大鼠自由落體創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型的建立

楊家發(fā) 朱義通 陸兆豐△ 王亞瓊 陸若玉 李海榮 劉夢佳

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院(河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)開元院區(qū)急診科 洛陽 471003 ;2)上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院上海 200001

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是死亡和殘疾的主要原因之一,是一個(gè)國際公共衛(wèi)生問題[1]。為了深入了解腦外傷的機(jī)理,研究人員已經(jīng)建立了一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,如大鼠自由落體(weight-drop)引起的腦外傷,模擬人類閉合損傷。Western blot分析顯示,與對(duì)照大鼠相比,所有炎癥表達(dá)標(biāo)志物在撞擊后第1天和第7天均有所增加。神經(jīng)功能障礙的嚴(yán)重程度和炎癥標(biāo)志物的誘導(dǎo)與分級(jí)的機(jī)械沖擊水平密切相關(guān)。自由落體誘導(dǎo)的創(chuàng)傷性腦損傷模型可以產(chǎn)生分級(jí)腦損傷和誘發(fā)神經(jīng)行為缺陷,并可能與開發(fā)創(chuàng)傷性腦損傷的治療策略有轉(zhuǎn)化相關(guān)性[2]。TBI導(dǎo)致血腦屏障功能障礙,兩個(gè)關(guān)鍵生物過程的破壞引發(fā)血腦屏障功能障礙。第一個(gè)過程涉及由緊密連接(TJ)蛋白丟失表明的細(xì)胞旁運(yùn)輸增加,允許通常被限制的中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分子通過,加劇炎癥反應(yīng)。第二個(gè)過程是由于通過內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)胞吞作用的增加,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)通常被限制進(jìn)入大腦的大分子和血清蛋白(如白蛋白)[3]。血腦屏障的測量對(duì)研究血腦屏障功能障礙或破壞與腦障礙發(fā)病機(jī)制間的相互作用具有重要意義。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄑ芯垦X屏障的完整性。示蹤劑、血漿蛋白、緊密連接蛋白和成像模式可用于檢測血腦屏障的通透性[4]。本研究擬建立自由落體創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型,通過神經(jīng)行為學(xué)、病理形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、蛋白免疫學(xué)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型,以期為后續(xù)的顱腦損傷研究提供參考。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選擇40只4月齡無特定病原級(jí)雄性 Sprague Dawley 大鼠,購自普萊柯生物工程股份有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(豫)2016-0023。體質(zhì)量(320.17 ± 15.46) g (范圍:215.5～335.4 g)。飼養(yǎng)于 12 h /12 h 明暗交替環(huán)境,溫度保持在25 ℃,術(shù)前12 h禁食,6 h禁水[2]。

1.2主要試劑和儀器β-APP及GFAP免疫組化試劑盒購自美國Sigma公司,4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(蘇泰?50)購自法國維克有限公司,腦立體定向儀購自深圳瑞沃德醫(yī)療器械有限公司,環(huán)鉆購自江蘇塞德醫(yī)療器械有限公司,24G針管回縮式靜脈留置針購自山東威海銳捷醫(yī)用制品有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組和輕度、中度、重度創(chuàng)傷性腦損傷組,每組 10只。

1.3.2 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型[2]實(shí)驗(yàn)用蘇泰(50 mg/kg)腹腔注射后俯臥于腦立體定位儀上,頸部墊圓柱形海綿墊抬升頭部確保頂骨充分暴露。固定后額頂部剃毛、消毒、鋪巾。正中切開,剝離骨膜,暴露右頂骨。用環(huán)鉆在冠狀縫后1.5 mm、中線旁 2.5 mm處鉆一直徑7 mm骨窗,保持硬腦膜完整。將內(nèi)徑6 mm 4.5 g鋼棒分別從內(nèi)徑7 mm聚氯乙烯透明管高度50 cm、75 cm、100 cm自由下落,撞擊硬腦膜致右頂葉輕、中、重度腦挫裂傷。骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮。假手術(shù)組開窗后用骨蠟封閉,不施加打擊。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 采用改良神經(jīng)損傷評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)量表對(duì)各組大鼠在傷后第1、3、7 天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)損害程度評(píng)分。

1.3.4 HE染色及免疫組織化學(xué)染色 傷后24 h,腹腔注射蘇泰麻醉,纖維放大鏡下用24 G針管回縮式靜脈留置股靜脈穿刺。術(shù)后1h在麻醉狀態(tài)下暴露胸腔,剪開心包,在左心室剪開小口,插入灌流針并固定[2]。夾閉下腔動(dòng)靜脈及腹主動(dòng)脈,右心耳剪開小口,左心室灌注0.9%NaCL注射液,直至右心耳流出液清亮為止,以清除血中染料。緩慢灌注4%多聚甲醛,斷頭取腦迅速浸入10%甲醛150 mL固定1 h,石蠟包埋,5 μm 冠狀切片,作HE染色及免疫組化染色[2]。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)行為學(xué)改變輕、中、重度組大鼠傷后第 1、3、7 天 的 mNSS 評(píng)分均高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 1。

2.2腦組織病理學(xué)檢查大體標(biāo)本觀察:假手術(shù)組組織完整,切緣無損傷區(qū);隨著打擊重量或高度增加,損傷區(qū)水腫、出血、滲出明顯增加,腦疝逐漸加重。HE染色:假手術(shù)組的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均正常。隨損傷加重,損傷區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞及細(xì)胞骨架形態(tài)缺失,損傷區(qū)邊緣水腫逐漸加重(圖 1)。

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果假手術(shù)組大腦皮質(zhì)無明顯β-APP、GFAP表達(dá),其余各組均可見β-APP、GFAP在神經(jīng)元漿膜下和(或)軸突處積累,免疫組織化學(xué)染色呈棕染。隨致傷量的增加,其陽性染色體神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增加和表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)。損傷后24 h,輕度、中度、重度組大腦皮質(zhì)β-APP 和GFAP表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)[6](圖 2)。

圖1 創(chuàng)傷性腦損傷24 h后腦組織病理學(xué)(HE×400)A:假手術(shù)組;B:輕度組;C:中度組;D:重度組

圖2 創(chuàng)傷性腦損傷24 h后腦組織免疫組化染色 A～C 示β-APP染色,E～H示GFAP染色其中,A、E示假手術(shù)組,B、F示輕度組,C、G示中度組,D、H示重度組

表1 4組大鼠術(shù)后mNSS評(píng)分比較

3 討論

TBI是造成死亡、殘疾和精神健康障礙的主要原因之一。大多數(shù)TBI患者患有長期創(chuàng)傷后應(yīng)激、認(rèn)知功能障礙和殘疾。這種神經(jīng)病理進(jìn)展的潛在分子和細(xì)胞機(jī)制仍不清楚。動(dòng)物模型能反映不同類型的人類腦損傷。局灶性損傷是一種局域性損傷,在控制性皮層損傷、彈道穿透性腦損傷和Feeney自由落體損傷等動(dòng)物模型中均有所體現(xiàn)[5]。大鼠自由落體損傷模型模擬了人類創(chuàng)傷性腦損傷引起的彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)。TBI對(duì)腦實(shí)質(zhì)施加強(qiáng)大的旋轉(zhuǎn)力和平移力,導(dǎo)致DAI而引發(fā)腦細(xì)胞腫脹和神經(jīng)元死亡。TBI后,軸突退變是一個(gè)進(jìn)行性過程,開始于軸突運(yùn)輸中斷導(dǎo)致軸突腫脹,然后是次級(jí)軸突斷開和沃勒氏退變。軸突細(xì)胞骨架的這些修飾中斷了軸漿運(yùn)輸機(jī)制,導(dǎo)致運(yùn)輸產(chǎn)物逐漸聚集,從而產(chǎn)生軸突腫脹和神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)的改變[6-7]。重度自由體質(zhì)量下降模型的認(rèn)知功能障礙更為嚴(yán)重。與重度自由體質(zhì)量下降組相比,重度對(duì)照皮質(zhì)撞擊組的腦水腫、炎癥細(xì)胞因子改變和皮層神經(jīng)元凋亡更為明顯[8]。

在不同的TBI模型中,損傷嚴(yán)重程度的參數(shù)包括壓力峰值、持續(xù)時(shí)間等力學(xué)參數(shù),以及神經(jīng)系統(tǒng)改變(呼吸暫停、扶正反射時(shí)間、耳廓反射等)、體質(zhì)量減輕、顱內(nèi)壓增量等生理變化、組織學(xué)改變(梗死體積和神經(jīng)元喪失)、神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評(píng)分(NSS)和運(yùn)動(dòng)功能測試等行為變化[9]。mNSS包括感覺測試、運(yùn)動(dòng)測試、反射測試和束平衡測試,用于評(píng)估在運(yùn)動(dòng)、地面行走、感覺、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、反射和異常運(yùn)動(dòng)等方面的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等級(jí)[10],自由落體沖擊壓力的分級(jí)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分和平衡功能損傷嚴(yán)重程度的進(jìn)展。各種不同程度的沖擊力和加速度可產(chǎn)生不同程度的神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)損傷以及軸突炎癥和損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)正是應(yīng)用改良的Feeney自由落體損傷模型,模擬新型皮質(zhì)損傷及彌漫性軸索損傷,以探索建立穩(wěn)定可靠、簡便易行、可重復(fù)性的TBI動(dòng)物模型,為下一步臨床研究奠定基礎(chǔ)[12]。

尋找診斷和TBI分期的血液標(biāo)志物,評(píng)估TBI和生存時(shí)間間隔的免疫組化標(biāo)志物,一直引起人們極大的興趣。β-淀粉樣前體蛋白(Beta-amyloid precursor protein,β-APP)是一種跨膜糖蛋白,是神經(jīng)元細(xì)胞的正常成分。它經(jīng)過高爾基體的加工,沿軸突快速順行運(yùn)輸[13-14]。其功能包括細(xì)胞黏附、生長、神經(jīng)保護(hù)和損傷反應(yīng)(促進(jìn)軸突萌發(fā)、突觸發(fā)生、軸突生長)。是目前檢測外傷性軸突損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因?yàn)樗浅Ｃ舾?在創(chuàng)傷性腦損傷后2 h內(nèi)可識(shí)別陽性反應(yīng)。β-APP是致死性腦外傷外傷性軸突損傷的敏感標(biāo)記物。軸突損傷首先表現(xiàn)為在擴(kuò)張的軸突、腫脹和扭曲的軸突及軸突鱗莖中β-APP蛋白的積累,與其他研究一致。在存活2 h時(shí)觀察到軸突損傷為擴(kuò)張軸突,而在存活12～24 h后,受損軸突嚴(yán)重腫脹,類似軸突鱗莖。本實(shí)驗(yàn)證明,在死后檢查中,β-APP免疫反應(yīng)升高是DAI的標(biāo)志。在沒有肉眼可見的TBI情況下,β-APP的增加表明,即使是輕微的頭部損傷也可能導(dǎo)致神經(jīng)元水平的損傷,在常規(guī)的法醫(yī)解剖和組織病理學(xué)檢查中可能無法診斷[15-16]。Hortobagyi[17]和同事利用抗原檢索法證明,在顱腦損傷后35～60 min的創(chuàng)傷后生存中,β-APP免疫反應(yīng)可以檢測早期軸突損傷。

GFAP免疫反應(yīng)性表明創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度與GFAP免疫陽性之間存在相關(guān)性[18]。GFAP是一種存在于白質(zhì)和灰質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞骨架單絲蛋白。GFAP也存在于非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中,如無髓鞘的雪旺細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞、腸膠質(zhì)細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、肝臟和胰腺等星形細(xì)胞。GFAP作為一種來自鈣蛋白酶和半胱天冬酶的分解產(chǎn)物,特別是caspase-3、6和9[19]。GFAP是成人大腦中主要的支架蛋白,是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征蛋白。在發(fā)育過程中,GFAP由放射狀膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。這些雙極性細(xì)胞位于心室區(qū),具有神經(jīng)干細(xì)胞的功能。誘導(dǎo)表達(dá)GFAP或抗GFAP免疫標(biāo)記染色的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白,以及創(chuàng)傷后腦腫脹的結(jié)果。同樣,神經(jīng)元中的GFAP以前主要在亞急性和遲發(fā)性腦外傷中檢測到,在急性死亡仍有陽性表達(dá)。多項(xiàng)研究和某些神經(jīng)干細(xì)胞中GFAP表達(dá)模式為神經(jīng)元表達(dá)GFAP mRNA的能力提供了證據(jù)[20]。本實(shí)驗(yàn)中β-APP及GFAP免疫組化陽性表達(dá)在相關(guān)研究均有證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)傷后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分具有良好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,病理學(xué)大體觀察及HE染色模擬皮質(zhì)損傷及彌漫性軸索損傷,具有水腫性、出血性、壞死性等改變,為后續(xù)的臨床干預(yù)提供基礎(chǔ)。通過β-APP、GFAP免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),證明該損傷模型與同類實(shí)驗(yàn)有良好相關(guān)性,因此,該TBI動(dòng)物模型穩(wěn)定可靠、簡便易行,具有良好的可重復(fù)性。