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節(jié)蜉和紅柱四節(jié)蜉并不是單系性。逸仙麗翅蜉存在3個(gè)支系,紫眼黑四節(jié)蜉存在2個(gè)支系,紫眼黑四節(jié)蜉存在3個(gè)支系,表明3種蜉蝣存在隱種,其中,逸仙麗翅蜉存在2個(gè)隱存種,紫眼黑四節(jié)蜉存在1個(gè)隱有種,紅柱四節(jié)蜉存在2個(gè)隱存種。

圖1 基于600 bp 序列的COI DNA barcoding的蜉蝣鄰接法(NJ)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

3.1 形態(tài)鑒定與分子數(shù)據(jù)結(jié)合分析鑒定物種的可靠性

在DNA barcoding分子數(shù)據(jù)上,除大別山越南蜉和中華越南蜉種間遺傳距離為3.5%外,種間遺傳距離為10.9%～29.1%。除逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節(jié)蜉和紅柱四節(jié)蜉外,其余物種內(nèi)的遺傳距離平均值一般在0%～5.6%。2003年,HEBERT等[27]利用COI基因序列分析遺傳距離時(shí),認(rèn)為種內(nèi)遺傳距離一般不大于2%,但也存在一些大于2%的現(xiàn)象,同時(shí)發(fā)現(xiàn)同屬種間的遺傳距離是該屬種內(nèi)遺傳距離的10倍左右。紫眼黑四節(jié)蜉種內(nèi)遺傳分歧為9.8%,紅柱四節(jié)蜉種內(nèi)為11.0%,逸仙麗翅蜉種內(nèi)為12.0%,3種蜉蝣物種的種內(nèi)遺傳分歧極其接近或大于常規(guī)COI基因分歧度的10%,可以推測(cè)存在隱種[42-47]。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),紫眼黑四節(jié)蜉、逸仙麗翅蜉和紅柱四節(jié)蜉并不是單系群,進(jìn)一步證實(shí)其存在隱種?；贒NA barcoding的分析重新對(duì)這3個(gè)種類的蜉蝣進(jìn)行形態(tài)鑒定,發(fā)現(xiàn)原先被鑒定成逸仙麗翅蜉的蜉蝣中,存在2個(gè)隱存種;被鑒定成紅柱四節(jié)蜉的蜉蝣中存在2個(gè)隱存種;而原先被鑒定成紫眼黑四節(jié)蜉的蜉蝣中,存在個(gè)1隱存種。該5個(gè)隱存種有待從形態(tài)特征進(jìn)行新種描述。大別山越南蜉和中華越南蜉的遺傳分歧為1.1%,小于種間的10%標(biāo)準(zhǔn)[27],結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和對(duì)形態(tài)特征的重新鑒定后認(rèn)為大別山越南蜉和中華越南蜉為同一物種,考慮大別山越南蜉的命名遲于中華越南蜉,按照命名法則命名優(yōu)先權(quán),認(rèn)為大別山越南蜉為中華越南蜉的同物異名。綜上所述,確定浙江各地采集到的蜉蝣共13個(gè)科,24個(gè)屬,46種(包括44個(gè)已報(bào)道種、2個(gè)物種為同物異名種)。另外,其中5個(gè)物種存在隱種(有待發(fā)表)。

3.2 實(shí)際采集物種與浙江省已知物種存在差距的原因

在本研究中,通過(guò)采集浙江省各縣市的蜉蝣,結(jié)合分子與形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn),44種浙江省已報(bào)道種,其中,5種隱存種,同物異名1種,有18種浙江省已報(bào)道中未采集到稚蟲(chóng)樣本,針對(duì)文獻(xiàn)已報(bào)道浙江省蜉蝣物種為62種[17],而本研究?jī)H采集到46種,有16種已知物種未采集到,可能原因包括以下幾點(diǎn):一是由于標(biāo)本采集時(shí)間和采集點(diǎn)限制導(dǎo)致采集物種不全;二是浙江省已報(bào)道蜉蝣種多數(shù)報(bào)道于2001年前,距今時(shí)間間隔較久,環(huán)境污染可能引起某些蜉蝣物種生境改變,導(dǎo)致該種蜉蝣的存在范圍縮小,導(dǎo)致在原采集地難以采集;三是某些已報(bào)道蜉蝣種類的生存環(huán)境為水深較深的河流或湖泊底部,而本研究中的蜉蝣采集,由于安全、資金、器械、時(shí)間等因素的限制,未到較大河流和湖泊采集,因此可能導(dǎo)致蜉蝣種類不全;四是采集工作主要針對(duì)稚蟲(chóng)采集未考慮用燈誘法采集,而燈誘法可以誘捕到飛翔能力強(qiáng)、活動(dòng)范圍廣的成蟲(chóng),浙江省已報(bào)道的蜉蝣種類更多是成蟲(chóng)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)了5種隱存種,后期需要加大采集樣點(diǎn),并采用燈誘法,利用不同采集時(shí)間對(duì)同一樣地進(jìn)行持續(xù)采集,以便采集到更多的蜉蝣物種。另外,發(fā)現(xiàn)浙江省蜉蝣昆蟲(chóng)資源較廣,有待深入對(duì)浙江省蜉蝣資源進(jìn)行調(diào)查研究,為后期開(kāi)展浙江省各地水質(zhì)監(jiān)控研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采自浙江省44種蜉蝣稚蟲(chóng)的187條COI基因序列測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,44種蜉蝣目昆蟲(chóng)的種間、種內(nèi)遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果說(shuō)明,采用COI基因序列的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)Σ煌尿蒡瞿恐上x(chóng)昆蟲(chóng)進(jìn)行有效分類,能夠發(fā)現(xiàn)隱種,與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相互佐證,在水生昆蟲(chóng)尤其是蜉蝣目昆蟲(chóng)多樣性調(diào)查研究和水質(zhì)監(jiān)測(cè)中可發(fā)揮重要作用。