miR-21-5p靶向JAK/STAT信號(hào)通路抑制Th1細(xì)胞極化

李 露，李 雪，孟廣雨，劉元林，王 洋，吳楚姍，許婷婷，白海濤，袁福臨，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，天津 300052；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

精確而嚴(yán)格的免疫調(diào)控是機(jī)體抵御病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等病原體感染的重要保障。免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子是免疫調(diào)控的主要執(zhí)行者，在維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。T 淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，據(jù)其表面標(biāo)志物主要分為CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞，其中CD4+T 淋巴細(xì)胞又稱(chēng)為輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，Th），可產(chǎn)生豐富的細(xì)胞因子。初始（na?ve）CD4+T 細(xì)胞又稱(chēng)Th0 細(xì)胞，是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞。據(jù)所處的微環(huán)境，包括細(xì)胞因子信號(hào)、共刺激信號(hào)、炎癥環(huán)境及T細(xì)胞受體與抗原相互作用的強(qiáng)度，Th0 細(xì)胞可進(jìn)一步分化為多種效應(yīng)亞群，包括Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、濾泡Th細(xì)胞和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等［1-2］。

Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路是調(diào)控Th0 細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)通路，多種Th細(xì)胞亞群和免疫反應(yīng)類(lèi)型均受其調(diào)控，其中Th1 細(xì)胞是行使免疫監(jiān)視、保障機(jī)體免疫環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要參與者，Th1 細(xì)胞極化亦受JAK/STAT 信號(hào)通路影響?，F(xiàn)有研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞攝取抗原并分泌產(chǎn)生的白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）可激活STAT4 介導(dǎo)的JAK/STAT 信號(hào)通路，活化的STAT4 促進(jìn)Th1細(xì)胞極化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T 盒21 轉(zhuǎn)錄因子（T-box 21 transcription factor，T-bet）表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞極化的關(guān)鍵細(xì)胞因子干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）產(chǎn)生。與此同時(shí)，由自然殺傷細(xì)胞或極化的Th1 細(xì)胞分泌的IFN-γ，通過(guò)其受體介導(dǎo)JAK/STAT 信號(hào)通路活化，活化STAT1并誘導(dǎo)T-bet表達(dá)，進(jìn)一步正反饋促進(jìn)Th1細(xì)胞極化［3-4］。據(jù)此，在Th1細(xì)胞極化調(diào)控過(guò)程中，IL-12等Th1細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子可激活JAK/STAT 信號(hào)通路，誘發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)IFN-γ 大量產(chǎn)生，最終決定Th1 細(xì)胞極化的命運(yùn)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)需要促炎因子與抑炎因子協(xié)同調(diào)節(jié)，異常活化的Th1 細(xì)胞可靶向自身抗原肽，誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致諸如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴(lài)型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥和橋本甲狀腺炎等［5-6］。因此，維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及適度的Th1 細(xì)胞極化對(duì)防治自身免疫性疾病具有重要臨床意義。

物種間高度保守的微RNA（microRNA，miRNA）可通過(guò)特異性結(jié)合靶標(biāo)mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR），誘導(dǎo)mRNA 降解并抑制mRNA 進(jìn)一步翻譯為蛋白質(zhì)，在翻譯水平抑制靶基因表達(dá)［7］。miRNA 是長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，其序列長(zhǎng)度使其靶向調(diào)控具有多樣性，可通過(guò)多靶標(biāo)mRNA 調(diào)控形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和應(yīng)激等重要生理進(jìn)程［8-9］。本研究室基于前期對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miRNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其外泌體內(nèi)富含高豐度的miR-21-5p。為探究miR-21-5p 是否參與間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控，本研究通過(guò)體外誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化，研究miR-21-5p 對(duì)Th1細(xì)胞極化的抑制作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

6 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6N 小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)IACUC-DWZX-2021-704。人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞），軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、胰酶、PBS 和非必需氨基酸，美國(guó)Gibco公司；胎牛血清，德國(guó)PAN Seratech 公司；小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒，天津?yàn)笊锟萍加邢薰?；小鼠初始CD4+T 細(xì)胞分選試劑盒，德國(guó)Miltenyi Biotec 公司；抗小鼠CD3ε，CD28 和IL-4 單克隆抗體、重組小鼠IL-2 和IL-12 及PE-抗小鼠CD4和APC-抗小鼠IFN-γ流式用抗體，美國(guó)Tonbo Biosciences 公司；Triton X-100、Tween-20、Trizol 試劑和β 巰基乙醇，美國(guó)Sigma 公司；甲醛水溶液，國(guó)藥集團(tuán)有限公司；小鼠抗小鼠磷酸化STAT4（phosphorylated STAT4，p-STAT4）單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗小鼠STAT4，STAT1 和p-STAT1 單克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗小鼠GAPDH 單克隆抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）、HRP-山羊抗兔IgG 抗體（二抗）、5×SDS-PAGE 上樣緩沖液、Ultra SYBR 混合物和BCA 蛋白定量試劑盒，康為世紀(jì)有限公司；ECL 發(fā)光液，百賽生物有限公司；Oligo dT、dNTP、Random、DTT、RNA酶抑制劑、5×RNA 酶M-MLV 緩沖液和RNA 酶M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，日本TaKaRa 公司；JetPRIME 和JetPRIME 緩沖液，法國(guó)Polyplus 公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega 公司；DEPC 水、miR-21-5p 模擬物（mimic）和模擬物對(duì)照核酸序列（表1）及實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）引物（表2），上海生工生物有限公司。CKX53SF-R 型倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司。

Tab.1 Sequences of microRNA（miRNA）

Tab.2 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞提取

安樂(lè)法處死6 周齡C57BL/6N 小鼠，無(wú)菌條件下取脾制備單細(xì)胞懸液，450×g離心10 min，棄上清，用小鼠淋巴細(xì)胞稀釋液重懸后加入淋巴細(xì)胞分離液，450×g離心30 min，收集中間層細(xì)胞獲得脾單個(gè)核細(xì)胞。

1.3 小鼠初始CD4+T細(xì)胞免疫磁珠分選

按小鼠初始CD4+T 細(xì)胞分選試劑盒操作。在分離的小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞中加入生物素標(biāo)記的Miltenyi 雞尾酒抗體，于4 ℃孵育5 min，加入抗生物素單克隆抗體耦聯(lián)磁珠和抗CD44單克隆抗體耦聯(lián)磁珠繼續(xù)孵育10 min，轉(zhuǎn)移至離心管中用磁珠分離緩沖液洗滌1 次。將細(xì)胞通過(guò)磁場(chǎng)，經(jīng)磁性分離柱吸附后洗脫獲得初始CD4+T細(xì)胞。

1.4 誘導(dǎo)初始CD4+ T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化及miR-21-5p模擬物轉(zhuǎn)染

24 孔板預(yù)先以抗小鼠CD3ε 單抗（2 mg·L-1）4 ℃包被過(guò)夜，將新鮮分離的初始CD4+T 細(xì)胞（每孔5×105細(xì)胞）接種入24 孔板，加入Th1 極化誘導(dǎo)劑（抗小鼠CD28 單抗0.5 mg·L-1、抗小鼠IL-4 單抗1 mg·L-1、重組小鼠IL-2 5 μg·L-1、重組小鼠IL-12 10 μg·L-1、1%非必需氨基酸和β巰基乙醇55 μmol·L-1），用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

miR-21-5p模擬物或模擬物對(duì)照2.5 nmol分別溶解于DEPC水125 μL，配制終濃度為20 μmol·L-1溶液。分別取3.33 μL 溶解于100 μL JetPRIME 緩沖液中，加入JetPRIME 2.6 μL于室溫靜置15 min，待組裝成脂質(zhì)體復(fù)合物后轉(zhuǎn)染至加入Th1 極化誘導(dǎo)劑的初始CD4+T 細(xì)胞。誘導(dǎo)72 h 后分別收取Th1誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)+模擬物對(duì)照組和誘導(dǎo)+miR-21-5p模擬物組細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1細(xì)胞極化百分比

取1.4 收取的細(xì)胞，加入PE-抗小鼠CD4 流式抗體，4 ℃避光孵育30 min；PBS 洗滌后加入4%中性甲醛固定10 min，用500 μL含0.1% Triton X-100的PBS 破膜7 min；用500 μL含0.1% Tween-20的PBS洗滌后，加入APC-抗小鼠IFN-γ流式抗體4 ℃避光孵育30 min。洗滌后用PBS重懸，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IFN-γ+細(xì)胞百分比，即Th1細(xì)胞極化百分比。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1和T-bet mRNA表達(dá)水平

取1.4收取的細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR 檢測(cè)IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1和T-betmRNA水平。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，PCR上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Ultra SYBR 混合物10 μL 和DEPC水8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。GAPDH作為內(nèi)參基因，待測(cè)基因mRNA 表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

1.7 Western 印跡法檢測(cè)STAT4，p-STAT4，STAT1和p-STAT1蛋白表達(dá)水平

取1.4 收取的細(xì)胞，加80 μL細(xì)胞裂解液于搖床冰浴震蕩裂解細(xì)胞30 min，12 000×g離心25 min收集上清。經(jīng)BCA 蛋白定量后，加入含有β 巰基乙醇的5×SDS-PAGE 上樣緩沖液煮沸。取20 μg 蛋白樣品電泳，經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與抗STAT4，p-STAT4，STAT1，p-STAT1 和GAPDH 抗體（稀釋比1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入HRP-山羊抗小鼠IgG或HRP-山羊抗兔IgG抗體（稀釋比1∶30 000），室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，測(cè)定蛋白條帶積分吸光度值。待測(cè)蛋白表達(dá)水平用待測(cè)蛋白條帶與GAPDH 條帶積分吸光度比值表示。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及miR-21-5p 模擬物對(duì)STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1表達(dá)調(diào)控作用驗(yàn)證

經(jīng)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)IL-12Rβ1，IFN-γ和STAT1的3′-UTR 可能存在miR-21-5p的作用靶標(biāo)序列，利用psiCHECK2 分別構(gòu)建各靶標(biāo)序列的雙熒光素酶報(bào)告載體，即將正常3′-UTR 序列（wild type，WT）和靶序列結(jié)合位點(diǎn)突變（mutant，MT）的3′-UTR 序列分別插入到psiCHECK2 載體攜帶的人源化海腎熒光素酶（human codon optimized-Renilla luciferase，hRluc）的3′-UTR 區(qū)域，構(gòu)建hRluc的報(bào)告基因表達(dá)載體psi-WT 和psi-MT。psiCHECK2含有hluc+作為內(nèi)參報(bào)告基因。

轉(zhuǎn)染前1 d 將HeLa 細(xì)胞（每孔2×104細(xì)胞）接種于96 孔板，待細(xì)胞密度匯合至60%～80%時(shí)，將psi-WT 和psi-MT 載體分別與miR-21-5p 模擬物或模擬物對(duì)照共轉(zhuǎn)染至HeLa 細(xì)胞中。取20 ng 載體和0.2 μL miR-21-5p 模擬物或模擬物對(duì)照溶解于15 μL JetPRIME 緩沖液中，加入JetPRIME 0.5 μL混勻后于室溫靜置15 min，待形成脂質(zhì)體復(fù)合物后加入HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)體系。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)36 h，收取并裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。取細(xì)胞裂解上清20 μL，加入Luciferase Assay底物20 μL，經(jīng)Tecan 酶標(biāo)儀檢測(cè)內(nèi)參hluc+產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度；再加入Stop&Glo 底物20 μL，用Tecan酶標(biāo)儀檢測(cè)靶標(biāo)序列的hRluc產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度。hRluc與hluc+熒光信號(hào)強(qiáng)度比值表示熒光素酶活性，反映miR-21-5p 模擬物或模擬物對(duì)照對(duì)靶序列的調(diào)控作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，經(jīng)SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p抑制Th1細(xì)胞極化

對(duì)小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行免疫磁珠陰性分選（圖1A），獲得的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)為高表達(dá)CD62L 的CD4+T 細(xì)胞（圖1B），符合初始CD4+T細(xì)胞特征。向初始CD4+T 細(xì)胞中加入Th1 極化誘導(dǎo)劑，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21-5p 模擬物或模擬物對(duì)照，72 h 后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IFN-γ+雙陽(yáng)細(xì)胞百分比。結(jié)果（圖1C）表明，Th1誘導(dǎo)組細(xì)胞極化百分比為（76.3±0.6）%；誘導(dǎo)+模擬物對(duì)照組為（76.9±2.1）%，與Th1 誘導(dǎo)組比較無(wú)明顯變化；誘導(dǎo)+miR-21-5p 模擬物組為（68.1±2.2）%，與Th1 誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)+模擬物對(duì)照組比較均明顯降低（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，在誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化體系內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物可顯著抑制Th1細(xì)胞極化。

Fig.1 miR-21-5p mimic blocked Th1 cell polarization. A：strategy of murine na?ve CD4+ T cells isolation；B：characterization of the purified na?ve CD4+ T cells examined by flow cytometry；C：the percentage of CD4+IFN-γ+ cells in Th1 cells induced from the na?ve CD4+ T cells and transfected miR-21-5p mimic or mimic control for 72 h measured by flow cytometry；C2：statistic results of C1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with Th1 induction group；##P＜0.01，compared with induction+mimic control group.

2.2 miR-21-5p抑制JAK/STAT信號(hào)通路活化

圖2A 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21-5p 模擬物后，Th1 細(xì)胞極化所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet和關(guān)鍵細(xì)胞因子IFN-γmRNA 表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照顯著下降（P＜0.01）；同時(shí)，參與調(diào)控Th1 細(xì)胞極化的IL-12/STAT4/IFN-γ 途徑和IFN-γ/STAT1 途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT1（P＜0.01）和STAT4（P＜0.05）及受體IL-12Rβ1（P＜0.05）mRNA 表達(dá)水平亦顯著降低。誘導(dǎo)+模擬物對(duì)照組上述細(xì)胞因子mRNA水平與Th1誘導(dǎo)組比較均無(wú)明顯變化。

Fig.2 miR-21-5p inhibited activation of JAK/STAT signaling pathway in Th1 cells. See Fig.1C for the cell treatment. A：the mRNA expression levels of IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1 and T-bet measured by RT-qPCR；B：the protein levels of STAT4，p-STAT4，STAT1 and p-STAT1 detected by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1. IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Th1 induction group；##P＜0.01，compared with induction+mimic control group.

圖2B 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21-5p 模擬物后，p-STAT1 和p-STAT4 蛋白表達(dá)水平顯著低于誘導(dǎo)+模擬物對(duì)照組（P＜0.01），STAT1和STAT4蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明miR-21-5p 模擬物可抑制STAT1和STAT4蛋白磷酸化活化。

2.3 miR-21-5p調(diào)控Th1細(xì)胞極化通路的作用靶標(biāo)

經(jīng)生物信息學(xué)分析與預(yù)測(cè)，miR-21-5p 可能與Th1細(xì)胞極化所必需的JAK/STAT 信號(hào)通路的重要分子IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR 存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。利用psiCHECK2 雙熒光素酶報(bào)告載體，分別構(gòu)建含IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR WT序列（圖3A）及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的MT序列（圖3B）的克隆載體psi-WT 和psi-MT，并與miR-21-5p模擬物或模擬物對(duì)照同時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果（圖3C）顯示，轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物可顯著降低帶有IFN-γ（P＜0.01），IL-12Rβ1（P＜0.01）和STAT1（P＜0.05）WT 序列的報(bào)告基因熒光素酶活性，而含靶基因MT 序列的各報(bào)告基因熒光素酶活性不受影響；此外，轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照不影響含WT 和MT 序列的報(bào)告基因熒光素酶活性。由此表明，miR-21-5p模擬物可特異性靶向結(jié)合IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR 序列，調(diào)控STAT1，IL-12Rβ1和IFN-γ表達(dá)水平。

3 討論

Th 細(xì)胞在機(jī)體應(yīng)對(duì)感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它不僅能輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體、增強(qiáng)和維持CD8+T 細(xì)胞的殺傷作用、調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞以對(duì)抗致病微生物，還能調(diào)控免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。多種Th 細(xì)胞亞群參與機(jī)體的多重免疫調(diào)控反應(yīng)。Th1 細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，機(jī)體被感染時(shí)其細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IFN-γ可激活或刺激其他免疫細(xì)胞（如CD8+T 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、1 型固有淋巴細(xì)胞、1 型不變自然殺傷T 細(xì)胞（invariant natural killer T1 cells）和免疫球蛋白G3 B 細(xì)胞等）共同清除細(xì)胞內(nèi)微生物。Th2細(xì)胞介導(dǎo)對(duì)抗體外寄生蟲(chóng)感染，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。Th17細(xì)胞主要抵抗真菌和細(xì)胞外細(xì)菌入侵。濾泡輔助性T細(xì)胞協(xié)助B細(xì)胞增強(qiáng)體液免疫。誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和維持自身免疫耐受［10-11］。

JAK/STAT 通路是免疫系統(tǒng)活化的關(guān)鍵信號(hào)通路，多種細(xì)胞因子與受體結(jié)合可激活JAK 反式磷酸化，隨后募集并催化STAT 磷酸化，磷酸化的STAT形成二聚體入核啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而誘發(fā)不同細(xì)胞因子表達(dá)，決定Th0細(xì)胞的極化方向［12-13］。IL-12和IFN-γ可分別激活JAK2/酪氨酸激酶2/STAT4和JAK1（JAK2）/STAT1 通路，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet 表達(dá)，是決定Th1 細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵細(xì)胞因子［14］。

盡管Th 細(xì)胞的分化主要依賴(lài)于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的調(diào)控，但越來(lái)越多的研究表明，miRNA作為小分子化合物也可以調(diào)控Th 細(xì)胞分化，影響Th 細(xì)胞亞群平衡［15］。據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體來(lái)源的miR-148a-3p 通過(guò)抑制IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ 通路下調(diào)Th1 細(xì)胞極化，阻止1 型糖尿病進(jìn)展［16-17］。miR-210 通過(guò)與STAT6 靶向結(jié)合抑制Th2 分化，從而促進(jìn)銀屑病患者中Th17 和Th1 分化［18］。miR-140-5p 可靶向負(fù)調(diào)控STAT1 表達(dá)從而抑制Th1 細(xì)胞分化，影響多發(fā)性硬化癥的進(jìn)展［19］。最新研究顯示，miR-21-5p不僅可調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞的生成和平衡［7，20］，還具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞抗凋亡、增殖和遷移能力［21-22］，也是潛在的癌癥預(yù)測(cè)標(biāo)志物［23-24］。但關(guān)于miR-21-5p 調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞分化的分子機(jī)制知之甚少。本研究通過(guò)體外誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞極化的體系內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-21-5p 模擬物，可顯著降低Th1 細(xì)胞極化百分比，表明miR-21-5p 可抑制Th1 細(xì)胞極化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p 可下調(diào)Th1 細(xì)胞極化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT1，T-bet和STAT4、細(xì)胞因子IFN-γ及受體IL-12Rβ1mRNA表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)p-STAT1和p-STAT4 蛋白水平，表明miR-21-5p 可顯著抑制STAT4 和STAT1 磷酸化活化，進(jìn)而干擾IL-12/STAT4/IFN-γ通路和IFN-γ/STAT1通路活化，從而抑制Th1細(xì)胞極化。

為進(jìn)一步探究miR-21-5p抑制Th1細(xì)胞極化的分子靶標(biāo)，本研究對(duì)Th1 細(xì)胞極化必需的JAK/STAT 通路各組分進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p 與JAK/STAT 信號(hào)通路的關(guān)鍵分子STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1的3′-UTR 具有特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨后經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告體系證實(shí)，miR-21-5p 可通過(guò)靶向結(jié)合而調(diào)控STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1表達(dá)，干擾Th1 細(xì)胞極化所必需的JAK/STAT信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞極化。

綜上，miR-21-5p 可通過(guò)靶向下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路分子IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的表達(dá)水平及干擾Th1細(xì)胞極化的特征性細(xì)胞因子IFN-γ和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)，從而顯著抑制Th1 細(xì)胞極化。Th1 細(xì)胞極化調(diào)控是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控過(guò)程，多條信號(hào)通路和多種細(xì)胞因子共同參與。miR-21-5p 作為小分子化合物，在免疫穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中可能是重要的調(diào)控因子，可有效抑制Th1 細(xì)胞過(guò)度極化所致的免疫穩(wěn)態(tài)失衡，對(duì)治療Th1 細(xì)胞異常活化導(dǎo)致的多種自身免疫性疾病，如急性移植物抗宿主病、1 型糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等可能發(fā)揮重要作用，但其療效尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。