蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基14B對神經(jīng)母細胞瘤細胞有絲分裂進程的調(diào)控作用

簡肖肖，張萬鵬，常 艷，張學敏，李慧艷，胡懷斌

（1.國家生物醫(yī)學分析中心，北京 100850；2.國家兒童醫(yī)學中心，首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，兒科重大疾病研究教育部重點實驗室，兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點實驗室，北京市兒科研究所耳鼻咽喉頭頸外科研究室，北京 100045）

神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實體瘤，惡性程度高，預后差，占兒童惡性腫瘤的8%～10%，死亡數(shù)約為所有兒童因癌癥死亡人數(shù)的15%［1-2］。NB 最常見的發(fā)生部位是腎上腺，也可發(fā)生在頸、胸和腹部及盆腔神經(jīng)組織［3-4］。國際神經(jīng)母細胞瘤分期系統(tǒng)（International Neuroblastoma Staging System）將NB 分為1，2A/2B，3，4 和4S 期［5］，其中1 期惡性程度較低，4 期惡性程度最高，4S期特指1歲以內(nèi)的患兒。目前臨床上常用的治療方法包括放療、化療、手術(shù)切除和免疫治療等，然而治療效果并不理想，患者總生存率仍＜40%［6］。因此，深入研究NB 發(fā)生發(fā)展機制并尋找其治療新靶點具有重要意義。

細胞周期分為G1，S，G2和M 4 個分期，其中M期（有絲分裂期）又可分為前期、前中期、中期、后期和末期。細胞周期整個過程受到一系列分子的精確調(diào)控，其調(diào)控異?？赡芤鸺毎麩o限增殖，最終導致腫瘤等疾病發(fā)生［7-8］。據(jù)報道，多種細胞周期激酶如周期蛋白依賴性激酶、aurora 激酶和polo 樣激酶等，在惡性腫瘤中表達異?；虬l(fā)生突變［9-10］。目前靶向這些激酶的小分子抑制劑已在不同腫瘤的非臨床試驗或臨床治療中取得了良好效果［11-12］，但與其他很多小分子靶向藥物相似，目前這些激酶的小分子抑制劑僅對部分腫瘤患者有效。因此，繼續(xù)深入研究腫瘤細胞周期調(diào)控機制，不僅可揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律，還將為腫瘤診斷治療提供新的潛在靶標。

蛋白磷酸酶1 調(diào)節(jié)亞基14B（protein phosphatase 1 regulatory subunit 14B，PPP1R14B）是蛋白磷酸酶1的抑制蛋白。最近研究報道，PPP1R14B在多種成人腫瘤組織中高表達，其高表達患者生存率較低［13］。且已有報道，PPP1R14B 在細胞有絲分裂期發(fā)生磷酸化［14］，但具體功能尚不清楚。本研究觀察其在NB 細胞有絲分裂期發(fā)揮的作用，并初步探討其在NB中的表達水平及其與預后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人NB 細胞SK-N-BE（2）-M17和SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心；人胚腎細胞HEK293T，美國ATCC 細胞庫；均培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清，1%青-鏈霉素），于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁生長至70%～80%融合度時傳代。大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞（S101-02），北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX，美國Invitrogen公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基，美國Gibco公司；DMEM 培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗和胰酶，中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），依科賽生物科技有限公司；Prime-Script RT Master Mix，日本TaKaRa 公司；PowerUp SYBR Green Master Mix，美國Thermo Fisher 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，美國Promega 公司；兔抗人PPP1R14B 多克隆抗體（一抗），美國Proteintech公司；小鼠抗α 微管蛋白單克隆抗體（一抗），美國Sigma 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗），美國Jackson ImmunoResearch 公司。Mini-PROTEAN 型Western Blot 電泳儀，美國BIO-RAD公司；FORMA311 型細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher 公司；5424R 型低溫超速離心機和542R 型常溫超速離心機，德國Eppendorf 公司；UltraVIEW Vox型轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡，英國PerkinElmer公司；QuantStudio 5 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀，美國ABI公司。

1.2 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列設計及脂質(zhì)體介導的siRNA轉(zhuǎn)染

據(jù)PPP1R14B基因的cDNA序列（NM_138689.3）及siRNA 設計原則，設計針對PPP1R14B基因編碼區(qū)的2 條siRNA 序列，命名為PPP1R14BsiRNA#1和#2，同時設計對照siRNA，序列見表1。序列經(jīng)BLAST 同源性比對后由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

Tab.1 Sequences of small interfering RNA (siRNA)

取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SK-N-BE（2）-M17細胞接種于6 孔板。次日，細胞生長至融合度約40%時，按Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別轉(zhuǎn)染對照siRNA，PPP1R14BsiRNA#1和#2。轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)液換成原體積的1/2，所用siRNA終濃度為80 nmol·L-1，RNAiMAX稀釋250倍使用；按比例配制Opti-MEM和RNAiMAX，靜置5 min；再按比例配置Opti-MEM 和siRNA，混合均勻后靜置15 min；然后逐滴加入到6 孔板中，6 h后換為新的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 RT-qPCR 檢測SK-N-BE（2）-M17 細胞敲低PPP1R14B后PPP1R14B mRNA表達水平

SK-N-BE（2）-M17 細胞轉(zhuǎn)染siRNA 后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用Trizol 法提取總RNA，再利用Prime-Script RT Master Mix 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，體系為RNA 500 ng，5×PrimeScript RT Mix 2 μL，DEPC 水補充至10 μL。然后按PowerUp SYBR Green Master Mix試劑盒說明書對PPP1R14BmRNA 進 行RT-qPCR 檢 測。PPP1R14B引 物 在PrimerBank 網(wǎng)站（https：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）設計，序列為：GACGATGAGGGCCCAGTG（正向），TCCTCTTCCTGGCAGTCGTA（反向），由北京六合華大基因科技有限公司合成，PCR 產(chǎn)物為134 bp。GAPDH引物序列為CGAGATCCCTCCAAAATCAA（正向），TTCACACCCATGACGAACAT（反向）。PCR 體系為cDNA 0.5 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，雙蒸水3.5 μL，總體積為10 μL。實驗條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參對照，用2-ΔΔCt表示PPP1R14BmRNA相對表達水平。

1.4 Western 印跡法檢測SK-N-BE（2）-M17 細胞PPP1R14B敲低后PPP1R14B蛋白表達水平

SK-N-BE（2）-M17 細胞轉(zhuǎn)染siRNA 后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，用PBS 洗2 遍，加入M2 裂解液（蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑臨用前加入），4 ℃混懸裂解30 min；15 000×g，4 ℃離心15 min；收集裂解液上清，加入等體積2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，沸水煮樣。將樣品用13% SDS-PAGE 進行電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉1×TBST 將PVDF 膜室溫封閉1 h，棄封閉液，依次加入兔抗人PPP1R14B 多克隆抗體（1∶1000）和小鼠抗α 微管蛋白單克隆抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜。次日，用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入相應二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；再用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；取等量ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒中的A 和B 液混合均勻，涂抹在PVDF 膜上，用醫(yī)用X 射線膠片在暗室中進行顯影，條帶深度表示待測蛋白表達水平。

1.5 Time-lapse 活細胞成像技術(shù)動態(tài)監(jiān)測SK-NBE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂進程

將SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞接種于8 孔腔室中，按1.2 siRNA 轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染對照siRNA，PPP1R14BsiRNA #1 和#2；轉(zhuǎn)染6 h 后換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入細胞周期同步化藥物胸苷（終濃度為2.5 mmol·L-1），同步化24 h 后棄含胸苷的培養(yǎng)基，用預熱的生理鹽水洗細胞5 次。將細胞釋放到正常的DMEM 培養(yǎng)基中，6 h 后用轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡掃描各組細胞有絲分裂進程并采集圖像，共掃描16 h。掃描完成后用Volocity 軟件對各組細胞從有絲分裂期開始到染色體分離所經(jīng)歷的時間及前中期和中期時間進行統(tǒng)計分析。

1.6 慢病毒體系構(gòu)建PPP1R14B穩(wěn)定敲低細胞系

根據(jù)PPP1R14B基因cDNA序列（NM_138689.3）和短發(fā)夾RNA（short-hairpin RNA，shRNA）設計原則，由北京擎科生物科技有限公司合成對照shRNA和2 條不同的靶向PPP1R14B基因的shRNA 序列，命名為shPPP1R14B#1 和#2。用酶切克隆方法構(gòu)建含對照shRNA，shPPP1R14B#1 和#2 的慢病毒質(zhì)粒，shRNA序列與siRNA相同（表1）。

慢病毒包裝：取狀態(tài)良好的HEK293T 細胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中（每皿2.5×106細胞），當細胞密度約60%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。分別將6 μg 目的質(zhì)粒（分別含對照shRNA，shPPP1R14B#1或#2的目的質(zhì)粒），4.5 μg psPAX2和1.5 μg pCMV-VSVG 包裝質(zhì)粒，加到1 mL HBS 中混勻，然后加入67 μL CaCl2，混合均勻，靜置15 min；將混合液逐滴加入到HEK293T 細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染6 h 后換成新的DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h 后第1次收集病毒上清，換液后于72 h 再次收集病毒上清。將2 次收集的病毒上清混合，2000×g離心10 min，取上清用0.45 μm 微孔濾器過濾；濾液中加入病毒濃縮液4 ℃過夜，4000×g低溫離心30 min 后棄上清，將病毒沉淀用1 mL 冰PBS 重懸、分裝，獲得分別含對照shRNA，shPPP1R14B#1和#2的慢病毒，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

慢病毒感染SK-N-BE（2）-M17 細胞：將SK-NBE（2）-M17 細胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，當細胞密度約50%時，每皿加入300 μL PBS 病毒重懸液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后加入嘌呤霉素（終濃度2 mg·L-1）進行篩選，篩選5～7 d 后獲得穩(wěn)定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17 細胞。Western印跡法檢測PPP1R14B蛋白表達水平。

1.7 克隆形成實驗檢測穩(wěn)定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成數(shù)

將穩(wěn)定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17細胞及對照敲低細胞，以每孔800 細胞接種于6 孔板中，每3 d 換培養(yǎng)基1 次，連續(xù)培養(yǎng)14 d；最后棄培養(yǎng)基，PBS 洗1 次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗1次；結(jié)晶紫染色15 min，用水洗去多余的染色液，室溫晾干，拍照，計算每組細胞克隆形成數(shù)。

1.8 GEO 數(shù)據(jù)庫分析神經(jīng)母細胞瘤中PPP1R14B表達水平及其與預后的關(guān)系

從GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）（2021 年1 月）下載NB數(shù)據(jù)集GSE49711，分析在不同分期（1期、2期、3期、4期和4S期）NB中PPP1R14B表達水平及其與患者預后的相關(guān)性。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。兩組間比較采用t檢驗（符合正態(tài)分布）或秩和檢驗（不符合正態(tài)分布）方法分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA對SK-N-BE（2）-M17細胞PPP1R14B敲低效果

RT-qPCR（圖1A）和Western 印跡法（圖1B）結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對照siRNA 的SK-N-BE（2）-M17細胞相比，轉(zhuǎn)染PPP1R14BsiRNA#1 和#2 的SK-N-BE（2）-M17 細 胞PPP1R14B mRNA（P＜0.01）和蛋白表達水平均明顯降低，表明該2條siRNA序列均可有效敲低SK-N-BE（2）-M17 細胞中PPP1R14B表達。

Fig.1 Knockdown effect of PPP1R14B in SK-N-BE（2）-M17 cells transfected with PPP1R14B siRNA #1 and #2，respectively. A：PPP1R14B mRNA expression detected by RT-qPCR；B：PPP1R14B protein expression detected by Western blotting.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂期阻滯

在SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞中轉(zhuǎn)染PPP1R14BsiRNA #1 或#2 敲低PPP1R14B，轉(zhuǎn)染30 h 后加入胸苷，24 h 將細胞阻滯在G1/S 期，隨后將細胞釋放6 h 到G2期，最后采用Time-lapse 活細胞成像技術(shù)動態(tài)檢測各組細胞有絲分裂進程（圖2A）。結(jié)果如圖2B 所示，轉(zhuǎn)染對照siRNA 組SK-NBE（2）-M17 GFP-H2B細胞從核膜破裂到后期姐妹染色單體分離共持續(xù)45 min，而轉(zhuǎn)染siPPP1R14B#1組延長到60 min，siPPP1R14B#2組延長到65 min。統(tǒng)計分析結(jié)果（圖2C）顯示，與轉(zhuǎn)染對照siRNA 組相比，轉(zhuǎn)染PPP1R14BsiRNA#1 和#2 組細胞平均分離持續(xù)時間明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，敲低PPP1R14B 導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂期阻滯。

Fig.2 Effect of PPP1R14B knockdown by siRNA transfection on mitosis in SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells by time-lapse living cell imaging technique. A：the synchronization process of time-lapse；B：time-lapse images of SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells transfected with control siRNA，PPP1R14B siRNA #1 or PPP1R14B siRNA#2，and the numbers meant the time after nuclear envelope breakdown；C：the separation duration time.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂前中期時間延長

對SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞有絲分裂前中期和中期時間進行統(tǒng)計分析結(jié)果（圖3）顯示，與轉(zhuǎn)染對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染PPP1R14BsiRNA#1和#2 組細胞前中期時間明顯延長（P＜0.01），而中期時間縮短（P＜0.05），表明敲低PPP1R14B 使SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞有絲分裂前中期時間延長，從而導致細胞有絲分裂期阻滯。

Fig.3 Effect of PPP1R14B knockdown by siRNA transfection on mitotic time in SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells detected by time-lapse living cell imaging technique.See Fig.2A for the cell treatment.±s，n=60 cells.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.4 shRNA穩(wěn)定敲低PPP1R14B抑制SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成

Western 印跡法結(jié)果（圖4A）顯示，與轉(zhuǎn)染對照shRNA 組相比，轉(zhuǎn)染shPPP1R14B#1 或#2 組SK-N-BE（2）-M17 細胞PPP1R14B 蛋白表達水平明顯降低，表明靶向PPP1R14B 的該2 條shRNA均可有效敲低PPP1R14B 表達?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果（圖4B1 和B2）顯示，轉(zhuǎn)染shPPP1R14B#1 或#2組SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成數(shù)亦明顯少于轉(zhuǎn)染對照shRNA 組（P＜0.01），表明敲低PPP1R14B可抑制SK-N-BE（2）-M17細胞生長。

Fig.4 Effect of PPP1R14B knockdown by short-hairpin RNA（shRNA）transfection on cell growth in SK-NBE（2）-M17 cells. Lentiviruses containing control shRNA，shPPP1R14B#1 or #2 were transfected into SK-N-BE（2）-M17 cells，respectively. A：the knockdown efficiency of PPP1R14B detected by Western blotting；B1：number of cell colonies detected by colony formation test；B2 was the quantitative result of B1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control shRNA group.

2.5 PPP1R14B 表達水平與NB 惡性程度呈正相關(guān)，與預后呈負相關(guān)

通過分析NB 數(shù)據(jù)集GSE49711 發(fā)現(xiàn)，在1，2，3 和4 期NB 中PPP1R14B表達逐漸升高（圖5A），表明NB 惡性程度越高，PPP1R14B表達水平越高。生存期分析表明，PPP1R14B表達低的患者生存率明顯高于其表達高的患者（圖5B），表明PPP1R14B表達水平越高，NB 患者預后越差。由此表明，PPP1R14B表達水平與NB 惡性程度呈正相關(guān)，與患者預后呈負相關(guān)。

Fig.5 Expression of PPP1R14B in neuroblastoma（NB）and its relationship with prognosis by NB database GSE49711 analysis. A：differential expressions of PPP1R14B in different International Neuroblastoma Staging System（INSS）stages of NB. The stage 4S especially refers to patients under 1 year old.±s，n=121（stage 1），78（stage 2），63（stage 3），183（stage 4），53（stage 4S）. B：the relationship between PPP1R14B expression and survival probability of NB patients.n=125.

3 討論

本研究利用siRNA 技術(shù)在NB 細胞SK-N-BE（2）-M17 中敲低PPP1R14B，加入胸苷將細胞阻滯在G1/S 期，接著將細胞釋放到G2期，最后采用Time-lapse 活細胞成像技術(shù)動態(tài)監(jiān)測敲低PPP1R14B 對細胞有絲分裂進程的影響。結(jié)果表明，敲低PPP1R14B可導致SK-N-BE（2）-M17細胞有絲分裂期時間延長。為探究PPP1R14B 調(diào)控的有絲分裂期具體階段，本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低PPP1R14B 導致SK-N-BE（2）-M17 細胞有絲分裂前中期時間明顯延長，中期時間略有縮短。同時還發(fā)現(xiàn)，PPP1R14B 敲低組細胞的染色體不能整齊排列到中期赤道板上，從而導致姐妹染色單體錯誤分離。由此推測，很可能是敲低PPP1R14B 導致染色體在一定時間內(nèi)不能整齊排列到赤道板上（中期開始），而細胞又不能很長時間阻滯在前中期，因此姐妹染色單體被迫快速分離即中期時間縮短，最終導致染色體錯誤分離。

有絲分裂期各時相必須按一定規(guī)則進行，各時相時間或長或短均有可能引起有絲分裂期進程紊亂。已知有絲分裂期紊亂往往導致細胞增殖異常。本研究分別將靶向PPP1R14B 的shPPP1R14B#1或#2轉(zhuǎn)染SK-N-BE（2）-M17 細胞穩(wěn)定敲低PPP1R14B?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，穩(wěn)定敲低PPP1R14B 明顯抑制SK-N-BE（2）-M17 細胞克隆形成，提示PPP1R14B 在NB 細胞增殖過程發(fā)揮重要作用。

據(jù)報道，PPP1R14B 在細胞有絲分裂期發(fā)生磷酸化［14］。本研究通過NB數(shù)據(jù)集GSE49711分析發(fā)現(xiàn)，PPP1R14B表達水平與NB 惡性程度呈正相關(guān)，與患者預后呈負相關(guān)。因此推測，PPP1R14B 可能通過調(diào)控細胞周期參與NB發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 細胞有絲分裂期阻滯和生長減慢，PPP1R14B在NB 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PPP1R14B 是NB 細胞有絲分裂的新調(diào)控子，有可能是NB 治療的潛在新靶標。PPP1R14B 是否通過發(fā)生磷酸化來調(diào)控NB 有絲分裂期、哪種激酶使其發(fā)生磷酸化及PPP1R14B 調(diào)控NB 細胞有絲分裂期進程的具體分子機制尚待進一步探索。