響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果渣花青素的提取工藝

戴文娜,粱好,趙丹丹,蘇超

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 蕪湖市生命健康工程技術(shù)研究中心,安徽 蕪湖 241003;2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,安徽 蕪湖 241007)

桑葚又可稱為桑果,在我國種植的桑葚種類主要為黑桑、白桑、魯桑以及廣東桑等種類[1]。桑葚的營養(yǎng)價值豐富,其中不僅含有大量人體的必需氨基酸還存在大量的功能性成分,如黃酮、白藜蘆醇和花青素[2-3]。特別是花青素,其主要的生理作用為抗氧化、消炎以及保護(hù)視神經(jīng)[4]。花青素的提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法以及低共熔溶劑提取法[5-7],而超聲輔助提取法因?yàn)榉椒ê唵?、提取成本低且提取率高受到廣泛的應(yīng)用。因此,越來越多的研究者致力于該提取方法的工藝優(yōu)化。如陳俊樸[8]利用超聲輔助法提取紫大薯中的花青素,通過響應(yīng)面對條件進(jìn)行優(yōu)化后,最終花青素提取量達(dá)93.62 mg/100g;李玲[9]運(yùn)用超聲輔助法提取火龍果果皮中的花青素,提取量為159.14 mg/100g。本試驗(yàn)以桑葚果渣為原材料,運(yùn)用超聲輔助提取法,分別探究了料液比、超聲時間、乙醇濃度和超聲溫度4個因素對提取率的影響,通過響應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝,為提高桑葚果渣中花青素的提取率提供數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮桑葚,購買于京東平臺;矢車菊3-O-葡萄糖苷,標(biāo)準(zhǔn)品;無水乙醇、碳酸氫二鈉、檸檬酸(分析純)購買于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9240A,上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);超聲波清洗機(jī)(型號:KQ3200DB,昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(型號:HZK-FA110S,華志電子科技有限公司);TD4臺式低速離心機(jī)(湖南凱達(dá)儀器有限公司);紫外分光光度計(型號:UU759CRT,上海佑科儀器儀表有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 桑葚果渣預(yù)處理

取新鮮的桑葚在研缽內(nèi)進(jìn)行研磨,用紗布將汁水充分?jǐn)D出,隨后將桑葚置于50℃的烘箱中充分干燥,干燥結(jié)束后研磨成粉,過0.18 mm的篩網(wǎng),裝入密封袋,放在4℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取工藝流程

桑葚果渣粉→加入乙醇→超聲波提取→離心(4000 r/min,15 min)→提取液稀釋(稀釋20倍)→樣品測定(最大吸收波長520 nm[10])

2.3 桑葚果渣花青素的測定

2.3.1 矢車菊 3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品,用緩沖液溶解并定容至50 mL容量瓶中,即獲得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)矢車菊 3-O-葡萄糖苷母液。分別取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)矢車菊3-O-葡萄糖苷母液,加入10 mL緩沖液稀釋。用緩沖液作空白對照,用分光光度計在520 nm的波長處測量吸光度,以吸光度作為縱坐標(biāo),色素濃度作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。花青素在濃度為0.02～0.1 mg/mL時,回歸方程為y=15.809x+0.0086,R2=0.9992,線性關(guān)系良好。

2.3.2 花青素得率的計算

式中: Y為花青素得率,% ;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的花青素質(zhì)量濃度,mg /mL;V為上清液體積,mL;N 為提取液稀釋倍數(shù);m為桑葚果渣質(zhì)量,g。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對花青素提取率的影響 稱取桑葚果渣1 g,分別加入5、10、15、20、25 mL濃度為60%的乙醇溶液,在60℃下超聲30 min。以4000 r/min 離心 15 min,取1 mL上清液用緩沖液定容至20 mL,在520 nm測定待測樣的吸光值。

2.4.2 超聲時間對花青素提取率的影響 稱取桑葚果渣1 g,加入濃度為60%的乙醇溶液15 mL,在60℃下分別超聲10、20、30、40、50 min。其余步驟同2.5.1。

2.4.3 乙醇濃度對花青素提取率的影響 稱取桑葚果渣1 g,分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液15 mL,在60℃下分別超聲30 min。其余步驟同2.5.1。

2.4.4 超聲溫度對花青素提取率的影響 稱取桑葚果渣1 g,加入濃度為60%的乙醇溶液15 mL,分別在40、50、60、70、80℃下超聲30 min。其余步驟同2.5.1。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn),對花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定3次,運(yùn)用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖,運(yùn)用Design-Expert V.8.0.6處理和分析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對桑葚果渣中花青素提取率的影響 由圖1可知,隨著料液比的不斷上升,花青素的提取率并不是一直增加,而是呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15時,花青素的提取率達(dá)到最大值0.507±0.013%。其原因主要為:當(dāng)乙醇用量逐漸增多時,提高了桑葚果肉細(xì)胞壁里花青素的內(nèi)外濃度差,因此對花青素的溶出起到促進(jìn)的作用。當(dāng)花青素溶出量達(dá)到最大值時,雖然乙醇用量仍然在增加,但是提取率并不會因此增加;并且因?yàn)槿軇┯昧吭龆?對花青素有一定稀釋作用,反而會出現(xiàn)花青素提取率下降的情況[11]。

圖1 料液比對花青素提取率的影響 圖2 超聲時間對花青素提取率的影響

3.2 超聲時間對桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖2所示,當(dāng)超聲時間在30 min內(nèi),隨著超聲時間的增加,花青素的提取效率也在提高,并且超聲時間為30 min時,果渣中花青素的提取率達(dá)到最大值0.509±0.016%。但是,超聲時間繼續(xù)增加,花青素的提取率反而在下降。這是由于超聲波本身攜帶能量,超聲時間過長會破壞花青素的結(jié)構(gòu),從而造成部分花青素分解。因此,桑葚果渣中花青素提取最適宜的超聲時長為30 min。

3.3 乙醇濃度對桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖3所示,不同的乙醇濃度對花青素的提取率有較大的影響。當(dāng)乙醇濃度小于60%時,提取率隨著濃度的增加而提高。雖然適量的水進(jìn)入桑葚細(xì)胞中可以促進(jìn)有效成分的提取,但是過多的自由水同樣會導(dǎo)致更多雜質(zhì)的溶解,這些雜質(zhì)會影響花青素的提取,這是低濃度乙醇環(huán)境下花青素提取率不高的主要原因。而當(dāng)乙醇濃度大于60%時,提取率反而與濃度呈反比關(guān)系,這是由于過高的乙醇濃度會破壞花青素結(jié)構(gòu),降低了花青素的提取率。綜上所述,桑葚果渣中花青素提取最佳的乙醇濃度為60%,最大提取率可達(dá)0.537±0.013%。

圖3 乙醇濃度對花青素提取率的影響 圖4 超聲溫度對花青素提取率的影響

3.4 超聲溫度對桑葚果渣中花青素提取率的影響

如圖4所示,隨著超聲溫度逐漸上升,桑葚果渣中花青素提取率先增加后減少。當(dāng)超聲溫度為60℃時,提取率最大為0.519±0.014%。溫度升高可以促進(jìn)花青素的溶解,但是溫度過高會破壞花青素的結(jié)構(gòu)造成提取率下降,因此提取的最適溫度為60℃。

4 響應(yīng)面結(jié)果分析

4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

依據(jù)4個單因素結(jié)果,以料液比、超聲時間、乙醇濃度和超聲溫度為自變量,以花青素的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行四水平三因素的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果表

運(yùn)用Design-Expert對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析,回歸方程的方差結(jié)果如表3所示,且回歸方程為:

Y(提取率)=0.55+6.417×10-3A+5.917×10-3B+0.04C-0.016D-8.5×10-3AB+0.021AC- 0.012AD-7.75×10-3BC-0.014BD+0.017CD-0.054A2-0.069B2-0.069C2-9.517×10-3D2

4.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線圖是可以更加形象地反映出各因素之間的交互作用對花青素提取率的影響,下面對通過回歸方差分析出的交互作用影響顯著的自變量進(jìn)行響應(yīng)面分析。圖5(a)和圖5(b)分別表示料液比與乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖,響應(yīng)面圖為一個開口朝下且光滑的曲面,說明在本次試驗(yàn)的提取條件下可以得出花青素提取率的最大值。等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明料液比和乙醇濃度的交互作用較顯著。同時,根據(jù)圖5(a)可以發(fā)現(xiàn),自變量C方向上的曲線坡度明顯要比自變量A方向上的更陡,這說明乙醇濃度對提取率的影響要大于料液比對提取率的影響。

圖5 料液比與乙醇濃度的響應(yīng)面和等高線圖

圖6(a)和圖6(b)分別表示超聲溫度與乙醇濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖。由圖可知,當(dāng)超聲溫度和乙醇濃度不斷上升,花青素的提取率不斷提高,當(dāng)達(dá)到最大值后,雖然超聲溫度以及乙醇濃度仍然在增加,但是提取率在降低。圖6(b)的等高線呈橢圓性,說明超聲溫度與乙醇濃度的交互作用是顯著的。此外,圖6(a)可以發(fā)現(xiàn),自變量C方向上的曲線坡度明顯要比自變量D方向上的更陡,這說明乙醇濃度對提取率影響要大于超聲溫度對提取率影響,與4.1中的分析結(jié)果一致。

圖6 超聲溫度與乙醇濃度的響應(yīng)面和等高線圖

通過Box-Behnken試驗(yàn)得出的結(jié)果和回歸方程,可以得到超聲輔助提取桑葚果渣中花青素的最佳工藝條件為:料液比1∶15.93,超聲時間31.06 min,乙醇濃度62.09%,超聲溫度51.51℃,在該條件下預(yù)測的花青素提取率為0.563%?？紤]到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性,將最佳的工藝條件修正為:料液比1∶15,超聲時間為30 min,乙醇濃度60%,超聲溫度50℃。在此提取條件下,通過3次重復(fù)試驗(yàn)得出最終花青素的提取率為0.542%,與預(yù)測值相接近,這表明此次優(yōu)化得出的花青素提取工藝條件是可行的。

5 結(jié)論

以桑葚果渣為提取原料、乙醇為提取劑,利用超聲輔助法提取原料中的花青素,分別探究了料液比、超聲時間、乙醇濃度和超聲溫度四個提取條件對提取率的影響,并且通過響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過實(shí)驗(yàn)和模型分析可以得出:4個提取條件對花青素提取率的影響大小順序?yàn)橐掖紳舛?超聲溫度>料液比>超聲時間;結(jié)合實(shí)際得出最佳提取工藝為料液比1∶15,超聲時間30 min,乙醇濃度60%,超聲溫度50℃,在該條件下花青素的實(shí)際提取率為0.542%,與預(yù)測值0.563%相接近,且與吳春燕等[12]在黑米花青素提取的研究結(jié)論基本一致,說明此提取工藝具有可操作性。