CircYPEL2通過(guò)miR-498/MSMO1軸調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性

王 靜,易宣洪,汪 萍,黃曉智,熊 偉

(唐山市人民醫(yī)院,河北 唐山 063000)

宮頸癌是原發(fā)于子宮頸部位的女性惡性腫瘤,早期癥狀不明顯,導(dǎo)致多數(shù)患者因病情進(jìn)展到晚期才發(fā)現(xiàn),從而預(yù)后很差,該病是造成女性癌癥死亡的重要原因。放療是晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法之一,但放療過(guò)程中產(chǎn)生的放射線抵抗性可嚴(yán)重限制其療效,因此增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性是改善宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵[1-3]。環(huán)狀RNA表達(dá)失調(diào)是宮頸癌的主要發(fā)病機(jī)制之一[4],其中環(huán)狀RNA yippee樣2(circular RNA yippee-like 2,CircYPEL2)在宮頸癌組織中呈現(xiàn)顯著的高表達(dá),CircYPEL2的敲除可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲活力降低[5],因此CircYPEL2可稱為宮頸癌的潛在臨床治療靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生及進(jìn)展的機(jī)制之一是與包括miR-498在內(nèi)的微小RNA結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)[4,6],miR-498作為一種抗癌因子,在食管癌、胃癌、宮頸癌等多種癌組織中表達(dá)降低,預(yù)示患者預(yù)后不良,上調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌和宮頸癌細(xì)胞增殖[7-8],并增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[9]。甲基甾醇單加氧酶1(methyl sterol monooxygenase 1,MSMO1)是一種獨(dú)特的腫瘤生物標(biāo)志物,在食管癌、宮頸癌等各種癌癥的惡性進(jìn)展中起著重要作用,可顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[10],在宮頸鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中高表達(dá)并與其CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈顯著負(fù)相關(guān)[11],另外查詢Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)可知CircYPEL2與miR-498之間及miR-498與MSMO1之間有結(jié)合位點(diǎn),因此推測(cè)CircYPEL2可能通過(guò)miR-498/MSMO1軸調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究通過(guò)建立人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR,對(duì)此推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人宮頸癌細(xì)胞株C33A、MEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司;CCK-8試劑盒、兔源抗人β-actin一抗、Hoechst 33258染色染料溶液(ab228550)、兔源抗人Anti-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,caspase-3)一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、兔源抗人Anti-B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)一抗均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;野生型miR-498報(bào)告質(zhì)粒、CircYPEL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、突變型miR-498報(bào)告質(zhì)粒、野生型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒、突變型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒、miR-498 mimics、miR-498 mimics陰性對(duì)照、miR-498 inhibitor、miR-498 inhibitor陰性對(duì)照組、CircYPEL2 siRNA質(zhì)粒、CircYPEL2空載質(zhì)粒、miR-498及CircYPEL2、MSMO1、β-actin、U6引物購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;Trizol(總RNA提取試劑)、結(jié)晶紫染色液、脂質(zhì)體2000、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;FITC/PI雙染法Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物工程股份有限公司;兔抗人Anti-MSMO1抗體購(gòu)于上海士鋒生物科技有限公司;兔源抗人Anti-Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)抗體、兔源抗人Anti-細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclin D1,CCND1)抗體、兔源抗人Anti-增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

1.2 主要儀器

電子直線加速器購(gòu)于美國(guó)Varian公司,熒光定量PCR儀購(gòu)于濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司,轉(zhuǎn)印模塊、電泳系統(tǒng)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購(gòu)買(mǎi)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,生物光學(xué)顯微鏡購(gòu)于南京新睿之鴻光學(xué)儀器有限公司,研究級(jí)倒置熒光顯微鏡購(gòu)于廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞株C33A和其放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR中CircYPEL2、miR-498、MSMO1表達(dá)

人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞C33A-RR的建立:人宮頸癌細(xì)胞系C33A在39℃溫水浴中解凍后以MEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng),傳代后以電子直線加速器對(duì)其以6Gy射線進(jìn)行放射治療[12],24h后以新鮮MEM完全培養(yǎng)基洗去死亡細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)剩余細(xì)胞,然后重新放射治療后重復(fù)操作,如此培養(yǎng)細(xì)胞30d后即可獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR。

取傳代的C33A和C33A-RR細(xì)胞加入Trizol混勻后,按照其說(shuō)明書(shū)方法指導(dǎo)提出其中總RNA,然后測(cè)量其濃度后以一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得各基因Ct值,具體反應(yīng)體系的配制和反應(yīng)條件的設(shè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,以β-actin作為CircYPEL2、MSMO1的內(nèi)參,以U6作為miR-498的內(nèi)參,采用算法2-ΔΔCt分析各組基因Ct值得到其相對(duì)表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列Table 1 Sequences of gene’s primers

取傳代的C33A和C33A-RR細(xì)胞加入RIPA裂解液混勻,按照說(shuō)明書(shū)提出其中總蛋白后以BCA法測(cè)量其濃度,每種細(xì)胞取15μg總蛋白100℃變性后通過(guò)跑電泳進(jìn)行分離,然后以120V恒壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)使蛋白移至硝酸纖維素膜上,將MSMO1、β-actin蛋白自膜上裁下,孵育兔源抗人MSMO1、β-actin一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗,洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色各組蛋白條帶,攝取其圖像后以Image J軟件定量分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3.2 分組處理C33A-RR細(xì)胞后收集標(biāo)本

取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種在12孔板,無(wú)菌培養(yǎng)36h,再隨機(jī)分為對(duì)照組、放射組、放射+陰性對(duì)照組、放射+CircYPEL2敲低組、放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。對(duì)照組不做任何處理,放射組細(xì)胞以6Gy的射線進(jìn)行放射治療,放射+陰性對(duì)照組細(xì)胞以6Gy的射線進(jìn)行放射治療同時(shí)采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR-498 inhibitor陰性對(duì)照和空載質(zhì)粒,放射+CircYPEL2敲低組細(xì)胞以6Gy的射線進(jìn)行放射治療同時(shí)采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染CircYPEL2 siRNA質(zhì)粒,放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組細(xì)胞以6Gy的射線進(jìn)行放射治療同時(shí)采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染CircYPEL2 siRNA質(zhì)粒和miR-498 inhibitor,各組細(xì)胞都在放射治療及轉(zhuǎn)染24h后收集其細(xì)胞沉淀作為標(biāo)本備用。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞中CircYPEL2、miR-498、MSMO1表達(dá)

提取1.3.2中收集的各組細(xì)胞中總RNA和總蛋白后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)出各組C33A-RR細(xì)胞中miR-498與CircYPEL2相對(duì)表達(dá)、MSMO1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá),具體方法見(jiàn)1.3.1。

1.3.4 CCK-8和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞增殖

CCK-8法:取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種在96孔板中無(wú)菌培養(yǎng)36h后,以1.3.2的方法分組處理24h后,采用CCK-8試劑盒按照其說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)檢測(cè)各組細(xì)胞吸光值后算出各組細(xì)胞增殖率,公式為:細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

平板集落形成實(shí)驗(yàn):取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔50個(gè)的密度接種在24孔板中無(wú)菌培養(yǎng)36h后,以1.3.2中方法分組處理24h后,以新鮮MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3周后即發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞形成集落,漂洗、固定后采用結(jié)晶紫染色液按照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)染色,采用生物光學(xué)顯微鏡觀察著色后的各組細(xì)胞集落并攝取圖片,以Image J軟件分析定量各組細(xì)胞集落數(shù)目后計(jì)算集落生成率,公式為:集落生成率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)目/對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)目×100%。

1.3.5 Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色:取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種在12孔板中無(wú)菌培養(yǎng)36h后,以1.3.2中方法分組處理24h后,漂洗、固定后采用Hoechst 33258染色染料溶液按照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)染色,倒置熒光顯微鏡觀察著色后的各組細(xì)胞并攝取其圖片,以Image J軟件分析定量各組細(xì)胞總數(shù)目和凋亡細(xì)胞數(shù)目后算出凋亡細(xì)胞比例(正常細(xì)胞:圓潤(rùn)并呈微弱藍(lán)色;凋亡細(xì)胞:固縮破碎并呈明亮藍(lán)色)。公式為:凋亡細(xì)胞比例=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn):取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種在12孔板中無(wú)菌培養(yǎng)36h后,以1.3.2中方法分組處理24h后,收集各組細(xì)胞沉淀后清洗、計(jì)數(shù),每組取5×105個(gè)細(xì)胞采用FITC/PI雙染法Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)

提取1.3.2中收集的各組細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)出各組C33A-RR細(xì)胞中PCNA、CCND1、Bcl-2、Bax、caspase-3相對(duì)表達(dá),具體方法見(jiàn)1.3.1。

1.3.7 檢測(cè)C33A-RR細(xì)胞中CircYPEL2對(duì)miR-498及miR-498對(duì)MSMO1的靶向調(diào)控

取傳代的C33A-RR細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種在12孔板中無(wú)菌培養(yǎng)36h后,隨機(jī)分為miR-498突變+CircYPEL2空載組(轉(zhuǎn)染突變型miR-498報(bào)告質(zhì)粒+空載質(zhì)粒)、miR-498突變+CircYPEL2過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染突變型miR-498報(bào)告質(zhì)粒+CircYPEL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)、miR-498野生+CircYPEL2空載組(轉(zhuǎn)染野生型miR-498報(bào)告質(zhì)粒+空載質(zhì)粒)、miR-498野生+CircYPEL2過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染野生型miR-498報(bào)告質(zhì)粒+CircYPEL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)、MSMO1突變+miR-498 mimics陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染突變型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-498 mimics陰性對(duì)照)、MSMO1突變+miR-498 mimics組(轉(zhuǎn)染突變型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-498 mimics)、MSMO1野生+miR-498 mimics陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染野生型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-498 mimics陰性對(duì)照)、MSMO1野生+miR-498 mimics組(轉(zhuǎn)染野生型MSMO1 3’-UTR報(bào)告質(zhì)粒+miR-498 mimics),采用脂質(zhì)體2000按照說(shuō)明書(shū)分組轉(zhuǎn)染,24h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞雙熒光素酶相對(duì)活性值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CircYPEL2、miR-498、MSMO1在C33A及C33A-RR中的表達(dá)

與C33A細(xì)胞相比,C33A-RR細(xì)胞中CircYPEL2表達(dá)、MSMO1 mRNA與蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),miR-498表達(dá)降低(P<0.05),見(jiàn)表2、圖1。

圖1 免疫印跡檢測(cè)C33A及C33A-RR細(xì)胞 MSMO1表達(dá)Fig.1 Expressions of MSMO1 in C33A cells and C33A-RR cells by immunoblotting detection

表2 C33A細(xì)胞、C33A-RR細(xì)胞的miR-498與CircYPEL2、MSMO1 mRNA及MSMO1表達(dá)水平Table 2 Expression levels of miR-498,CircYPEL2 and MSMO1 mRNA in C33A cells and C33A-RR cells

2.2 各組C33A-RR細(xì)胞CircYPEL2與miR-498、MSMO1表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

各組的CircYPEL2、miR-498、MSMO1 mRNA、MSMO1蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,放射+CircYPEL2敲低組細(xì)胞CircYPEL2、MSMO1 mRNA與MSMO1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),miR-498表達(dá)升高(P<0.05);與放射組相比,放射+CircYPEL2敲低組細(xì)胞CircYPEL2、MSMO1 mRNA與MSMO1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),miR-498表達(dá)升高(P<0.05);與放射+CircYPEL2敲低組相比,放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組細(xì)胞的CircYPEL2表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),miR-498表達(dá)降低(P<0.05),MSMO1 mRNA與蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),見(jiàn)表3、圖2。

注:A.對(duì)照組;B.放射組;C.放射+陰性對(duì)照組;D.放射+CircYPEL2敲低組;E.放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。圖2 免疫印跡法檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞MSMO1表達(dá)Fig.2 Expression of MSMO1 in C33A-RR cells detected by immunoblotting method

表3 各組C33A-RR細(xì)胞miR-498、CircYPEL2、MSMO1 mRNA與MSMO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of miR-498,CircYPEL2,MSMO1 mRNA and it’s proteins in C33A-RR cells in the five groups

2.3 各組C33A-RR細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

各組細(xì)胞增殖率與集落生成率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,放射+CircYPEL2敲低組的細(xì)胞增殖率、集落生成率均降低(P<0.05);與放射組相比,放射+CircYPEL2敲低組的細(xì)胞增殖率、集落生成率均降低(P<0.05);與放射+CircYPEL2敲低組相比,放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組的細(xì)胞增殖率、集落生成率均升高(P<0.05),見(jiàn)表4、圖3。

注:A.對(duì)照組;B.放射組;C.放射+陰性對(duì)照組;D.放射+CircYPEL2敲低組;E.放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。圖3 結(jié)晶紫染色檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞集落生成Fig.3 C33A-RR cell colony formation in the five groups detected by crystal violet staining method

2.4 各組C33A-RR細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

各組凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,放射+CircYPEL2敲低組的凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05);與放射組相比,放射+CircYPEL2敲低組的凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05);與放射+CircYPEL2敲低組相比,放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組的凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05),見(jiàn)表5、圖4、圖5。

注:A.對(duì)照組;B.放射組;C.放射+陰性對(duì)照組;D.放射+CircYPEL2敲低組;E.放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。圖4 Hoechst 33258染色檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞凋亡Fig.4 C33A-RR cell apoptosis in the five groups detected by Hoechst 33258 staining method

注:A.對(duì)照組;B.放射組;C.放射+陰性對(duì)照組;D.放射+CircYPEL2敲低組;E.放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。圖5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞凋亡Fig.5 C33A-RR cell apoptosis in the five groups detected by flow cytometry

表5 各組C33A-RR凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞凋亡率比較Table 5 Comparison of proportion of apoptotic cells and apoptosis rate of C33A-RR cells among the five groups

2.5 各組C33A-RR細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

各組PCNA、CCND1、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,放射+CircYPEL2敲低組的細(xì)胞PCNA、CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與放射組相比,放射+CircYPEL2敲低組的細(xì)胞PCNA、CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與放射+CircYPEL2敲低組相比,放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組的細(xì)胞PCNA、CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05),Bax、caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖6。

注:A.對(duì)照組;B.放射組;C.放射+陰性對(duì)照組;D.放射+CircYPEL2敲低組;E.放射+CircYPEL2敲低+miR-498 inhibitor組。圖6 免疫印跡法檢測(cè)各組C33A-RR細(xì)胞PCNA、CCND1、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)Fig.6 Expressions of PCNA,CCND1,Bcl-2,Bax, and caspase-3 in C33A-RR cells in the five groups detected by immunoblotting method

表6 各組細(xì)胞PCNA、CCND1、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平Table 6 Relative expression levels of PCNA,CCND1,Bcl-2,Bax and caspase-3 proteins in the five groups

2.6 C33A-RR細(xì)胞中CircYPEL2對(duì)miR-498的靶向調(diào)節(jié)及miR-498對(duì)MSMO1的靶向調(diào)節(jié)

在Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到CircYPEL2和miR-498之間的結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖7。各組相對(duì)熒光素酶活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-498野生+CircYPEL2空載組比較,miR-498野生+CircYPEL2過(guò)表達(dá)組的相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05);miR-498突變+CircYPEL2空載組與miR-498突變+CircYPEL2過(guò)表達(dá)組之間的相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表7。

圖7 CircYPEL2和miR-498之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.7 Binding sites between CircYPEL2 and miR-498 found in the Starbase database

表7 各組C33A-RR細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值Table 7 Relative luciferase activity of C33A-RR cells in the five groups

在Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到miR-498和MSMO1之間的結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖8。各組相對(duì)熒光素酶活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MSMO1野生+miR-498 mimics陰性對(duì)照組比較,MSMO1野生+miR-498 mimics組的相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05);MSMO1突變+ miR-498 mimics陰性對(duì)照組與MSMO1突變+miR-498 mimics組之間相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表8。

圖8 miR-498和MSMO1之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.8 Binding sites between miR-498 and MSMO1 found in the Starbase database

表8 各組C33A-RR細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值Table 8 Relative luciferase activity of C33A-RR cells in the five groups

3 討論

3.1 構(gòu)建人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR

宮頸癌的主要病因是高危型HPV持續(xù)感染、多伴侶性行為及多次分娩等,放療作為其臨床標(biāo)準(zhǔn)治療手段之一可有效殺傷癌細(xì)胞,抑制宮頸癌病情進(jìn)展,但癌細(xì)胞放射敏感性會(huì)隨著放療次數(shù)增多而降低,極大影響了放療效果,因此探尋有效的放射敏感性增強(qiáng)方法在宮頸癌的臨床治療中意義重大[13-14]。本文以6Gy的射線誘導(dǎo)建立人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,放射組細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞增殖率、集落生成率均無(wú)明顯變化,表明以6Gy的射線對(duì)C33A-RR細(xì)胞進(jìn)行照射不影響其增殖及凋亡,提示人宮頸癌放射線抵抗細(xì)胞株C33A-RR建立成功。

3.2 敲低CircYPEL2表達(dá)可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性

有研究顯示環(huán)狀RNA是調(diào)控宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵因子[4,15],CircYPEL2作為具有明顯致癌活性的環(huán)形RNA在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,可作為宮頸癌臨床研究的潛在生物標(biāo)志物,敲除CircYPEL2可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5],本文研究結(jié)果顯示,CircYPEL2在C33A-RR細(xì)胞中表達(dá)相比C33A細(xì)胞明顯升高,表明CircYPEL2參與介導(dǎo)宮頸癌的放射線抵抗過(guò)程;與放射組相比,放射+CircYPEL2敲低組細(xì)胞CircYPEL2表達(dá)、細(xì)胞增殖率、集落生成率、PCNA、CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,凋亡細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、Bax及caspase-3蛋白表達(dá)升高,表明敲低CircYPEL2表達(dá)可增強(qiáng)放射敏感性,提高射線對(duì)宮頸癌的殺傷力,顯著抑制6Gy的射線照射的C33A-RR細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,揭示CircYPEL2是調(diào)控宮頸癌放射敏感性的重要靶點(diǎn),對(duì)其敲除是提高宮頸癌患者放療效果的潛在手段。

3.3 CircYPEL2調(diào)節(jié)miR-498/MSMO1軸對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的作用

有研究顯示,環(huán)狀RNA是通過(guò)海綿作用下調(diào)miR-654-3p、miR-498等介導(dǎo)癌癥的發(fā)生發(fā)展[4,6,16],其中miR-498在食管癌、宮頸癌等腫瘤組織中顯著低表達(dá),對(duì)其過(guò)表達(dá)可抑制食管癌進(jìn)展[17],并可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18],miR-498還可介導(dǎo)食管癌細(xì)胞放射線抵抗性的產(chǎn)生,增強(qiáng)其表達(dá)可促進(jìn)放射線殺傷食管癌細(xì)胞[9];MSMO1作為一種致癌基因在宮頸鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中表達(dá)明顯升高[11],可通過(guò)調(diào)控膽固醇生物合成促使胰腺癌細(xì)胞存活和化療敏感性減弱[19],敲除MSMO1可顯著降低三陰型乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性[20],查詢Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析可知CircYPEL2可能通過(guò)miR-498調(diào)控MSMO1表達(dá),因此推測(cè)CircYPEL2可能通過(guò)調(diào)控miR-498/MSMO1軸影響宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究結(jié)果顯示,MSMO1 mRNA與蛋白表達(dá)在C33A-RR細(xì)胞中相比C33A細(xì)胞明顯升高,但miR-498表達(dá)明顯降低,且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)CircYPEL2可靶向下調(diào)C33A-RR細(xì)胞miR-498表達(dá),而miR-498可靶向下調(diào)C33A-RR細(xì)胞MSMO1表達(dá),表明CircYPEL2可通過(guò)調(diào)控miR-498/MSMO1軸介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性;以CircYPEL2 siRNA質(zhì)粒和miR-498 inhibitor聯(lián)合干預(yù)6Gy射線處理的C33A-RR細(xì)胞,相比CircYPEL2 siRNA質(zhì)粒單獨(dú)處理,可升高細(xì)胞增殖率、集落生成率、PCNA及CCND1、Bcl-2蛋白表達(dá),降低細(xì)胞凋亡率、凋亡細(xì)胞比例、Bax及caspase-3蛋白表達(dá),表明下調(diào)miR-498可減弱CircYPEL2的敲低對(duì)宮頸癌放射敏感性的增強(qiáng)作用,拮抗其對(duì)6Gy射線照射的C33A-RR細(xì)胞的促凋亡和抗增殖作用,揭示敲低CircYPEL2增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞放射耐藥性是通過(guò)上調(diào)miR-498實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,CircYPEL2可通過(guò)靶向下調(diào)miR-498來(lái)抑制MSMO1表達(dá),進(jìn)而促使人宮頸癌細(xì)胞的放射抵抗性,敲低CircYPEL2可通過(guò)促進(jìn)miR-498表達(dá)而下調(diào)MSMO1,從而提高宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性,增強(qiáng)放射線對(duì)C33A-RR細(xì)胞的殺傷力,最終對(duì)其發(fā)揮抗增殖和促凋亡作用。本研究為闡釋宮頸癌放射敏感性的調(diào)控機(jī)制提供了新的科學(xué)資料,有利于宮頸癌放療效果的提高。