兩種中藥制劑對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響

陶琳，王克強(qiáng)，王玫，梁軍，劉振興

（1.濟(jì)南市第二婦幼保健院1a:藥劑科，1b:器械科，山東濟(jì)南 271199；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院2a:藥劑科，2b:創(chuàng)傷骨科，山東濟(jì)南 271199）

骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的骨系統(tǒng)疾病之一，與骨折風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，并給患者帶來(lái)許多并發(fā)癥。隨著年齡的增長(zhǎng)，這種疾病的患病率越來(lái)越高，已成為老年人的嚴(yán)重問(wèn)題［1］。目前針對(duì)骨質(zhì)疏松的治療藥物主要為雙膦酸鹽類藥物、雌激素、維生素D 及鈣劑等，以抑制破骨細(xì)胞活性，減少骨破壞，并促進(jìn)骨形成［2］。但其副作用也隨之突顯，特別是雙膦酸鹽類藥物引起的骨痛、頜骨壞死、腎損害等［3］。中醫(yī)藥正逐步成為治療骨質(zhì)疏松癥的主要方向［4］。

補(bǔ)腎益精是中醫(yī)學(xué)中防治骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)重要原則［5］，右歸丸出自明代張景岳《景岳全書(shū)》新方八陣方，近年來(lái)在骨質(zhì)疏松的防治方面獲得深入研究［6，7］，可改善骨代謝及臨床癥狀，通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ 及AMPK/mTOR 等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善骨密度及骨代謝情況［8，9］。但右歸丸為溫補(bǔ)腎陽(yáng)之方，性偏燥熱。本院在右歸丸的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代人脾虛濕盛的體質(zhì)體征，添加參苓白術(shù)散中黨參、白術(shù)、薏苡仁等健脾利濕，炙龜板、紫河車、阿膠等益精填髓，取得良好臨床療效。本研究通過(guò)摘除卵巢大鼠建立骨質(zhì)疏松癥模型，探究補(bǔ)腎健脾、益精填髓方抗骨疏治療對(duì)大鼠骨代謝指標(biāo)、骨密度及生物力學(xué)參數(shù)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

48 只清潔級(jí)Wistar 大鼠，雌性，體重（200±50）g，4～5 個(gè)月齡，未曾交配。購(gòu)自江蘇省試驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)SCXK（蘇）2016-00012。按照隨機(jī)分組方法，48 只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)益組和右歸組，每組12 只。

1.2 藥物制備

補(bǔ)腎健脾益精填髓灌味劑（補(bǔ)益）：按大鼠每百克體重1 g 藥量計(jì)算。熟地0.252 g、山藥0.126 g、菟絲子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、當(dāng)歸0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g、紫河車0.126 g、阿膠0.126 g、黨參0.200 g、白術(shù)0.126 g、薏苡仁0.126 g、砂仁0.090 g（上述藥物均為顆粒劑，購(gòu)于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥房）；炙龜板0.128 g、鹿角膠0.126 g（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥房）打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 ml 水既得。

右歸丸灌味劑（右歸）：按大鼠每百克體重1 g藥量計(jì)算。熟地0.252 g、山藥0.126 g、菟絲子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、當(dāng)歸0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g（上述藥物均為顆粒劑，購(gòu)于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥房）；鹿角膠0.126 g（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥房）打碎、烊化，混合上述顆粒劑，加20 ml 水既得。

1.3 手術(shù)處理

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，消毒無(wú)菌下在腹部雙側(cè)切開(kāi)皮膚，假手術(shù)組動(dòng)物不切除兩側(cè)卵巢，僅將卵巢周圍的脂肪切除；其他動(dòng)物切除雙側(cè)卵巢。

1.4 藥物干預(yù)

術(shù)后2 周所有動(dòng)物每日上午灌胃1 次，連續(xù)灌胃12 周。補(bǔ)益組和右歸組按每只大鼠每日用藥量為成人用藥量的6.3 倍計(jì)算，大鼠胃容量為0.875 ml/100 g。假手術(shù)組、模型組以等量的0.9% 氯化鈉溶液灌胃。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 尿液標(biāo)志物檢測(cè)

最后1 次灌胃干預(yù)后，每只大鼠單獨(dú)關(guān)入收集籠內(nèi)，收集前24 h 尿液。檢測(cè)尿鈣（Ca）、尿磷（P）濃度，并用尿Cr 校正尿液濃縮或稀釋對(duì)結(jié)果的影響。

1.5.2 血液標(biāo)志物檢測(cè)

連續(xù)灌胃12 周后，靜脈麻醉狀態(tài)下剖腹，抽取主動(dòng)脈取血，3 000 r/min 離心15 min，取上清血漿，-20℃保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中堿性磷酸酶、鈣、磷、Ⅰ型前膠原氨基末端肽（PINP）、BMP-2 蛋白［10,11］。

1.5.3 骨密度檢測(cè)

連續(xù)灌胃12 周后，1% 戊巴比妥鈉麻醉，剝離股骨，PBS 溶液進(jìn)行清洗，放入無(wú)菌EP 管中，做好標(biāo)記冷藏保存。在室溫下平衡5 min，雙能線骨密度測(cè)定儀對(duì)股骨上端和全部股骨骨密度進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 生物力學(xué)檢測(cè)

采用小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）對(duì)股骨樣本進(jìn)行三點(diǎn)測(cè)試，將兩側(cè)支架間距調(diào)整為2.5 cm，固定股骨兩端，進(jìn)行扭轉(zhuǎn)剛度實(shí)驗(yàn)。同樣固定股骨后用載荷機(jī)頭對(duì)骨干中間以2 mm/min 的速度進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，并自動(dòng)記錄計(jì)算出最大位移、強(qiáng)度、剛度等［12］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，資料呈正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況

手術(shù)組大鼠切口愈合良好，未出現(xiàn)出血、感染。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間飲食、飲水正常，無(wú)死亡大鼠。模型組大鼠毛發(fā)干枯、怠惰思臥、身體蜷曲、肢冷。補(bǔ)益組及右歸組大鼠毛法光亮、精神佳。實(shí)驗(yàn)前各組間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。處死時(shí)，各組大鼠體重均顯著大于實(shí)驗(yàn)前（P＜0.05），其中假手術(shù)組、模型組、右歸組均顯著低于補(bǔ)益組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 四組動(dòng)物體重（g，±s，n=12）與比較Table 1 Comparison of animal body weight among four groups(g,±s,n=12)

指標(biāo)實(shí)驗(yàn)前處死時(shí)P 值假手術(shù)組258.3±16.8 364.6±14.5＜0.001模型組257.4±15.7 365.6±15.4＜0.001補(bǔ)益組258.8±11.9 415.7±15.3＜0.001右歸組256.1±15.7 379.3±14.2＜0.001 P 值0.992＜0.001

2.2 尿液標(biāo)志物檢測(cè)

尿液檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，模型組尿Ca/Cr、尿P/Cr顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。右歸組Ca/Cr、P/Cr 與假手術(shù)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。補(bǔ)益組Ca/Cr、P/Cr 顯著低于右歸組和假手術(shù)組（P＜0.05）。

表2 四組動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

表2 四組動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

指標(biāo)尿液檢測(cè)Ca/Cr P/Cr血液檢測(cè)s-Ca(mmol/L)s-P(mmol/L)ALP(U/L)PINP(pg/ml)BMP-2(pg/ml)假手術(shù)組模型組補(bǔ)益組右歸組P 值0.4±0.1 0.5±0.1 0.6±0.3 0.7±0.2 0.3±0.1 0.3±0.2 0.5±0.2 0.6±0.3 0.043＜0.001 2.4±0.1 76.4±6.1 128.6±10.4 238.9±18.6 15.8±0.2 2.4±0.2 76.4±5.2 193.4±9.2 186.5±20.3 10.5±0.1 2.4±0.3 76.2±6.5 110.4±9.8 235.9±18.6 15.7±0.3 2.3±0.2 77.4±5.6 128.9±8.5 207.6±21.1 13.2±0.4 0.577 0.931＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 血液標(biāo)志物檢測(cè)

血液檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，各組大鼠血Ca、P 濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組ALP 水平顯著高于其他組（P＜0.05）。右歸組、假手術(shù)組的ALP 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但補(bǔ)益組的ALP 水平顯著低于其他組（P＜0.05）。

除假手術(shù)組，其他組PINP、BMP-2 均有不同程度下降。模型組PINP、BMP-2 顯著低于其他各組（P＜0.05）。補(bǔ)益組PINP、BMP-2 濃度顯著高于右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 骨密度與生物力學(xué)檢測(cè)

骨密度與生物力學(xué)檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。模型組的骨密度、最大載荷、最大位移及剛度顯著低于其他組（P＜0.05）。補(bǔ)益組骨密度、最大載荷、最大位移顯著高于模型組、右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組、右歸組、補(bǔ)益組的剛度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 四組動(dòng)物骨密度與生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

表3 四組動(dòng)物骨密度與生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s，n=12）與比較Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

指標(biāo)骨密度(g/cm2)最大載荷(N)最大位移(mm)剛度(N/m)假手術(shù)組18.1±2.9 85.2±5.1 0.7±0.1 199.5±4.9模型組12.3±3.3 73.6±6.1 0.5±0.3 154.3±3.5補(bǔ)益組17.9±4.2 84.9±5.4 0.8±0.2 196.8±2.6右歸組15.1±3.2 75.3±6.1 0.6±0.1 195.6±4.2 P 值＜0.001＜0.001 0.003＜0.001

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”、“骨枯”的范疇。在中醫(yī)理論中腎虛是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因。《素問(wèn)·痿論》“腎主身之骨髓……骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，故大部分中藥治療骨質(zhì)疏松集中于補(bǔ)腎壯骨方劑，如李智奎等［13］應(yīng)用補(bǔ)腎活血方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，結(jié)果表明可降低CRP、TNF-α 及IL-6、10 的表達(dá)，同時(shí)抑制ALP、骨鈣蛋白、N 端骨鈣素，提高N 端骨鈣素水平，改善骨代謝平衡。現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)一些補(bǔ)腎壯骨中藥不僅能夠抑制破骨細(xì)胞活性，而且部分藥物中存在植物類雌激素——黃酮類化合物，發(fā)揮雌二醇作用。如淫羊藿［14］、芹菜素［15］、骨碎補(bǔ)等［16］。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)與骨代謝存在顯著相關(guān)性［17］，腸道菌群的代謝產(chǎn)物——短鏈脂肪酸（SCFAs）通過(guò)降低腸腔內(nèi)的pH 值，增加鈣在大鼠結(jié)腸段的吸收［18］。該研究印證了中醫(yī)理論中關(guān)于“脾主運(yùn)化”論述，“脾為后天之本”，主四肢肌肉。若脾胃虧虛，水谷精微化生不足，肌肉得不到水谷精微的充養(yǎng)，而腎失所藏，腎精不足，筋骨失養(yǎng)，則骨骼與肌肉協(xié)調(diào)性下降而骨痿不用［19］。本研究中右歸丸為基礎(chǔ)方藥，補(bǔ)腎壯骨，結(jié)合參苓白術(shù)散方義中的黨參、白術(shù)、薏苡仁等健脾，發(fā)揮調(diào)整腸道微生物環(huán)境的作用，最后添加大補(bǔ)精血的炙龜板、紫河車、阿膠等益精填髓，該方是中西醫(yī)理論結(jié)合的基礎(chǔ)組方，以脾腎兩臟虧虛為切入點(diǎn)，取得良好臨床效果。

研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，雖然各組大鼠血Ca、P 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但補(bǔ)益組Ca/Cr、P/Cr 顯著低于其他組（P＜0.05），而右歸組Ca/Cr、P/Cr 與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這可能與補(bǔ)益組中添加健脾中藥對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)有關(guān)［20］。進(jìn)一步研究顯示補(bǔ)益組大鼠PINP、BMP-2 水平顯著高于模型組、右歸組（P＜0.05），而與假手術(shù)組無(wú)顯著差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BMP-2 是參與調(diào)控骨形成過(guò)程中的重要途徑之一，其中BMP-2 誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)，是經(jīng)典BMPs/Smad通路的重要配體，不僅能誘導(dǎo)未分化的骨間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)趨化期、分化期、骨質(zhì)形成及重塑期4 個(gè)環(huán)節(jié)，而且在異位骨/軟骨形成過(guò)程中促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化［21］。葉大林等［22］將小鼠的BMP-2 基因敲除，發(fā)現(xiàn)其成骨細(xì)胞的功能以及骨骼發(fā)育均存在缺陷。本研究中補(bǔ)益組大鼠的BMP-2 水平顯著升高，提示補(bǔ)腎健脾、益精填髓法能夠顯著促進(jìn)BMP-2 蛋白的分泌，從而調(diào)控骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨的正常和修復(fù)。PINP 是原膠原聚合形成I 型膠原過(guò)程中，去除下來(lái)的羧基端附加肽段，反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力，為監(jiān)測(cè)成骨細(xì)胞活力和骨形成的重要指標(biāo)［23］。補(bǔ)益組PINP、BMP-2 水平的增加，可能是由于有效的中藥成分作為一種良性的刺激，使BMP-2 與細(xì)胞膜上的受體BMPRⅠ、Ⅱ結(jié)合成復(fù)合物，被自身磷酸化所激活后，將信息傳遞到細(xì)胞核，通過(guò)對(duì)相關(guān)物質(zhì)加以轉(zhuǎn)錄促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞活性［24］。

對(duì)各組大鼠骨密度和生物力學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果顯示，模型組的骨密度、最大載荷、最大位移及剛度顯著低于其他組別（P＜0.05），而補(bǔ)益組的骨密度、最大載荷、最大位移顯著高于右歸組（P＜0.05），與假手術(shù)組無(wú)顯著差異。這反映了補(bǔ)益組在改善骨代謝、防止礦物質(zhì)丟失方面的作用效果。柴爽等［25］研究補(bǔ)腎、健脾、活血方劑干預(yù)骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，亦發(fā)現(xiàn)其在改善大鼠骨密度方面能夠取得滿意的效果。

綜上所述，補(bǔ)腎健脾、益精填髓法具有對(duì)抗骨質(zhì)疏松的效果，且作用機(jī)制可能與其調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境，減少骨礦物質(zhì)丟失，上調(diào)骨組織中BMP-2 表達(dá)，增加成骨細(xì)胞活性有關(guān)。